Summary
De hier gepresenteerde experimentele opzet biedt een bruikbaar voortplantingsmodel voor de studies van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens lymfekliermetastase (LN), waarbij de verstoring van CD8+ T-cellen van omstanders wordt uitgesloten.
Abstract
Tumorantigeenspecifieke CD8+ T-cellen uit drainerende lymfeklieren krijgen een accumulerend belang bij het opbouwen van een antitumor-immuunrespons tijdens tumorigenese. In veel gevallen vormen kankercellen echter metastatische loci in lymfeklieren voordat ze verder uitzaaien naar verre organen. In hoeverre de lokale en systematische CD8+ T-celresponsen werden beïnvloed door LN-metastasen blijft onduidelijk. Hiertoe hebben we een LN-metastasemodel bij muizen opgezet in combinatie met een B16F10-GP-melanoomcellijn die het surrogaatneoantigeen dat is afgeleid van het lymfatische choriomeningitisvirus (LCMV), glycoproteïne (GP) en P14-transgene muizen die T-celreceptoren (TCR's) herbergen die specifiek zijn voor GP-afgeleid peptide GP33-41 , gepresenteerd door het klasse I major histocompatibility complex (MHC)-molecuul H-2Db. Dit protocol maakt het mogelijk om antigeenspecifieke CD8+ T-celresponsen te bestuderen tijdens LN-metastase. In dit protocol werden C57BL/6J-muizen subcutaan geïmplanteerd met B16F10-GP-cellen, gevolgd door adoptieve overdracht met naïeve P14-cellen. Toen de onderhuidse tumor groeide tot een diameter van ongeveer 5 mm, werd de primaire tumor weggesneden en werden B16F10-GP-cellen rechtstreeks in de tumordrainerende lymfeklier (TdLN) geïnjecteerd. Vervolgens werd de dynamiek van CD8+ T-cellen gevolgd tijdens het proces van LN-metastase. Gezamenlijk heeft dit model een benadering geboden om de antigeenspecifieke CD8+ T-cel-immuunresponsen tijdens LN-metastase nauwkeurig te onderzoeken.
Introduction
Kankerimmunotherapie, met name de immuuncheckpointblokkade (ICB), heeft een revolutie teweeggebracht inkankertherapie. ICB blokkeert de co-remmende immunoreceptoren (zoals PD-1, Tim-3, LAG-3 en TIGIT), die sterk tot expressie komen in uitgeputte CD8+ T-cellen in de tumormicro-omgeving (TME), wat leidt tot de revitalisering van uitgeputte CD8+ T-cellen2. Gezien de heterogeniteit van uitgeputte CD8+ T-cellen, bleek uit het verzamelen van bewijs dat tumorspecifieke CD8+ T-cellen afkomstig uit de periferie, inclusief drainerende lymfeklieren (dLN), maar niet in TME, de werkzaamheid van ICB 3,4,5,6,7,8 mediëren. Onlangs werd bevestigd dat van TdLN afgeleide TCF-1+TOX-tumorspecifieke geheugen-CD8+ T-cellen (TdLN-TTSM) de echte responders op ICB zijn, die verschillende functionele eigenschappen van conventionele geheugen-T-cellen belichamen en verder kunnen uitbreiden en differentiëren tot uitgeputte cellen van het nageslacht bij ICB-behandeling9. Al met al bevestigden deze bevindingen het belang van LN bij het opbouwen van antitumorimmuniteit.
Lymfeklieren fungeren als een kritieke plaats bij het vergemakkelijken van de priming en activering van tumorspecifieke CD8+ T-cellen door zowel structurele basis als biologische signalen te leveren10. Verschillende soorten kankercellen zaaien vaak schildwachtklieren (SLN, de eerste LN die een primaire tumor afvoert) voordat ze systematisch worden verspreid11. De aanwezigheid van SLN-metastase is gekoppeld aan een slechte uitkomst bij kanker bij de mens en preklinische modellen toonden aan dat tumorcellen in TdLN zich konden verspreiden naar verre organen via zowel de lymfevaten als de bloedvaten van de knoop 12,13,14,15. SLN-biopsie vertegenwoordigt nu een standaardprocedure om latere behandelingsbeslissingen te begeleiden bij veel solide tumortypes, waardoor onnodige resectie van niet-betrokken LN16,17 zou kunnen worden voorkomen. Zelfs voor de betrokken LN blijft het controversieel of en wanneer chirurgische resectie nodig is, aangezien verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat de verwijdering van regionale LN geen verbeterde algehele overleving vertoonde in vergelijking met degenen die bestraling of systemische therapie kregen zonder regionale LN-resectie18,19. Een interpretatie is dat gemetastaseerd LN (mLN) met microscopische ziekte enig vermogen kan behouden om immuuncellen op te voeden en enkele therapeutische voordelen te bieden. Het is dus van cruciaal belang om op te helderen hoe LN-metastase de antitumor-immuunrespons beïnvloedt, met name de eigenschappen en functies van TdLN-TTSM.
