Högupplöst respirometri för att bedöma mitokondriell funktion hos humana spermier

Summary

Analys av spermiernas mitokondriella funktion med högupplöst respirometri gör det möjligt att mäta syreförbrukningen hos fritt rörliga spermier i ett system med sluten kammare. Tekniken kan användas för att mäta andning i mänskliga spermier, vilket ger information om spermiernas mitokondriella egenskaper och integritet.

Abstract

Spermakvaliteten studeras ofta genom rutinmässig spermaanalys, som är beskrivande och ofta ofullständig. Manlig infertilitet är förknippad med förändrad mitokondriell aktivitet hos spermier, så mätningen av spermiernas mitokondriella funktion är en indikator på spermiekvalitet. Högupplöst respirometri är en metod för att mäta syreförbrukningen hos celler eller vävnader i ett slutet kammarsystem. Denna teknik kan implementeras för att mäta andning i mänskliga spermier och ger information om kvaliteten och integriteten hos spermiernas mitokondrier. Högupplöst respirometri gör att cellerna kan röra sig fritt, vilket är en a priori-fördel när det gäller spermier. Denna teknik kan tillämpas med intakta eller permeabiliserade spermier och möjliggör studier av intakta spermiers mitokondriella funktion och aktiviteten hos enskilda andningskedjekomplex. Det högupplösta oxigrafinstrumentet använder sensorer för att mäta syrekoncentrationen i kombination med känslig programvara för att beräkna syreförbrukningen. Uppgifterna används för att beräkna andningsindex baserat på syreförbrukningskvoterna. Följaktligen är indexen proportionerna av två syreförbrukningshastigheter och är internt normaliserade till cellantalet eller proteinmassan. De respiratoriska indexen är en indikator på spermiernas mitokondriella funktion och dysfunktion.

Introduction

Manlig infertilitet beräknas stå för 40-50 % av alla fall av infertilitet hos par¹. Konventionell spermaanalys spelar en avgörande roll för att bestämma manlig fertilitet; Cirka 15 % av infertila män har dock normala spermieparametrar². Dessutom ger rutinmässig spermaanalys begränsad information om spermiernas funktion och återspeglar inte subtila spermiedefekter³.

Spermiernas mitokondrier har en speciell struktur, eftersom de är ordnade som ett spiralformat hölje runt flagellen. Mitokondrierskidan innehåller ett varierande antal mitokondrier som är förbundna med intermitokondriella länkar och förankrade i cytoskelettet genom ordnade proteinarrangemang på det yttre mitokondriemembranet ^4,5. Denna struktur gör det särskilt svårt att isolera spermiernas mitokondrier. Därför använder de flesta studier av spermiers mitokondriella funktion in situ-analyser eller demembranerade spermier⁶.

Spermiernas mitokondriella struktur och funktion har konsekvent kopplats till manlig infertilitet 7,8,9,10,11^, vilket tyder på att analys av strukturen och funktionen hos dessa organeller kan vara en bra kandidat för att ingå i spermieanalys.

Mitokondrier spelar en viktig roll i cellulär energimetabolism, särskilt genom att använda syre för att producera adenosintrifosfat (ATP) genom oxidativ fosforylering (OXPHOS). I synnerhet när det gäller spermier är källan till ATP (glykolys vs. OXPHOS) omtvistad, och mycket av data är fortfarande kontroversiella och beror på olika experimentella metoder 4,12,13. Mätningar av andning med oximetri ger betydande insikter om cellens mitokondriella andningskapacitet, mitokondriella integritet och energimetabolism^14,15,16. Traditionellt har denna teknik utförts med hjälp av Clarks syrgaselektrod – ett instrument som har använts för att mäta mitokondriell andning i mer än 50 år^17,18. Dessutom har spermiernas mitokondriella syreförbrukning analyserats med hjälp av den klassiska Clark-syrgaselektroden 19,20,21. Högupplöst respirometri (HRR) med hjälp av oxigrafer (Oroboros) ger högre känslighet än användning av klassiska respirometriapparater²². Oxigraferna består av två kammare med injektionsportar, och varje kammare har en polarografisk syresensor. Med denna teknik är det möjligt att analysera vävnadsglas, celler och isolerade mitokondriella suspensioner. Provet rörs kontinuerligt om i kammaren, och under experimentet mäts syreförbrukningen och syrehastigheterna beräknas med hjälp av specifik programvara. Kamrarna visar minskat syreläckage, vilket är en fördel jämfört med de konventionella syrgaselektroderna^14,23.

