Gestabiliseerd venster voor intravitale beeldvorming van de alvleesklier van muizen
Summary
We presenteren een protocol voor de chirurgische implantatie van een gestabiliseerd inwonend optisch venster voor subcellulaire beeldvorming van de alvleesklier van muizen, waardoor seriële en longitudinale studies van de gezonde en zieke alvleesklier mogelijk zijn.
Abstract
De fysiologie en pathofysiologie van de alvleesklier zijn complex. Ziekten van de alvleesklier, zoals pancreatitis en adenocarcinoom van de alvleesklier (PDAC) hebben een hoge morbiditeit en mortaliteit. Intravitale beeldvorming (IVI) is een krachtige techniek die het mogelijk maakt om weefsels in zowel gezonde als zieke toestand met hoge resolutie in beeld te brengen, waardoor de celdynamiek in realtime kan worden waargenomen. IVI van de alvleesklier van muizen vormt een aanzienlijke uitdaging vanwege de diepe viscerale en meegaande aard van het orgaan, waardoor het zeer vatbaar is voor beschadiging en bewegingsartefacten.
Hier wordt het proces beschreven van implantatie van de S-getabiliseerde Window voor Intravitale beeldvorming van de muizen Pancreas (SWIP). Het SWIP maakt IVI van de alvleesklier van muizen mogelijk in normale gezonde toestanden, tijdens de transformatie van de gezonde alvleesklier naar acute pancreatitis geïnduceerd door ceruleïne, en in kwaadaardige toestanden zoals pancreastumoren. In combinatie met genetisch gelabelde cellen of de toediening van fluorescerende kleurstoffen, maakt de SWIP het mogelijk om de dynamiek van eencellige en subcellulaire (inclusief eencellige en collectieve migratie) te meten, evenals seriële beeldvorming van hetzelfde interessegebied gedurende meerdere dagen.
Het vermogen om tumorcelmigratie vast te leggen is van bijzonder belang, aangezien de primaire oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij PDAC de overweldigende metastatische belasting is. Het begrijpen van de fysiologische dynamiek van metastase bij PDAC is een kritieke onvervulde behoefte en cruciaal voor het verbeteren van de prognose van de patiënt. Over het algemeen biedt de SWIP verbeterde beeldvormingsstabiliteit en breidt het de toepassing van IVI uit bij de gezonde alvleesklier en kwaadaardige alvleesklierziekten.
Introduction
Goedaardige en kwaadaardige pancreasaandoeningen zijn potentieel levensbedreigend, met aanzienlijke hiaten in het begrip van hun pathofysiologie. Pancreatitis – ontsteking van de alvleesklier – is de derde belangrijke oorzaak van gastro-intestinale ziektegerelateerde ziekenhuisopnames en heropnames in de VS en wordt in verband gebracht met aanzienlijke morbiditeit, mortaliteit en sociaaleconomische lasten. Gerangschikt als de derde belangrijkste doodsoorzaak door kanker 2, is ductaal adenocarcinoom (PDAC) van de pancreas verantwoordelijk voor de meeste maligniteiten van de alvleesklier3 en voorspelt het een slechte 5-jaarsoverleving van slechts 11%2. De belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte bij PDAC is een overweldigende metastatische belasting. Helaas vertonen de meeste patiënten gemetastaseerde ziekte. Daarom is het begrijpen van de dynamiek van metastase in PDAC een kritieke onvervulde behoefte op het gebied van kankeronderzoek.
De mechanismen die ten grondslag liggen aan ontstekingen en de metastatische cascade van de alvleesklier zijn slecht begrepen. Een belangrijke oorzaak van deze lacune in kennis is het onvermogen om de cellulaire dynamiek van de alvleesklier in vivo te observeren. Directe observatie van deze cellulaire dynamiek belooft kritieke doelen te onthullen om de diagnose en behandeling van mensen met pancreasaandoeningen te benutten en te verbeteren.
