Summary
Aquí, presentamos un protocolo para describir la metagenómica de amplicones para determinar la comunidad bacteriana de uvas Traminette, uvas fermentadas y vino final.
Abstract
Los avances en la tecnología de secuenciación y el acceso relativamente fácil al uso de herramientas bioinformáticas para perfilar las estructuras de las comunidades microbianas han facilitado una mejor comprensión de los microbios cultivables y no cultivables en las uvas y el vino. Durante la fermentación industrial, los microbios, conocidos y desconocidos, suelen ser responsables del desarrollo del producto y del sabor desagradable. Por lo tanto, el perfil de las bacterias desde la uva hasta el vino puede permitir una fácil comprensión de la dinámica microbiana in situ . En este estudio, las bacterias del mosto de uva Traminette en fermentación y el vino final se sometieron a una extracción de ADN que arrojó de 15 ng/μL a 87 ng/μL. Se secuenció el amplicón 16S de la región hipervariable de la región V4, bacterias relativamente abundantes constituidas por los filos Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota y seguidos por Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxoococcota, y Acidobacteriota. Un análisis del diagrama de Venn de las unidades taxonómicas operativas únicas (OTU) compartidas reveló que 15 filos de bacterias eran comunes tanto al mosto de uva, como a la etapa de fermentación y al vino final. Se detectaron filos que no habían sido reportados previamente utilizando la secuenciación del amplicón 16S, así como géneros como Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae. Se probó la variación en el uso de nutrientes orgánicos en el vino y su impacto sobre las bacterias; El grado de uniformidad determinó la diversidad de Traminette R que contenía Fermaid O y Traminette L estimulada con Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O. La diversidad alfa mediante la prueba de Kruskal-Wallis determinó el grado de uniformidad. La diversidad beta indicó un cambio en las bacterias en la etapa de fermentación de los dos tratamientos, y las bacterias finales del vino se vieron similares. El estudio confirmó que la secuenciación del amplicón 16S se puede utilizar para monitorear los cambios en las bacterias durante la producción de vino para respaldar la calidad y una mejor utilización de las bacterias de la uva durante la producción de vino.
Introduction
La uva Traminette se caracteriza por una producción de vino de calidad superior, además de un rendimiento apreciable y una resistencia parcial a varias infecciones fúngicas 1,2,3. La fermentación natural de la uva depende de los microorganismos asociados, el ambiente de producción del vino y los recipientes de fermentación 4,5. A menudo, muchas bodegas dependen de levaduras y bacterias silvestres para la fermentación, la producción de alcohol, ésteres, aromasy desarrollo de sabores.
El objetivo de este estudio es examinar la composición bacteriana de las uvas y monitorizar su dinámica durante la fermentación. Sin embargo, el uso moderno de cultivos iniciadores como Saccharomyces cerevisiae para la fermentación primaria, donde se produce alcohol, es común a diferentes estilos de vino7. Además, la fermentación secundaria, en la que el ácido málico es descarboxilado por Oenococcus oeni a ácido láctico, mejora el perfil organoléptico y gustativo del vino y reduce la acidez del vino 8,9. Con los recientes avances en el uso de métodos independientes del cultivo, ahora es posible determinar diferentes microbios asociados a la uva de vinificación y a las especies que se transfieren al mosto y participan en la fermentación en diferentes momentos hasta el producto final10.
Las funciones y la dinámica de las bacterias silvestres de diferentes uvas transferidas al mosto durante la fermentación del vino son poco conocidas. La taxonomía de muchas de estas bacterias ni siquiera se conoce, o sus propiedades fenotípicas no están caracterizadas. Esto hace que su aplicación en la fermentación de cocultivos siga estando poco infrautilizada. Sin embargo, el análisis basado en cultivos microbiológicos se ha utilizado para determinar la población bacteriana asociada a la uva y al vino10. Es ampliamente conocido que la siembra selectiva de cultivos es tediosa, propensa a la contaminación, tiene una baja reproducibilidad y el resultado puede ser dudoso; También pasa por alto especies bacterianas cuyos requisitos de crecimiento se desconocen. Estudios previos indican que las metodologías basadas en el gen 16S rRNA independientes del cultivo ofrecen un enfoque más fiable y rentable para caracterizar comunidades microbianas complejas11. Por ejemplo, la secuenciación de las regiones hipervariables del gen 16S rRNA se ha empleado con éxito para estudiar bacterias en hojas de parra, bayas y vino 12,13,14. Los estudios han demostrado que el uso del metabarcoding de ARNr 16S o de la secuenciación metagenómica completa es adecuado para los estudios del microbioma15. Existe información emergente sobre la posible vinculación de la diversidad bacteriana con sus atributos metabólicos durante la producción de vino, lo que podría ayudar en la determinación de las propiedades enológicas y del terroir16.