Liksom för andra celler är känsligheten hos HRR-utrustning högre när det gäller spermier än för konventionell respirometri, vilket innebär att HRR-utrustning kan användas för analys av ett begränsat antal intakta eller permeabiliserade spermier. Det finns två huvudstrategier för att bedöma spermiernas mitokondriella funktion med HRR: (a) mätning av syreförbrukningen i intakta celler, vilket innebär att reproducera andningsfunktionen i ett medium som innehåller substrat såsom glukos, eller (b) mätning av syreförbrukningen i permeabiliserade celler med hjälp av ett av OXPHOS-komplexen, med tillägg av specifika substrat för att övervaka varje funktion separat.

I den aktuella studien beskriver vi användningen av HRR för att bestämma mitokondriell andning i humana spermier.

Protocol

Experimenten godkändes av den etiska kommittén vid Facultad de Medicina de la Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. Figur 1: Arbetsflöde för högupplöst respirometri för att bedöma mitokondriell funktion i intakta och permeabiliserade mänskliga spermier. Protokollet delades in i fyra olika steg: 1) be…

Representative Results

Bestämning av den optimala koncentrationen av digitonin i spermierI detta protokoll presenterar vi användningen av HRR för att övervaka realtidsförändringar i OXPHOS i humana spermier. Eftersom metoden kan användas för att analysera intakta eller digitoninpermeabiliserade spermier, presenterar vi först den standardisering av digitoninkoncentrationen som krävs för att permeabilisera spermier (Figur 3). Digitonin används för kemisk …

Discussion

HRR är kritiskt beroende av flera steg: (a) underhållet av utrustningen, (b) noggrann kalibrering av syresensorerna, (c) titreringen av frånkopplaren²⁶, och slutligen, (d) adekvat användning av index som representerar mitokondriell funktion. Underhållet av utrustningen är avgörande. Det rekommenderas att byta ut membranen på den polarografiska syresensorn regelbundet och att korrigera den instrumentella bakgrunden. Omfattande tvättning efter insamling av spermier från kamrarna är avgör…

Materials

Acid free- Bovine serum albumine	Sigma Aldrich	A8806
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma Aldrich	A5285
Animycin A from streptomyces sp.	Sigma Aldrich	A8674
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C4901
carbonyl cyanide-P- trifluoromethoxy-phenylhydrazone	Sigma Aldrich	C2920
DatLab sofware version 4,2	Oroboros Instruments GmbH	N/A
D-glucose	Sigma Aldrich	G7021
Digitonin	Sigma Aldrich	D141
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
L glutamic acid	Sigma Aldrich	G1251
L malic acid	Sigma Aldrich	M1000
Magnesium sulphate	Sigma Aldrich	M7506
Microliter Syringes	Hamilton	87900 or 80400
Microscope camera	Basler	acA780-75gc
Microscope Eclipse E200 with phase contrast 10X Ph+	Nikon	N/A
Monopotassium phosphate	Sigma Aldrich	P5655
MOPS	Sigma Aldrich	M1254
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Oxygraph-2 K	Oroboros Instruments GmbH	N/A
Potassium chloride	Sigma Aldrich	P3911
Power O2k-Respirometer	Oroboros Intruments	10033-01
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875
Saccharose	Sigma Aldrich	S0389
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium lactate	Sigma Aldrich	L7022
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich	P2256
Sperm class analyzer 6.3.0.59 Evolution-SCA Research	Microptic	N/A
Sperm Counting Chamber DRM-600	Millennium Sciences CELL-VU	N/A
Succinate disodium salt	Sigma Aldrich	W327700