Intravitale beeldvorming (IVI) is een microscopietechniek waarmee onderzoekers biologische processen in levende dieren in realtime kunnen visualiseren en bestuderen. IVI maakt directe visualisatie met hoge resolutie mogelijk van intracellulaire en micro-omgevingsdynamiek in vivo en binnen de oorspronkelijke omgeving van het biologische proces in kwestie. Daarom maakt IVI in vivo observatie van gezonde en pathologische processen mogelijk.
Hedendaagse beeldvormingsmodaliteiten voor het hele lichaam, zoals MRI, PET en CT, bieden een uitstekend beeld van hele organen en kunnen pathologieën onthullen, zelfs vóór het begin van klinische symptomen. Ze zijn echter niet in staat om eencellige resolutie te bereiken of de vroegste stadia van ziekte – pancreatitis of maligniteit – te onthullen.
Eerder onderzoek heeft eencellige resolutie IVI gebruikt om goedaardige en kwaadaardige ziekten van huid5,6, borst7, long8, lever9, hersenen 10 en pancreastumoren 11 te observeren, wat leidde tot inzichten in mechanismen van ziekteprogressie 12. De alvleesklier van muizen vormt echter aanzienlijke obstakels voor het bereiken van eencellige resolutie met behulp van IVI, voornamelijk vanwege de diepe viscerale locatie en hoge compliantie. Bovendien is het een vertakt, diffuus verdeeld orgaan in het mesenterium dat verbinding maakt met de milt, dunne darm en maag, waardoor het moeilijk toegankelijk is. Het weefsel is ook zeer gevoelig voor beweging veroorzaakt door aangrenzende peristaltiek en ademhaling. Het minimaliseren van de beweging van de alvleesklier is essentieel voor microscopie met eencellige resolutie, omdat bewegingsartefacten van zelfs een paar micron beelden kunnen vervagen en vervormen, waardoorhet onmogelijk wordt om de dynamiek van individuele cellen te volgen.
Om IVI uit te voeren, moet een abdominaal beeldvormingsvenster (AIW) chirurgisch worden geïmplanteerd 9,11. Om de AIW operatief te implanteren, wordt een metalen raamkozijn in de buikwand gehecht. Daarna wordt het orgaan van belang met cyanoacrylaatlijm aan het frame bevestigd. Hoewel dit voldoende is voor sommige stijve inwendige organen (bijv. lever, milt, stijve tumoren), worden pogingen om de gezonde alvleesklier van muizen in beeld te brengen gecompromitteerd door suboptimale laterale en axiale stabiliteit als gevolg van de conforme textuur en complexe architectuur van het weefsel14. Om deze beperking aan te pakken, ontwikkelden Park et al.14 een beeldvormingsvenster dat speciaal is ontworpen voor de gezonde alvleesklier. Dit Pancreas Imaging Window (PIW) minimaliseert de invloed van darmbeweging en ademhaling door een horizontale metalen plank in het raamkozijn op te nemen, net onder het dekglaasje, waardoor het weefsel wordt gestabiliseerd en het contact met het dekglas behouden blijft. Hoewel de PIW een verhoogde laterale stabiliteit biedt, ontdekten we dat dit venster nog steeds axiale drift vertoont en bovendien de beeldvorming van grote solide tumoren verhindert vanwege de smalle opening tussen de metalen plank en het dekglaasje15.