Se ha enfatizado la necesidad de maximizar las ventajas de las herramientas metagenómicas que utilizan la secuenciación de nueva generación (NGS) para estudiar la ecología microbiana de la uva y el vino16,17. Además, el uso de métodos independientes del cultivo basados en la secuenciación de alto rendimiento para perfilar la diversidad microbiana del ecosistema alimentario y de fermentación se ha vuelto muy relevante y valioso para muchos laboratorios y se recomienda para uso industrial18,19. Proporciona una ventaja de detección y perfil taxonómico de las poblaciones microbianas actuales y la contribución de los microbios ambientales, su abundancia relativa y la diversidad alfa y beta20. La secuenciación de la región variable de la región 16S se ha convertido en un importante gen de elección y se ha utilizado durante diferentes estudios ecológicos microbianos.
Si bien muchos estudios se centran en los hongos, especialmente en las levaduras, durante la fermentación del vino21, este estudio informó sobre la secuenciación de amplicones 16S y las herramientas bioinformáticas utilizadas para estudiar las bacterias durante la fermentación de las uvas Traminette para la producción de vino.
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Protocol
1. Producción experimental de vino
- Obtenga uvas Traminnette del vino Dynamis Estate en el viñedo de Jonesville, Carolina del Norte, despalillee y estruelgue para liberar el mosto en dos fermentadores abiertos separados de 600 L y déjelos con las pieles durante aproximadamente 4 días con las tapas puestas.
- Golpee las tapas una vez al día para mantener la piel húmeda y limitar la producción de ácidos volátiles (VA).
NOTA: La idea es que muchos de los precursores aromáticos (monoterpenos) se sitúen en los hollejos y dejen el jugo en contacto con los hollejos para aumentar el potencial aromático del vino. - Después de 4 días, lanzamiento de Saccharomyces cerevisiae var cerevisiae QA23 (Lallemand). Esta levadura fue seleccionada porque es un fermentador fuerte y se asocia con la mejora del carácter varietal en el vino de las uvas.
- En un tanque, Traminette R, añadir 20 g/hL de Fermaid O cuando el brix esté a 17,7 y 20 g/hL de Fermaid O y 12,5 g/hL de Fermaid K a 13,1 g/hL para conseguir seguridad de fermentación, mientras que en el otro tanque de Traminette L, añadir 40 g/hL de Stimula Sauvignon blanc cuando el brix esté a 17,1. Añadir también 20 g/hL de Fermaid O cuando el brix esté en 13,4 para potenciar el carácter varietal del vino.
- Tomar muestras duplicadas de mosto (día 1), levadura añadida (día 4), mosto fermentado (día 15) y muestras de vino terminado (día 30) y mantener a -20 °C antes de la extracción del ADN y el análisis metagenómico.
2. Extracción de ADN para metagenómica
- Mantenga todas las muestras duplicadas obtenidas anteriormente en hielo hasta la primera centrifugación.
- Transfiera 20 ml de la muestra fermentada a un tubo estéril con tapón de rosca de 50 ml.
- Añadir 10 mL de agua fría y homogeneizar (vórtice). Centrifugar durante 1 min a 800 x g a 4 °C y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mL.
NOTA: Este paso eliminará los sólidos de la muestra. - Repita el paso 2.3 dos veces y agrupe los sobrenadantes en el mismo tubo.
- Centrifugar sobrenadante a 3.000 x g a 4 °C durante 20 min para peletizar las células. Deseche el sobrenadante.
- Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de PBS, transfiéralo a un tubo con tapón de rosca de 2 ml y centrifugue a 14.000 x g durante 2 minutos. Realiza dos lavados más con PBS.
- En este paso, congele los gránulos a -20 ° C o siga el paso 2.8. Es importante que todas las muestras sean tratadas de la misma manera.
