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방법 논문

제한된 분해와 결합된 농축 비드를 사용한 숙주 세포 단백질 분석

3.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/65544

⸱

2024년 1월 19일

 ,  , 
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

이 논문에서

요약

의약품(DP)에서 숙주 세포 단백질(HCP)을 농축하고 단백질체 농축 비드를 사용하여 펩타이드를 검출하기 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 자체 제조한 단클론 항체(mAb) 원료의약품(DS)을 사용하여 시연되며, 이는 성능 측면에서 다양한 방법을 평가하고 비교하기 위한 잘 특성화된 표준 물질입니다.

초록

숙주 세포 단백질(HCP)은 소량이라도 치료용 단백질에 악영향을 미칠 수 있는 불순물입니다. 의약품과 관련된 잠재적 위험을 평가하기 위해 저농도 HCP를 식별하는 방법이 개발되었습니다. 민감한 HCP 검출 방법을 개발하기 위한 중요한 접근법은 액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)을 활용하여 분석 전에 단클론 항체(mAb)를 제거하는 동시에 HCP를 농축하는 것입니다.

이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 단백질체 농축 비드를 사용하여 숙주 세포 단백질을 농축하기 위한 자세한 지침을 제공합니다. 이 비드에는 다양한 단백질에 대한 특정 친화력을 가진 다양한 헥사펩타이드 리간드 라이브러리가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 또한 나노 LC-MS/MS를 사용하여 제한된 분해 및 후속 펩타이드 검출을 통합합니다. 이러한 기술을 사용하면 존재비가 낮은 HCP를 7,000배 이상 농축할 수 있으며, 그 결과 0.002ppm의 놀라운 검출 한계를 달성할 수 있습니다. 중요한 것은 이 프로토콜을 통해 NIST mAb를 사용하여 높은 수준의 신뢰도로 850개의 HCP를 검출할 수 있다는 것입니다. 또한 사용자 친화적으로 설계되었으며 구현을 지원하는 비디오 데모가 포함되어 있습니다. 이러한 단계를 수행함으로써 연구자들은 HCP를 효과적으로 농축하고 검출하여 의약품에 대한 위험 평가의 민감도와 정확성을 향상시킬 수 있습니다.

서론

숙주 세포 단백질(HCP)은 숙주 유기체의 세포 배양에서 방출되고 단클론 항체(mAb)1,2,3,4와 함께 공동 정제되는 불순물입니다. HCP의 미량 수준은 의약품 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15의 품질에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 ppm 미만에서 ppm 수준의 HCP를 검출하기 위해 민감한 HCP 분석 방법이 필요합니다.

직교 방법을 적용하여 HCP를 소량 검출할 수 있습니다. 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)은 일반적으로 전체 HCP를 정량화하는 데 사용되며, 해당 항체를 사용할 수 있는 경우 개별 HCP를 검출하고 정량화할 수도 있습니다16. 그러나 HCP 특이적 항체의 생산은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적입니다. 대조적으로, 질량분석법(LC-MS)과 결합된 액체 크로마토그래피는 mAb 의약품의 개별 HCP에 대한 포괄적인 정보를 제공할 수 있으며 HCP 식별에 널리 적용됩니다 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27입니다.

LC-MS/MS를 가진 HCP를 검출하기 위해 제한된 분해20, 여과17, 단백질 A 결실21, 면역침전(IP) 및 ProteoMiner 농축(PM)18 등 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 대부분의 분석법은 LC-MS/MS 분석 전에 mAb의 양을 줄이고 HCP를 농축하여 mAb 펩타이드와 HCP 펩타이드 사이의 동적 범위를 줄이는 것을 목표로 합니다. 이 프로토콜은 ProteoMiner 기술과 제한된 분해(PMLD)를 결합한 단백질체 시료 농축 분석법을 제시합니다28. ProteoMiner 농축 원리는 다양한 조합 펩타이드 리간드 라이브러리를 포함하는 상업적으로 이용 가능한 단백질체 농축 비드를 사용하는 것을 포함합니다. 이러한 리간드는 항체-의약품의 단백질에 특이적으로 결합하여 과잉 분자를 제거하는 동시에 저농도 숙주 세포 단백질(HCP)을 각각의 친화성 리간드에 집중시킵니다. 반면에, 제한된 소화의 원리는 낮은 농도의 트립신을 사용하는 것을 포함합니다. 이 농도는 소량의 HCP를 소화하기에는 충분하지만 모든 항체 의약품을 소화하기에는 충분하지 않습니다. 이 접근법은 용액에서 분해된 HCP 펩타이드의 회수 및 농축을 가능하게 합니다.