Om deze beperkingen aan te pakken, ontwikkelden we de Sgetabiliseerde Window for Intravital beeldvorming van de muizen Pancreas (SWIP), een implanteerbaar beeldvormingsvenster dat in staat is om stabiele langetermijnbeeldvorming van zowel de gezonde als de zieke alvleesklier te bereiken (Figuur 1)15. Hier bieden we een uitgebreid protocol voor de chirurgische ingreep die wordt gebruikt om de SWIP te implanteren. Hoewel het primaire doel was om de dynamische mechanismen te bestuderen die betrokken zijn bij metastase, kan deze methode ook worden gebruikt om verschillende aspecten van de biologie en pathologie van de alvleesklier te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven SWIP-protocol biedt een verbeterde methode voor stabilisatie van het alvleesklierweefsel door gebruik te maken van een kruissteekmandtechniek. Vroege abdominale beeldvormingsvensters (AIW’s) maakten intravitale beeldvorming (IVI) van inwendige organen van de buik mogelijk, maar beperkten de beweging van zachte weefsels zoals de alvleesklier niet voldoende. Als reactie hierop ontwikkelden Park et al. een pancreas imaging window (PIW) dat een horizontale metalen plank bevat en een betere stabilisatie va…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De Evelyn Lipper Charitable Foundation, het Gruss-Lipper Biophotonics Center, het Integrated Imaging Program for Cancer Research, een NIH T-32 Fellowship (CA200561) en een subsidie van het Department of Defense Pancreatic Cancer Research Program (PCARP) PA210223P1.
Materials
| 1% (w/v) solution of enzyme-active detergent | Alconox Inc | NA | Concentrated, anionic detergent with protease enzymes for manual and ultrasonic cleaning |
| 5% (w/v) solution of sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Passivation reagent |
| 5 mm cover glass | Electron Microscopy Sciences | 72296-05 | Round Glass Coverslips |
| 7% (w/v) solution of citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | Passivation reagent |
| 28G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | Syringe for cell injection |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic |
| Bench Mount Heat Lamp | McMaster-Carr | 3349K51 | Heat lamp |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Covetrus North America | 059122 | Buprenorphine Analgesia |
| Castroviejo Curved Scissors | World Precision Instruments | WP2220 | Scissor for cutting tissue |
| C57BL/6J Mouse | Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J Mouse |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | Compressed air for drying tissue |
| Cyano acrylate – Gel Superglue | Staples | 234790-6 | Skin Glue |
| Cyano acrylate – Liquid Superglue | Staples | LOC1647358 | Coverslip Glue |
| DPBS 1x | Corning | 21-031-CV | DPBS for cerulein/cell injections |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery Pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" Length | Roboz Surgical | RS-5135 | Graefe Micro Dissecting Forceps |
| Imaging microscope | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Imaging software | NA | NA | See Entenberg et al. 2011 [27] |
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | Isoflurane Anesthesia |
| Kim Wipes | Fisher Scientific | 06-666-A | Kim Wipes |
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | Laboratory Tape |
| Mouse Dissecting Kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Surgical Instruments |
| Mouse Paw Pulse Oximeter Sensor | Kent Scientific Corpo | MSTAT Sensor-MSE | Pulse Oximeter |
| Mouse Surgisuite | Kent Scientific | SURGI-M04 | Heated platform |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory Lotion |
| Oxygen | TechAir | OX TM | Oxygen |
| PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON Size 5-0 | VWR | 95056-872 | Silk Suture |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Life Technologies | 10010-023 | PBS |
| PhysioSuite System | Kent Scientific | PhysioSuite | Heated Platform Controller |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs | Fisher Scientific | 867WCNOGLUE | Cotton Swabs |
| SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µL | Denville Scientific Inc. | P1125 | 100 µL Pipet Tips |
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate–Dextran | Sigma-Aldrich | T1287-500MG | Vascular Label |
| Window-fixturing plate | NA | NA | Custom made plate for window placement on microscope stage. Plate is made of 0.008 in stainless steel shim stock. For dimensions of plate see Entenberg et al., 2018 [8]. |
| Window Frame | NA | NA | The window is composed of a steel frame with a central aperture that accepts a 5 mm coverslip. A groove of 1.75 mm around the circumference of the frame provides space for the peritoneal muscle and skin layers to adhere to. See Entenberg et al., 2018 [8]. |
References
- Peery, A. F., et al. Burden and cost of gastrointestinal, liver, and pancreatic diseases in the United States: Update 2021. Gastroenterology. 162 (2), 621-644 (2022).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 73 (1), 17-48 (2023).