- Añadir 978 μL de tampón fosfato sódico. Preparar tampón fosfato de sodio, añadir 3,1 g de NaH2PO4· H2O y 10,9 g de Na2HPO4 (anhidro) a H2O destilado para obtener un volumen de 1 L, y ajustar el pH a 7,4.
- Agregue 122 μL de tampón de ADN (kit de espín de ADN) y vórtice.
- Dejar reposar en el frigorífico (4 °C) durante 45 min-1 h. Agitar las muestras cada 15 min. Este paso se puede dejar toda la noche (o/n) o hasta que esté listo para continuar usando el kit de centrifugado de ADN.
- Transfiera 1 ml de muestra a un tubo de solución de lisis 1 (kit de centrifugado de ADN) y apriete la tapa (escriba el número de muestra en el costado del tubo y no en la tapa; los reactivos del kit eliminarán todo lo escrito en la tapa).
- Homogeneizar la muestra en un molinillo de bolas (6,5 m/s, CY: 24 x 2) durante 60 s tres veces. Si el molinillo para batir perlas tiene el dispositivo para poner hielo, coloque 50 g de hielo seco debajo de los tubos. De lo contrario, mantenga las muestras en hielo húmedo durante 5 minutos entre cada paso de homogeneización.
- Tubos centrífugos de matriz de lisis E (kit de centrifugado de ADN) durante 1 min a 16800 x g (o velocidad máxima).
- Transfiera el sobrenadante a un microtubo limpio. A continuación, agregue 250 μL de reactivo de solución de precipitación de proteínas (PPS) (kit de centrifugado de ADN) y mezcle agitando el tubo a mano 10 veces.
- Centrifugar durante 5 min a 16800 x g para granular el precipitado.
- Transfiera el sobrenadante a un tubo estéril de 15 ml. Agregue 1 mL de suspensión de matriz de unión (kit de centrifugado de ADN) al sobrenadante.
NOTA: Vuelva a suspender la suspensión de la matriz de unión antes de usarla hasta que sea homogénea. - Invierta los tubos a mano durante 2 minutos, luego deje reposar los tubos en una rejilla durante 3 minutos (para permitir la sedimentación de la matriz de sílice).
- Retire con cuidado 1 ml del sobrenadante. Vuelva a suspender la matriz en el sobrenadante restante.
- Transfiera 600 μL de la mezcla a un tubo de filtro de centrifugación (kit de centrifugación de ADN) y centrifugue durante 1 min a 14500 x g.
- Agregue la mezcla restante y centrifugue.
- Decantar el flujo y añadir 500 μL de solución de lavado (kit de centrifugado de ADN) en el tubo del filtro de centrifugado y centrifugar durante 1 min a 14500 x g (asegúrese de añadir EtOH a la solución de lavado; consulte el manual del producto). Decantar el flujo y repetir el lavado dos veces más (3 lavados en total).
- Decantar el flujo continuo y centrifugar durante 2 minutos adicionales a 14.500 x g para secar la matriz de la solución de lavado residual.
- Retire el filtro de centrifugado y colóquelo en un tubo de captura nuevo (kit de centrifugado de ADN). Secar al aire el filtro giratorio durante 5 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Calentar el agua libre de ADNasa (kit de centrifugado de ADN) a 55 °C durante 5 min. Añadir 50 μL de agua libre de ADNasa y agitar suavemente la matriz sobre la membrana del filtro con una punta de pipeta para una elución eficiente del ADN. Deje reposar las muestras en RT durante 1 minuto, luego centrifugue durante 1 minuto a 14500 x g para eluir el ADN.
- Coloque las muestras en hielo. Cargue la mezcla de muestra (2 μL de muestra + 2 μL de agua + 1 μL de tampón de carga) en un gel. Mide la concentración de ADN.
- Almacenar las muestras a -20 °C.
- Utilice un espectrofotómetro para cuantificar el ADN extraído.
NOTA: Se descartó y cuantificó un volumen de 1 μL de ADN, y se observó la calidad del ADN en una relación A260/A280.