여과 방법과 비교하여, PMLD 기법은 검출된 HCP의 크기에 의해 제한되지 않는다17. 단백질 A 결실 방법은 항체와 관련된 HCP를 검출하는 데 특이적이며,21 면역침전은 항 HCP 항체가 생성된 특정 세포주(예: 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주)에서 사전 정의된 HCP로 제한됩니다4. 대조적으로, PMLD는 다양한 세포주의 의약품과 함께 정제된 모든 약물 모듈 및 숙주 세포 단백질에서 HCP를 검출하는 데 적용할 수 있습니다. 또한, PMLD는 언급된 방법(17,18,20,21,24)에 비해 더 나은 감도를 나타낸다.

이 접근법은 HCP 농도를 7000배까지 풍부하게 하고 검출 한계를 0.002ppm28로 낮출 수 있습니다. 실험 설정은 그림 1에 나와 있습니다.

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프로토콜

프로토콜에 사용된 약어는 보충 표 1에 나열되어 있습니다.

1. 용액 및 완충액의 준비

알림: 모든 시약의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

  1. 유리 바이알에 8.0 M Tris-HCl, pH 1 1mL의 탈 이온수, pH 8.0을 첨가하여 pH 8.0 M Tris-HCl, pH 9 용액을 준비하고 소용돌이 치면서 잘 혼합합니다. 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오.
  2. 24M Tris-HCl, pH 10.1mL에 SDC 1mg을 용해시켜 8.0mM 나트륨 데 옥시 콜 레이트 (SDC)를 준비합니다.
  3. 24 M Tris-HCl, pH 7의 1 mL에 SLS의 0.1 mg을 용해시켜 8.0 mM 나트륨 라 우로 일 사르코 시 네이트 (SLS)를 준비합니다.
  4. 24mM SDC와 24mM SLS를 1:1(v/v) 비율로 혼합하여 용출 버퍼를 준비합니다.
  5. 50μg의 트립신에 400μL의 탈이온수를 추가하여 20ng/μL의 트립신 용액을 준비합니다.
  6. 25 mg / mL 디 티 오 트레이 톨 (DTT) 308 μL의 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0을 7.7 mg의 DTT에 첨가하여 준비합니다.
  7. 0.25 M Tris-HCl, pH 1.2 mL, pH 0.1을 IAM의 56 mg에 첨가하여 56 M 요오드 아세트 아미드 (IAM)를 준비합니다.
  8. 10mL의 탈이온수에 1mL의 트리플루오로아세트산(TFA)을 첨가하여 9% TFA를 준비합니다. 4초 동안 소용돌이치고 회전합니다. 4 °C에서 최대 3개월 동안 보관하십시오.
  9. 탈이온수 99mL에 10% TFA 1mL를 첨가하여 완충액 A를 준비합니다.
  10. 10% TFA 1mL와 탈이온수 49mL를 아세토니트릴(ACN) 50mL에 첨가하여 완충액 B를 준비합니다.
  11. 물 50mL에 L-히스티딘 37mg과 L-히스티딘 일염산염 일수화물 54.8mg을 첨가하여 10mM 히스티딘 완충액을 준비합니다.

2. 단클론 항체(mAb) 용액의 제조

  1. 농도가 50mg/mL를 초과하는 의약품의 경우 2mL 미세 원심분리 튜브에서 단클론 항체(mAb) 15mg( 재료 표 참조)을 탈이온수로 희석하여 총 부피가 300μL이고 최종 pH가 ~6이 됩니다. 필요한 경우 아세트산 또는 Tris-HCl을 사용하여 pH를 조정하십시오.
  2. 농도가 50mg/mL 미만인 의약품의 경우 2.2.1 - 2.2.5단계에 따라 완충액 교환을 수행합니다.
    1. 각 샘플의 20mg을 10k 원심 필터 장치( 재료 표 참조)로 옮기고 약 100μL 부피가 남을 때까지 14,000 x g 에서 25분 동안(실온, RT) 원심분리합니다.
    2. 350μL의 10mM 히스티딘( 재료 표 참조), pH 6.0 버퍼를 필터, 와류 및 14,000 x g 의 원심분리기에 넣고 상온에서 25분 동안 한 번 반복합니다.
    3. 필터를 뒤집어 시료 채취 튜브에 넣은 다음 시료를 1000 x g 에서 상온에서 5분 동안 원심분리하여 채취 튜브의 전체 부피를 회수합니다. 200μLof 10mM 히스티딘 완충액으로 필터를 세척하고 위아래로 피펫하여 남아 있는 단백질 샘플을 회수합니다. 전체 용액을 동일한 수집 튜브, 와류로 옮기고 스핀 다운합니다.
    4. NanoDrop으로 시료 농도를 측정합니다. 농축 비드로 배양하기 전에 히스티딘 완충액을 추가하여 각 단백질 샘플의 농도를 50mg/mL로 조정합니다.
    5. 시료 300μL를 2mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.

