쥐 췌장의 생체 내 이미징을 위한 안정화된 창
Summary
우리는 쥐 췌장의 세포 내 해상도 이미징을 위한 안정화된 유치 광학 창의 외과적 이식을 위한 프로토콜을 제시하여 건강한 췌장과 병든 췌장에 대한 연속 및 종단 연구를 가능하게 합니다.
Abstract
췌장의 생리학과 병태생리학은 복잡합니다. 췌장염 및 췌장 선암(PDAC)과 같은 췌장 질환은 이환율과 사망률이 높습니다. 생체 내 영상(IVI)은 건강한 상태와 질병 상태 모두에서 조직의 고해상도 이미징을 가능하게 하는 강력한 기술로, 세포 역학을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 쥐 췌장의 IVI는 장기의 깊은 내장 및 순응적 특성으로 인해 손상과 움직임 인공물이 발생하기 쉽기 때문에 심각한 문제를 안고 있습니다.
여기에 설명된 것은 쥐 P안장(SWIP)의 Intravital 이미징을 위한 Stabilized Window의 이식 과정입니다. SWIP는 건강한 췌장에서 세룰레인에 의해 유발된 급성 췌장염으로 변하는 동안, 그리고 췌장 종양과 같은 악성 상태에서 쥐 췌장의 IVI를 허용합니다. SWIP는 유전적으로 표지된 세포 또는 형광 염료 투여와 함께 단일 세포 및 세포 내 역학(단일 세포 및 집단 이동 포함)을 측정할 수 있을 뿐만 아니라 여러 날에 걸쳐 동일한 관심 영역의 연속 이미징을 가능하게 합니다.
PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담이기 때문에 종양 세포 이동을 포착하는 능력이 특히 중요합니다. PDAC에서 전이의 생리학적 역학을 이해하는 것은 중요한 미충족 요구이며 환자 예후를 개선하는 데 매우 중요합니다. 전반적으로 SWIP는 향상된 영상 안정성을 제공하고 건강한 췌장 및 악성 췌장 질환에서 IVI의 적용을 확대합니다.
Introduction
양성 및 악성 췌장 질환은 잠재적으로 생명을 위협할 수 있으며, 병태생리학에 대한 이해에 상당한 격차가 있습니다. 췌장염(췌장 염증)은 미국에서 위장 질환 관련 입원 및 재입원의 세 번째 주요 원인이며 상당한 이환율, 사망률 및 사회경제적 부담과 관련이 있다1. 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인으로 꼽히는췌관 선암(PDAC)은 대부분의 췌관 악성 종양3을차지하며3 5년 생존율이 11%에 불과하다2. PDAC에서 암 관련 사망률의 주요 원인은 압도적인 전이성 부담입니다. 불행히도 대부분의 환자는 전이성 질환을 가지고 있습니다. 따라서 PDAC에서 전이의 역학을 이해하는 것은 암 연구 분야에서 중요한 미충족 요구입니다.
염증과 췌장의 전이성 연쇄 작용을 뒷받침하는 메커니즘은 잘 알려져 있지 않습니다. 이러한 지식 격차의 주요 원인은 생체 내에서 췌장 세포 역학을 관찰할 수 없다는 것입니다. 이러한 세포 역학을 직접 관찰하면 췌장 질환 환자의 진단 및 치료를 활용하고 개선할 수 있는 중요한 표적을 밝힐 수 있습니다.
생체 내 영상(IVI)은 연구원들이 살아있는 동물의 생물학적 과정을 실시간으로 시각화하고 연구할 수 있는 현미경 기술입니다. IVI는 생체 내 및 해당 생물학적 과정의 기본 환경 내에서 세포 내 및 미세환경 역학을 고해상도로 직접 시각화할 수 있습니다. 따라서 IVI는 건강한 과정과 병리학적 과정에 대한 생체 내 관찰을 허용한다.