3. Electroforesis de ADN
- Prepare gel de agarosa al 1% en tampón 0,5 Tris/Borato/EDTA (TBE) (20 ml para un mini gel, 70-100 ml para un gel mediano). Pesar agarosa + tampón, hervir en el microondas para derretir la agarosa, volver a pesar y agregar dH2O al peso original. Enfriar la solución de agarosa a 55-60 °C y verter en el formador de gel con el conjunto de peine. Deja que el gel se solidifique.
- Agregue 1 μL de tampón de carga de gel 10x a la muestra (10 μL) y cárguelo en el gel junto a un marcador de peso molecular. Pasa de negativo (negro) a positivo (rojo) a 100-115 V (gel grande) o 90 V (mini gel) hasta que el tinte azul esté cerca de la parte inferior.
- Tiñe el gel durante 30 minutos en bromuro de etidio de 1 μL/ml o verde SYBR (se necesitan guantes y gafas de nitrilo), enjuague con agua y visualice bajo una fuente de luz ultravioleta (UV). De las muestras duplicadas, seleccione el rendimiento más alto para su posterior procesamiento.
4. Secuenciación de alto rendimiento
- Amplificar la región hipervariable V4 del gen 16S rRNA utilizando los cebadores específicos 515F (5' -GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3') y 806R (5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')22. Ajuste las condiciones de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a 94 °C durante 2 minutos, 30 ciclos de 94 °C durante 20 s, 58 °C durante 20 s, 65 °C durante 1 min y 65 °C durante 10 min (extensión final).
- Llevar a cabo reacciones de PCR con una mezcla maestra de PCR de alta fidelidad (Tabla de Materiales).
- Genere bibliotecas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN y, a continuación, secuenciar mediante secuenciación de extremos emparejados en una plataforma de secuenciación.
NOTA: Aquí, las bibliotecas generadas con el kit de preparación de bibliotecas de ADN NEBNext Ultra II se secuenciaron utilizando secuenciación Illumina de extremo emparejado (2 × 250 pb) en la plataforma novaseq6000. - Siga los pasos de secuenciación:
- Paso 1: Cortar el ADN con una enzima, generalmente mediante un método que selecciona un tamaño general.
- Añadir 3,5 μL de tampón de secuenciación y 1,5 μL de mezcla de enzimas a 25 μL de ADN (aprox. 1 μg), mezclar 10 veces con una pipeta y centrifugar rápidamente.
- Colocar en un termociclador con las siguientes condiciones: precalentar la tapa a 75 °C, (1) 30 min a 20 °C (2) 30 min a 65 °C (3) mantener a 4 °C.
- Paso 2: Añadir adaptadores a través de la ligadura
- Agregue 15 μL de mezcla maestra de ligadura, 1,25 μL de adaptador, 0,5 μL de potenciador de ligadura y 30 μL de mezcla de ADN de preparación final con una pipeta.
- Incubar a 20 °C durante 15 min en un termociclador y luego añadir 1,5 μL de enzima reactivo de escisión específico de uracilo (USER) a la mezcla de ligadura para obtener un total de 48,26 μL. Incubar a 37 °C durante 15 min.
- Añadir 43,5 μL de perlas magnéticas al adaptador de ADN de ligadura, mezclar 20 veces con una pipeta e incubar durante 5 min a RT. Separar las perlas con una rejilla magnética, luego incubar durante 5-10 min, y desechar el sobrenadante.
- Lavar el pellet con 100 μL de etanol al 80%, secar durante 30 s y volver a lavar. Eluir las perlas y los gránulos en 8,5 μL de 10 mM de Tris HCl/0,1x Tris-EDTA(TE)/HPLC H20, mezclar con una pipeta e incubar a RT durante 2 min.
- Incubar en la rejilla magnética y extraer 7,5 μL de ADN eluido como sobrenadante. Coloque el eluto en un tubo nuevo y realice un paso de PCR.
- En primer lugar, agregue 12,5 μL de mezcla maestra, 2,5 μL de cebador índice i7 y 2,5 μL de cebador de PCR universal/cebador i5 a 7,5 μL de ADN ligado al adaptador para obtener 25 μL de mezcla de reacción de PCR. Utilice la siguiente condición de PCR: precaliente la tapa a 103 °C. 98 °C durante 30 s, 98 °C durante 10 s, 65 °C durante 75 s, 65 °C durante 5 min y manténgala a 4 °C después de 10 ciclos.