3. 단백질체 농축 비드의 제조

  1. 상용 단백질 농축 키트에서 얻은 각 스핀 컬럼에서 상단 및 하단 캡을 제거합니다( 재료 표 참조). 캡은 나중에 사용되므로 버리지 마십시오.
  2. 스핀 컬럼을 캡 없이 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 저장 용액을 제거하기 위해 실온에서 설정하고 RT에서 30-60초 동안 1,000 x g 에서 설정을 원심분리합니다. 이 단계에서 수집된 재료를 폐기하십시오.
  3. 시중에서 판매되는 농축 비드( 재료 표 참조)에 200μL 세척 완충액을 추가하고 피펫을 위아래로 여러 번 피펫합니다. 스핀 컬럼을 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 RT에서 30-60초 동안 1,000 x g 으로 원심분리하여 버퍼를 제거합니다. 수집된 자료는 폐기하십시오.
    알림: 세척 버퍼는 상용 단백질 농축 키트에 포함되어 있습니다.
  4. 3.3단계를 두 번 반복합니다.
  5. 하단 캡을 교체하고 물 200μL를 추가한 다음 상단 캡을 교체합니다.

4. 단백질 강화

  1. 슬러리를 위아래로 피펫팅하고(3.5단계에서) 40μL의 슬러리를 2단계에서 준비한 샘플로 옮깁니다. 튜브를 배양하고 실온에서 2시간 동안 회전시킵니다.
  2. 16G 바늘을 사용하여 프릿으로 팁을 만든 다음( 재료 표 참조) 적절한 프릿 크기를 얻은 다음 200μL 팁의 팁 끝에 삽입합니다.
  3. 비드가 있는 샘플을 4.2단계에서 준비한 팁으로 옮깁니다. 2mL 마이크로 원심분리기 튜브로 200 x g 에서 상온에서 3분 동안 팁을 원심분리하여 용액을 제거합니다.
  4. 팁에 200μL 세척 버퍼를 추가하여 비드를 세척하고 2mL 마이크로 원심분리 튜브로 200 x g 에서 상온에서 2분 동안 팁을 원심분리하여 세척액을 제거합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
  5. 팁에 물 200μL를 추가하여 비드를 세척하고 상온에서 2분 동안 200xg의 2mL 마이크로 원심분리기 튜브로 팁을 원심분리하여 물을 제거합니다.
  6. 팁에 10μL의 용출 완충액을 첨가하여 비드에서 단백질을 용리하고(1.4단계) 팁에서 슬러리를 10회 피펫하여 비드가 용출 완충액에 담가도록 합니다.
  7. 새로운 0.5mL 마이크로 원심분리기 튜브로 팁을 원심분리하여 RT에서 30초 동안 200 x g 으로 팁을 원심분리하여 용리액을 수집합니다. 4.6-4.7단계를 두 번 반복하고 모든 용출액을 하나의 0.5mL 미세 원심분리 튜브에 결합합니다.
  8. 1.5μL의 트립신 용액(단계 1.5)을 용리액에 첨가하여 28°C에서 하룻밤 동안 분해합니다. 1.5μL의 25mg/mL DTT를 추가하고(단계 1.6) 샘플을 90°C에서 20분 동안 가열합니다.
  9. 1.5μL의 0.25M IAM(단계 1.7)을 추가하고 어두운 어두운 실온에서 20분 동안 배양합니다. 3.5μL 10% TFA(단계 1.8)를 추가하고 2분 동안 소용돌이치고 pH가 ~2-3이 되도록 합니다.
  10. 상온에서 10분 동안 14,400× g 의 원심분리기를 사용하여 SDC 및 SLS를 침전시킵니다. 탈염을 위해 상층액을 수집합니다.
  11. 아래 단계에 따라 탈염을 수행하십시오.
    1. 50μL의 버퍼 B(1.10단계)를 GC 탈염 팁에 추가합니다( 재료 표 참조). 홀더로 팁을 1000 x g 에서 RT에서 3분 동안 원심분리합니다. 수집된 재료는 폐기합니다.
    2. 팁에 50μL의 버퍼 A(1.9단계)를 추가합니다. 홀더로 팁을 1000 x g 에서 RT에서 3분 동안 원심분리합니다. 수집된 재료는 폐기합니다.
    3. 산성화된 샘플을 팁에 추가합니다. 홀더로 팁을 500 x g 에서 RT에서 6분 동안 원심분리합니다. 수집된 재료는 폐기합니다.
    4. 팁에 50μL의 버퍼 A를 추가하여 팁을 세척합니다. 홀더로 팁을 500 x g 에서 RT에서 3분 동안 원심분리합니다. 수집된 재료는 폐기합니다. 한 번 반복합니다.
    5. GC 탈염 팁에 50μL의 Buffer B를 추가하여 팁에서 펩타이드를 용리합니다. RT에서 3분 동안 500 x g 의 새 튜브로 팁을 원심분리합니다. 재료를 수집합니다. 이 단계를 한 번 반복하고 용리액을 혼합합니다.
    6. 진공 농축기로 용리액을 건조시킵니다( 재료 표 참조).
  12. 건조된 용리액을 30μL의 0.1% 포름산(FA) 용액에 재현탁시킵니다.
  13. 분광 광도계로 214nm에서 펩타이드 혼합물의 UV를 측정합니다( 재료 표 참조). 펩타이드 혼합물의 농도는 0.1에서 0.5mg/mL 사이여야 합니다.
  14. 분해된 각 시료 10μL를 LC 시료 바이알에 옮긴 다음 분해된 각 시료 1μg을 나노 LC-MS/MS (재료 표 참조)에 주입합니다. 5단계에 따라 분석을 수행합니다. 분해된 나머지 샘플은 -80°C 냉동고에 보관합니다.