MRI, PET, CT와 같은 현대의 전신 영상 기법은 전체 장기를 잘 볼 수 있으며 임상 증상이 나타나기 전에도 병리를 밝힐 수 있다4. 그러나 그들은 단일 세포 분해능을 얻거나 질병-췌장염 또는 악성 종양의 초기 단계를 밝힐 수 없습니다.
이전 연구에서는 단세포 분해능 IVI를 사용하여 피부 5,6, 유방7, 폐8, 간 9, 뇌10, 췌장 종양11의 양성 및 악성 질환을 관찰하여 질병 진행 기전을 규명했다12. 그러나 쥐 췌장은 IVI를 사용하여 단세포 분해능을 달성하는 데 상당한 장애물이 되는데, 이는 주로 깊은 내장 위치와 높은 순응도로 인해 발생합니다. 더욱이 장간막은 장간막 내에서 비장, 소장, 위와 연결되는 분지화되어 확산되어 분포된 기관으로 접근하기 어렵습니다. 조직은 또한 인접한 연동 운동과 호흡으로 인한 움직임에 매우 민감합니다. 췌장의 움직임을 최소화하는 것은 단일 세포 해상도 현미경 검사에 필수적인데, 몇 미크론의 움직임 아티팩트도 이미지를 흐리게 하고 왜곡할 수 있어 개별 세포의 역학을 추적하는 것이 불가능하기 때문입니다13.
IVI를 시행하기 위해서는 복부 영상창(AIW)을 외과적으로 이식해야 한다 9,11. AIW를 외과적으로 이식하기 위해 금속 창틀을 복벽에 봉합합니다. 그 후, 관심 기관은 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 프레임에 부착됩니다. 일부 경직된 내부 장기(예: 간, 비장, 경직 종양)에는 이것으로 충분하지만, 건강한 쥐 췌장을 이미징하려는 시도는 조직의 순응적인 질감과 복잡한 구조로 인해 차선의 측면 및 축 안정성으로 인해 손상됩니다14. 이러한 한계를 해결하기 위해 Park 등[14]은 건강한 췌장을 위해 특별히 설계된 이미징 창을 개발했습니다. 이 췌장 영상 창(PIW)은 커버슬립 바로 아래의 창틀 내에 수평 금속 선반을 통합하여 조직을 안정화하고 커버 유리와의 접촉을 유지함으로써 장 운동과 호흡의 영향을 최소화합니다. PIW는 향상된 측면 안정성을 제공하지만, 이 창은 여전히 축 방향 드리프트를 나타내며 금속 선반과 커버슬립 사이의 좁은 간격으로 인해 큰 고형 종양의 이미징을 추가로 방지한다는 것을 발견했습니다15.
이러한 한계를 해결하기 위해 건강한 췌장과 병든 췌장 모두에 대한 안정적인 장기 이미징을 달성할 수 있는 이식형 이미징 창인 SWIP( Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas)를 개발했습니다(그림 1)15. 여기에서는 SWIP를 이식하는 데 사용되는 수술 절차에 대한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 주요 목적은 전이와 관련된 동적 메커니즘을 연구하는 것이었지만 이 방법은 췌장 생물학 및 병리학의 다양한 측면을 탐구하는 데에도 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명된 SWIP 프로토콜은 십자수 바스켓 기술을 활용하여 췌장 조직 안정화의 개선된 방법을 제공합니다. 초기 복부 영상 창(AIW)은 복부 내부 장기의 생체 내 영상(IVI)을 가능하게 했지만 췌장과 같은 연조직의 움직임을 적절하게 제한하지 못했습니다. 이에 대응하여 Park et al.은 수평 금속 선반을 통합하고 유리 커버슬립과의 접촉을 유지하면서 췌장 조직의 안정화를 개선할 수 있는 췌장 이?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Evelyn Lipper Charitable Foundation, Gruss-Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, NIH T-32 Fellowship(CA200561) 및 국방부 췌장암 연구 프로그램(PCARP) 보조금 PA210223P1.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
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