- Limpie el ADN amplificado de 25 μL. Añadir 22,5 μL de perlas magnéticas y mezclar 20 veces. Incubar a RT durante 5 min y eliminar 50 μL del sobrenadante. Lave las perlas con 100 μL de etanol al 80% y elimine todo el etanol secándolas suavemente durante 30 s.
- Vuelva a suspender las perlas de color marrón oscuro en 16 μL de agua, mezcle 20 veces con una pipeta y colóquelas en la rejilla magnética durante 30-60 s. Transfiera 15 μL a un tubo nuevo.
- Determine la concentración de ADN con un fluorómetro. Mezcle 90 μL de tampón + 1 μL de colorante + 2 μL de muestra de biblioteca de ADN y lea la concentración. Diluir el ADN a 2 nM, cargar 27-30 μL en la celda de flujo y colocarlo en el secuenciador.
- Paso 3: Secuenciar los adaptadores, hibridar las bibliotecas generadas anteriormente con la matriz de la celda de flujo con patrón y capturar el ADN según las instrucciones del fabricante. Utilízalo como plantilla para la segunda síntesis.
- A continuación, amplifica la segunda hebra en un grupo clonal. Linealice el clúster y bloquee los sitios activos. Agregue cebador de secuenciación para proporcionar un sitio para la secuenciación por síntesis en la secuencia según el protocolo del fabricante.
NOTA: Químicamente, los nucleótidos modificados se unen a la hebra molde de ADN utilizando la complementariedad natural. Cada nucleótido tiene una etiqueta fluorescente y un terminador reversible que bloquea la inclusión de la siguiente base. Por lo tanto, la presencia de una señal fluorescente indica qué nucleótido se inserta, y el terminador se escinde para que la siguiente base se una.
- A continuación, amplifica la segunda hebra en un grupo clonal. Linealice el clúster y bloquee los sitios activos. Agregue cebador de secuenciación para proporcionar un sitio para la secuenciación por síntesis en la secuencia según el protocolo del fabricante.
- Paso 4: Amplifique la hebra unida para obtener grupos de secuencias que se secuencian en tándem por síntesis.
NOTA: Los clústeres proporcionan una señal más brillante que una sola hebra a través del escaneo bidireccional y la química de secuenciación de dos canales. El software de secuenciación transfiere automáticamente los archivos de llamada base (*.cbcl) a la ubicación de la carpeta de salida especificada para el análisis de datos.
- Paso 1: Cortar el ADN con una enzima, generalmente mediante un método que selecciona un tamaño general.
5. Bioinformática
- Genere los datos de secuencia como archivos FASTQ. Analice para incluir las siguientes partes.
- Parte I:
- Guarde los archivos FASTQ obtenidos del secuenciador, haga clic para abrir un archivo de hoja de cálculo y cree archivos de asignación/metadatos.
- Abra el sitio web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), cargue los archivos FASTQ, lea Control de calidad, filtrado y recorte en QIIME222. Deposite las secuencias sin procesar como archivo de lectura de secuencias (SRA) y GenBank en NCBI BioProject (https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/bioproject/)
- Parte II: Vaya al sitio web de Nephele (https://nephele.niaid.nih.gov/), realice las lecturas de extremos emparejados demultiplexados, la sustitución de filtros y los errores de quimera, y fusione usando DADA223. Utilice el clasificador Bayes Naive entrenado en la base de datos Silva versión 132 99% OTU para realizar la asignación taxonómica bacteriana con una similitud del 97%24.
- Parte III: Abra el sitio web de MicrobiomeDB, haga clic para cargar archivos y genere las curvas de diversidad alfa, beta, abundancia relativa y rarefacción (https://microbiomedb.org/mbio/app) de OTU.
- Parte IV: Abra una hoja de cálculo y transfiera datos para hacer mapas de calor, diagramas de Venn y tamaño del efecto de análisis discriminante lineal (https://microbiomedb.org/mbio/app).
- Parte I:
6. Análisis estadístico
- Abra QIIME222 y determine las diferencias significativas en la diversidad alfa entre los grupos utilizando el script de significación del grupo alfa. Esto también realizará la prueba de Kruskal-Wallis.
- Determinar las diferencias en la diversidad beta entre los grupos mediante el uso de PERMANOVA, incluyendo una prueba por pares25.