5. 나노 LC-MS/MS 분석

  1. 펩타이드 혼합물을 질량 분석기에 연결된 나노-LC 시스템에 주입합니다. 펩타이드 혼합물(~1μg)을 탈염을 위해 표 1A 에 제공된 그래디언트를 사용하여 C18 트랩 컬럼에 로드한 다음 분리를 위해 40°C에서 C18 분석 컬럼에 로드합니다.
    참고: 이동상 A 완충액은 초순수에서 0.1% FA로 구성되었고, 이동상 B는 80% ACN에서 0.1% FA로 구성되었습니다.
  2. 펩타이드를 분리하고 표 1B 에 제공된 그래디언트로 250nL/min의 유속으로 용리합니다.
    알림: 질량 분석기는 3초의 주기 시간으로 데이터 종속 모드(DDA)에서 작동되었습니다. 이온은 각 전체 MS 스캔에 대해 30%의 정규화된 충돌 에너지로 고에너지 충돌 분해(HCD)를 통해 단편화를 거쳤습니다. 스캔은 60,000의 해상도에서 수행되었으며 자동 이득 제어(AGC) 대상은 3e6, 최대 주입 시간은 20ms, m/z 범위는 380-1600입니다. MS/MS 이벤트는 15,000의 분해능, 1e5의 AGC 목표, 60ms의 최대 주입 시간, 200-2000의 m/z 범위로 수행되었습니다. 제외 기간은 45초로 설정되었습니다. 이온 소스 특성은 표 1C에 나와 있으며 특정 질량 분석 파라미터는 표 2A-F에서 찾을 수 있습니다.