- Adamska, A., Domenichini, A., Falasca, M. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Current and evolving therapies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1338 (2017).
- Coste, A., Oktay, M. H., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Intravital imaging techniques for biomedical and clinical research. Cytometry A. 97 (5), 448-457 (2020).
- Peters, N. C., et al. In vivo imaging reveals an essential role for neutrophils in leishmaniasis transmitted by sand flies. Science. 321 (5891), 970-974 (2008).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Harney, A. S., et al. Real-time imaging reveals local, transient vascular permeability, and tumor cell intravasation stimulated by TIE2hi macrophage-derived VEGFA. Cancer Discovery. 5 (9), 932-943 (2015).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Science Translational Medicine. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Park, K., You, J., Du, C., Pan, Y. Cranial window implantation on mouse cortex to study microvascular change induced by cocaine. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 5 (1), 97-107 (2015).
- Beerling, E., Oosterom, I., Voest, E., Lolkema, M., van Rheenen, J. Intravital characterization of tumor cell migration in pancreatic cancer. Intravital. 5 (3), e1261773 (2016).
- Entenberg, D., Oktay, M. H., Condeelis, J. S. Intravital imaging to study cancer progression and metastasis. Nature Reviews: Cancer. 23 (1), 25-42 (2023).
- Entenberg, D., et al. time-lapsed, large-volume, high-resolution intravital imaging for tissue-wide analysis of single cell dynamics. Methods. 128, 65-77 (2017).
- Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. A novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model. Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).
- Du, W., et al. SWIP-a stabilized window for intravital imaging of the murine pancreas. Open Biology Journal. 12 (6), 210273 (2022).
- DeBold, T. A. M., James, W. . How To Passivate Stainless Steel Parts. , (2003).
- Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. Two-photon absorption properties of fluorescent proteins. Nature Methods. 8 (5), 393-399 (2011).
- Ueki, H., Wang, I. H., Zhao, D., Gunzer, M., Kawaoka, Y. Multicolor two-photon imaging of in vivo cellular pathophysiology upon influenza virus infection using the two-photon IMPRESS. Nature Protocols. 15 (3), 1041-1065 (2020).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Moral, J. A., et al. ILC2s amplify PD-1 blockade by activating tissue-specific cancer immunity. Nature. 579 (7797), 130-135 (2020).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), dmm034793 (2018).
- Harney, A. S., Wang, Y., Condeelis, J. S., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. Journal of Visualized Experiments. (112), e54042 (2016).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 19, 19.7.1-19.7.19 (2013).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Rodriguez-Tirado, C., et al. Long-term high-resolution intravital microscopy in the lung with a vacuum stabilized imaging window. Journal of Visualized Experiments. (116), 54603 (2016).
- Seynhaeve, A. L. B., Ten Hagen, T. L. M. Intravital microscopy of tumor-associated vasculature using advanced dorsal skinfold window chambers on transgenic fluorescent mice. Journal of Visualized Experiments. (131), 55115 (2018).
- Gorelick, F. S., Lerch, M. M. Do animal models of acute pancreatitis reproduce human disease. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 4 (2), 251-262 (2017).
- Dolai, S., et al. Depletion of the membrane-fusion regulator Munc18c attenuates caerulein hyperstimulation-induced pancreatitis. Journal of Biological Chemistry. 293 (7), 2510-2522 (2018).
- Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88 (5 Pt 1), 1192-1204 (1985).
- Dunphy, M. P., Entenberg, D., Toledo-Crow, R., Larson, S. M. In vivo microcartography and subcellular imaging of tumor angiogenesis: a novel platform for translational angiogenesis research. Microvascular Research. 78 (1), 51-56 (2009).
- Shanja-Grabarz, X., Coste, A., Entenberg, D., Di Cristofano, A. Real-time, high-resolution imaging of tumor cells in genetically engineered and orthotopic models of thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer. 27 (10), 529-539 (2020).