- Obtener las diferencias significativas en la estructura de la comunidad bacteriana entre los grupos que utilizan MicrobiomeDB. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p ≤0,05.
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Representative Results
Primero se determinó la cantidad y calidad del ADN extraído del mosto de uva, del vino fermentado y del vino final; el valor de la cantidad oscila entre 15 y 87 ng/μL (Tabla 1).
Secuenciación y bioinformática
El secuenciador de alto rendimiento de Illumina generó un archivo FASTQ que se importó a Nephele y se vio en la plataforma QIIME 226. En primer lugar, se utilizó el software FastQC para comprobar la calidad de la secuencia. A continuación, se recortó en los extremos 5' y 3' para eliminar los nucleótidos de mala calidad, se eliminó el ruido, se fusionó y se agotaron las secuencias quiméricas antes de agruparlos en OTU (definición operativa de una especie) utilizando el eliminador de ruido DADA223. Se mapearon a taxones bacterianos utilizando la base de datos SILVA v138.1. Las secuencias se agruparon en OTU sobre la base de una similitud de secuencia de nucleótidos del 99%. La Figura 1 muestra las curvas de rarefacción DADA2 para las OTU; Llegó a una meseta. Esto indicó que se cubrieron suficientes secuencias para indicar la mayor parte de la diversidad microbiana. El análisis replicado de las secuencias no generó ninguna diferencia significativa.
En la Figura 2 se muestra el mapa de calor basado en la abundancia relativa de las bacterias en diferentes regímenes, desde el mosto de uva hasta el vino. Los filos más dominantes indicados en rojo son Proteobacteria, Actinobacteriota, Firmicutes, Bacteroidota, Fusobacteriota y, seguidos por Verrucomicrobiota, Halobacterota, Desulfobacterota, Myxoococcota, y Acidobacteriota. Las bacterias menos abundantes se indicaron en azul. Muchos de estos grupos estaban presentes en el mosto, cuando se añadía levadura pero ausente durante la fermentación, especialmente Nitrospirota, Bdellovibrionota, Nitrospinota, Armatimonadota, Gemmatimonadota, Chloroflexi, Campilobacterota, Deinococcota, Patescibacteria, Planctomycetota, Abditibacteriota, Crenarchaeota, Spirochaetota, Dependentiae, Thermotogota, Methylomirabilota y Elusimicrobiota. También se determinó la abundancia relativa a nivel de género, y los resultados indicaron géneros importantes como Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae, como se muestra en la Figura 3. Un análisis del diagrama de Venn de la OTU única compartida reveló que 15 bacterias estaban presentes desde el mosto de uva de vino hasta el vino final (Figura 4). Los resultados de la secuenciación del amplicón basada en la región variable V4 también indicaron la diversidad alfa en las dos Traminette R y L. La Figura 4 muestra la uniformidad de la especie como marca de distribución, que es diferente entre los dos tratamientos nutricionales. Los datos mostraron que el cambio de diversidad en el Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O fue menor que 1 a 13.4 brix, y la uniformidad se acerca a cero a medida que varían las abundancias relativas. Los datos también se analizaron para determinar la diversidad beta; La figura 5 muestra la diferencia entre las dos Traminette de fermentación R y L; Las bacterias fueron similares en las etapas de mosto y levadura añadida. Hubo un cambio en las bacterias en la etapa de fermentación para los dos tratamientos, y se ve similar en el vino final (Figura 6).