6. 데이터 분석

  1. UniProt mus+musculus 데이터베이스29에 대해 NISTmAb 질량 분석 원시 파일 검색을 수행합니다. 또한, UniProt Cricetulus Griseus 데이터베이스(30)에 대해 재조합 단백질 스파이크-인 mAb DS 질량분석법 원시 파일을 검색합니다.
    참고: 이러한 검색은 Sequest HT 및 Mascot 검색 엔진을 사용하여 Proteome Discoverer 소프트웨어( 자료 표 참조)에서 수행되었습니다. 사용된 데이터베이스에는 중복 항목이 없었습니다.
  2. 질량 분석 검색의 경우 질량 허용 오차를 10ppm으로 적용하고 단편 질량 허용 오차를 0.02Da로 설정합니다.
    참고: 검색 기준에는 시스테인 잔기의 정적 카르바미도메틸화(+57.0214Da)와 메티오닌 잔기의 다양한 산화 변형(+15.9949Da)이 포함되었습니다. 또한 탈아미노화(+0.984Da)의 가변 변형이 적용되었습니다.
  3. 트립신 분해를 사용하여 데이터베이스 검색을 수행하여 최대 2개의 누락된 절단을 허용합니다. 단백질과 펩타이드 모두에 대한 거짓 발견 비율을 0.01로 설정합니다.
    참고: 숙주 세포 단백질(HCP)을 확실하게 식별하기 위해 최소 2개의 고유한 펩타이드가 적용되었습니다. 표 3 은 Proteome Discoverer 소프트웨어로 분석한 NIST mAb와 관련된 확인된 HCP의 대표적인 요약을 제공합니다.

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결과

이 프로토콜은 단클론 항체(mAb) 샘플에서 숙주 세포 단백질(HCP)을 분석하기 위해 제한된 분해(PMLD)와 결합된 단백질 농축(protein enrichment)이라고 하는 샘플 전처리 워크플로우를 제시했습니다. 그림 1 은 PMLD의 단계별 절차를 보여줍니다. 연구원들은 직접 분해( 그림 2의 상단 패널에 표시)와 PMLD( 그림 2의 하단 패널에 표시)를 사용한 HCP 분석 결과를 비교했습니다. 총 이온 크로마토그램(TIC) 프로파일은 PMLD가 주요 mAb 펩타이드를 현저히 감소시키거나 제거하면서 mAb 펩타이드에 필적하는 일부 HCP 펩타이드를 관찰할 수 있음을 나타냅니다. 나노 LC(표 1) 및 MS/MS(표 2) 분석에 대한 자세한 파라미터가 제공됩니다. 또한 표 3

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토론

시판되는 단백질 농축 비드에는 두 가지 버전이 있습니다: 하나는 더 작은 용량이고 다른 하나는 더 큰 용량입니다( 재료 표 참조). 두 가지 버전의 농축 비드에는 패키지에 10개의 프렙이 포함되어 있습니다. 제조업체의 지침에 따르면 소용량 키트의 각 준비는 총 단백질 10mg을 농축하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나 DS에서 숙주 세포 단백질(HCP) 농축을 최적으로 수행하려면 각 분취를 5개의 DS 샘플에 사용하는 것이 좋습니다. 따라서 각 키트를 사용하여 50개의 샘플에서 HCP를 농축할 수 있습니다. 대용량 키트의 각 분취에 대해 25개의 DS 검체에서 HCP를 농축하는 데 적합하며, 총 250개의 검체에서 HCP를 검출할 수 있습니다.

3.1단계에서는 전체 프로토콜에서 재사용되므로 상단 또는 하단 대문자를 버리지 않는 것이 좋습니다. 비드가 상단 캡에 가라앉으면 하단 플러그를 제거하고 상단 캡을 컬럼에 유지한 상태에서 원심분리한 후 교체하십...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
16 G, 메탈 허브 니들, 2 인치, 포인트 스타일 3Hamilton91016
Acclaim PepMap 100 C18 트랩 컬럼 (20 cm × 0.075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrileFisher-ScientificA955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0.5 원심 필터 유닛Millipore SigmaUFC5010
C18 분석 컬럼 (0.075 mm × 1.7 μ m &시간; 30cm, 100 Å)CoAnn TechnologiesHEB07503001718I
Centrifuge 5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pkAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc   7820-11201
사내 mAb리제네론농도 200mg/mL
요오드아세트아미드(30 x 9.3mg)Thermo FisherA39271
이소프로판올Fisher-Scientific149320025
L-히스티딘시그마 알드리치H6034
L-히스티딘 모노하이드로클로라이드 일수화물시그마 알드리치53370
메탄올피셔 - 사이언티픽A456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mLEppendorf (VWR)22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mLEppendorf (VWR)22431102
Proteome Discoverer 소프트웨어 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity KitBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity KitBio-Rad1633006
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma AldrichD6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Trifluoracetic acid (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20ug)PromegaV5111
튜브 리볼버 로테이터Thermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC 나노 시스템Thermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
물 0.1% 포름산 (v/v), Optima LC/MS 등급 피셔-사이언티픽LS118-4 
,

참고문헌

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