Figura 1: Gráficos de rarefacción de las OTU observadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Mapa de calor de abundancia relativa. El mapa de calor de la abundancia relativa en los niveles de filo R y L no fue significativamente diferente (p ≤0.05). La barra de leyenda indica la puntuación clave. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Abundancia relativa de los diez taxones principales. La abundancia relativa a nivel de género de los diez taxones principales clasificados por medios con la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (p ≤0.05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Diagrama de Venn. Las bacterias únicas y compartidas entre el mosto, la levadura añadida, la fermentación y el vino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Diversidad alfa de Traminette R y Traminette L. Diversidad alfa del índice H de Shannon de los dos nutrientes Fermaid O y Stimula Sauvignon blanc y Fermaid O (Dunn > 0.05) basado en el análisis de la prueba de Kruskal-Wallis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Análisis de componentes principales. Análisis de componentes principales de los datos de ARNr 16S de diversidad beta basados en Bray-Curtis de los dos nutrientes Fermaid O y Stimula Sauvignon Blanc y Fermaid O en diferentes etapas de la producción de vino. El círculo azul representa un grupo de etapas de adición de mosto y levadura. El círculo rojo indica el vino final y el círculo negro es la etapa de fermentación en los dos tratamientos. Los ejes 1 y 2 son variaciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Fecha de muestreo | Muestra | A260/A280 | Concentración ng/μL Traminette R | A260/A280 | Concentración ng/μL Traminette L |
| 8/30/21 | Uva | 1.762 | 37 | 1.75 | 28 |
| 8/31/31 | Mosto | 1.769 | 23 | 1.818 | 20 |
| 09-02-2021 | Reposo | 1.667 | 15 | -1 | 1 |
| 09-04-2021 | Levadura añadida | 2.185 | 59 | 1.968 | 61 |
| 09-06-2021 | Fermentación | 2.023 | 87 | 2.048 | 43 |
| 09-09-2021 | Fermentación | 3.4 | 17 | 2.048 | 43 |
| 9/14/21 | Vino final | 2.143 | 30 | 2.042 | 49 |
Tabla 1: Cantidad y calidad del ADN extraído del mosto de uva, del vino fermentado y del vino final.
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Discussion
El protocolo de metagenómica parte de la toma de muestras del mosto de uva, y cuando se añade levadura al mosto, la fermentación del vino y las muestras de vino final. A esto le siguió la extracción de ADN duplicado que se extrajo con éxito de estas muestras. Las cantidades obtenidas variaron en concentración desde 15 ng/μL hasta 87 ng/μL. Esto demuestra que el protocolo de extracción de ADN es eficaz para los estudios metagenómicos del vino. Aunque la calidad del ADN en A260/A280 varía, esto puede atribuirse a diferentes parámetros que pueden afectar a la extracción, como la concentración de alcohol y otros metabolitos de la fermentación que se desarrollaron durante y después de la fermentación, así como otros materiales vegetales orgánicos que pueden inhibir la extracción del genoma. Estudios previos han reportado una observación similar en el material vegetal metagenómico27. Sin embargo, el ADN extraído en el protocolo descrito alcanzó una cantidad suficiente para el siguiente paso del análisis. El código de barras de PCR necesario para los estudios metagenómicos, especialmente utilizando la plataforma de secuenciación Illumina, requiere que la cantidad mínima de ADN se establezca en 1 ng/L. Se secuenció la región V4 y la determinación de la diversidad bacteriana requiere el uso de la secuenciación del gen 16S rRNA; este gen tiene regiones variables diferentes de V1-V923. Un total de 6.393.443 lecturas de secuencia de extremos pareados con una media de 399590,1875 ± 138442,6148 del ADN extraído de las diferentes muestras. V4 se ha utilizado comúnmente, y se conoce como la región hipervariable del gen que es buena para el análisis taxonómico y de diversidad bacteriana. Durante la secuenciación, se generaron secuencias pareadas de Illumina de aproximadamente 200-300 pb. Existen diferentes plataformas utilizadas para secuenciar el ADN extraído de alimentos y bebidas fermentadas28. Las razones para utilizar la plataforma Illumina son las siguientes: (1) Illumina es una plataforma de secuenciación de segunda generación de 2ª con un rendimiento excelente, y su química proporciona una baja tasa de error y un perfil. También es asequible en comparación con los kits comerciales disponibles para la preparación de bibliotecas, y sus lecturas relativamente cortas son ideales para la expresión diferencial. El último paso del protocolo fue la bioinformática, un componente importante del uso de la secuenciación del amplicón 16 para la determinación de la diversidad microbiana. El control de calidad de las secuencias obtenidas por el archivo FASTQ fue muy bueno, y las OTUs obtenidas de QIIME dieron como resultado un análisis taxonómico que se muestra en los resultados de abundancia relativa, diversidad alfa y beta.
La secuenciación de nueva generación (NGS) se ha convertido en una herramienta importante para perfilar las bacterias de diferentes comunidades microbianas de fermentación. En este estudio, la clasificación del amplicón 16S se realizó por primera vez a nivel de filo, y se observó un grupo de bacterias más diverso que el reportado anteriormente12 durante la fermentación del vino de uva; También se compartieron 15 filos, como se indica en el análisis del resultado de Venn. Además, el análisis a nivel de género mostró la presencia de géneros importantes, como Enterobacteriaceae y Lactobacillaceae que fueron más abundantes en el tanque Traminette R. Limitamos nuestro análisis a la taxonomía a nivel de género; Hay estudios en los que el método se ha utilizado para la identificación a nivel de especie a través de la inferencia muestral de alta resolución23. Una de las limitaciones de la secuenciación de amplicones es que los datos de la secuencia no pueden determinar la taxonomía a nivel de cepa debido a la corta longitud de la secuencia de ARNr 16S. Otra limitación es la detección de cloroplastos y mitocondrias. Sería deseable que se utilizara el procedimiento bioinformático para eliminar estas secuencias, ya que son contaminantes de las plantas de uva. Sin embargo, el protocolo de amplificación que utiliza pinzas de PNA-ADN para maximizar la contaminación por cloroplastos y mitocondrias29. La alta abundancia de Firmicute en el mosto de uva, durante la fermentación y el vino final, concuerda con los estudios previos sobre uva de vinificación30. Los resultados del análisis de diversidad alfa indicaron la uniformidad bacteriana de cada tratamiento nutricional de fermentación; parece que el nutriente Stimula Sauvignon blanc + Fermaid O generó una bacteria más diversa. Además, los datos de diversidad beta mostraron el cambio en las bacterias en la etapa de fermentación; Los cambios dinámicos indican que la etapa de fermentación es un período muy importante donde los cambios nutricionales afectan la selección bacteriana. La técnica puede ser adaptada y utilizada por las industrias para controlar la fermentación y mejorar la calidad y la consistencia28. Sin embargo, se necesitarán más estudios para comprender mejor el impacto de los nutrientes orgánicos en la diversidad microbiana durante la fermentación del vino.
Este estudio es el primero en examinar la diversidad bacteriana durante la fermentación de las uvas y el vino Traminette utilizando la secuenciación del código de barras amplicón 16S para determinar los cambios bacterianos. Esto confirmó la diversidad de bacterias a nivel de filo y género. Las Proteobacterias, seguidas de las Firmicutes, fueron las más abundantes a medida que avanzaba la fermentación hasta el vino final. Muchos filos que no se habían reportado previamente se detectaron utilizando la secuenciación del amplicón 16S, y esto confirmó que el método se puede utilizar para monitorear la producción de vino. La diversidad alfa mostró el papel del cambio nutricional; Afectó a las bacterias de fermentación, mientras que la diversidad beta indica los cambios durante la etapa de fermentación. Se necesitan más estudios para investigar el papel funcional que desempeñan muchos de los filos y géneros descritos en la fermentación del vino.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Se agradece la financiación de la beca del Consejo de Investigación de la Universidad Estatal de los Apalaches (URC) y la beca CAPES Print Travel que apoyó la visita de la FAO a la Universidad de São Paulo, Ribeirão Preto - São Paulo, Brasil. Este estudio fue financiado en parte por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Finanzas 001. ECPDM agradece la beca CAPES Print Travel que apoyó su visita a la Universidad Estatal de los Apalaches. ECPDM es becaria 2 del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasil (CNPq).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel | Promega, Madison, WI USA | V3121 | Electrophoresis |
| FastPrep DNA spinKit for soil | MP Biomedicals, Solon, OH USA | 116560-200 | DNA extraction |
| FastQC software | Babraham Institute, United Kingdom | Bioinformatics | |
| Fermaid O | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation | |
| High-Fidelity PCR Master Mix | New England Biolabs, USA | F630S | Polymerase chain reaction for sequencing |
| NEBNext Ultra | New England Biolabs, USA | NEB #E7103 | DNA Library Prep |
| NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| NovaSeq Control Software (NVCS) | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| Novaseq6000 platform | Illumina, San Diego, CA USA | DNA sequencing | |
| QuiBit | Thermoscientific, Waltham, MA, USA | DNA quantification | |
| Quickdrop spectrophotometer | Molecular device, San Jose, CA, USA | DNA quantification | |
| Sodium Phosphate | Sigma Aldrich | 342483 | DNA extraction buffer |
| Stimula Sauvignon Blanc | Scott Laboratory, Petaluma, CA USA | Fermentation |
References
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