Tot nu toe hebben zowel preklinische als klinische gegevens enkele structurele en cellulaire veranderingen in mLN20 aan het licht gebracht. De dynamische veranderingen van tumorspecifieke CD8+ T-cellen tijdens LN-metastasen zijn echter niet afgebakend. Daarom is het ontwikkelen van een overtuigend model van LN-metastase nodig voor verder onderzoek. Inderdaad, verschillende studies hebben mLN-muismodellen op verschillende manieren gerapporteerd 14,21,22. Spontane metastase in axillaire LN's werd bijvoorbeeld uitgevoerd door de implantatie van 4T1-borstkankercellen in het borstvetkussen22. In een andere studie genereerden Reticker-Flynn et al. melanoomcellijnen met een hoge incidentie van verspreiding van onderhuidse primaire tumor naar LN's door seriële inoculatie van tumorcellen gekweekt uit gedissocieerde mLN-weefsels (negen rondes)14. Een ander veelgebruikt model werd bereid door de injectie van tumorcellen in de voetzool en de gemetastaseerde loci zouden worden gevormd in popliteale LN22. Het is met name moeilijk om de precieze tijdstippen van interventie te evalueren, omdat de LN-metastase in deze modellen niet altijd trouw is.
In de huidige studie werd een LN-metastatisch model bij muizen opgesteld door de intranodale injectie van B16F10-GP-cellen23,24, gegenereerd door CRISPR/Cas9-gemedieerde insertie van de gensequentie van het LCMV-virusglycoproteïne (GP) in het genoom van B16F10-cellijn9. Vervolgens werden deze muizen overgebracht met P14-cellen die transgene T-celreceptoren (TCR's) herbergen, die specifiek het H-2Db GP33-41 epitoop25,26 herkennen en de systemische en lokale dynamiek van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens LN-metastasen kon worden onderzocht. Onze experimentele opzet biedt een bruikbaar model voor de studie van immuunresponsen, met name de antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens de LN-metastase, die de verstoring van CD8+ T-cellen van omstanders uitsluit. Deze resultaten zouden van invloed zijn op de klinische behandelingsopties voor het verwijderen of behouden van het mLN en een nieuw licht werpen op de manipulatie van mLN om maximale therapeutische voordelen te bereiken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De C57BL/6J-muizen (aangeduid als B6-muizen) en naïeve P14-transgene muizen 9,27 die werden gebruikt, waren 6-10 weken oud en wogen 18-22 g. Zowel mannen als vrouwen werden geïncludeerd zonder randomisatie of blindering. Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Qingdao Agricultural University.
1. Bereiding van medium en reagentia
- Bereid B16F10-GP melanoomcelkweekmedium, genaamd D10 (compleet DMEM-medium) door DMEM, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline/streptomycine, 1% L-glutamine met een extra 100 E/ml puromycine toe te voegen. Zorg voor een steriele D10 en bewaar maximaal 2 weken bij 2-4 °C.
- Bereid R2-medium (voor beëindiging van de lysis van rode bloedcellen) voor door RPMI-1640 toe te voegen met 2% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 1% L-glutamine.
- Bereid de fluorescentie-geactiveerde celsorteringsbuffer (FACS) voor door 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe te voegen met 2% FBS en 0,01% natriumazide. De toevoeging van natriumazide kan de bewaartijd van FACS-buffer verlengen, die maandenlang bij 2-4 ° C kan worden bewaard.
- Bereid de rode bloedcellysebuffer (RBL) voor door 155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3 en 0,1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe te voegen aan dubbel gedestilleerd water en pas de pH aan op 7,3. Bewaar RBL-buffer bij kamertemperatuur (RT) en deze blijft tot 3 maanden stabiel.
- Bereid de verdoving voor, 2,2,2-tribroomethanol, zoals hieronder beschreven.
- Weeg de juiste hoeveelheid 2,2,2-tribroomethanolkristal af in een steriele conische buis van 50 ml omwikkeld met aluminiumfolie. Voeg de juiste hoeveelheid 2-methyl-2-butanol toe aan het kristal om de stockoplossing te bereiden met een concentratie van 500 mg/ml.
- Draai het om te mengen en verwarm de buis in een waterbad van 37 °C tot het kristal is opgelost. Zorg ervoor dat alle kristallen zijn opgelost.
- Meng de oplossing grondig. Filtreer de stockoplossing met een filter van 0,22 μm in een steriele container. Bewaar de stockoplossing bevroren, afgeschermd van licht, bij -20 °C of verdun met PBS tot een werkoplossing met een concentratie van 12,5 mg/ml en bewaar bij 4 °C.
NOTITIE: Het is het beste om de voorgeschreven concentratie te gebruiken, omdat hogere concentraties van de vloeistof irriterend zijn.
2. Bereiding van B16F10-GP-celsuspensie
- Ontdooi en kweek een injectieflacon met 1 x 106 B16F10-GP-cellen met 5 ml D10 in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2. Subcultuurcellen wanneer ze een dichtheid van 80% tot 90% bereikten, zoals hieronder beschreven.
- Gooi het oorspronkelijke kweekmedium weg door aspiratie met een pipetteerpistool en was de cellen 2x met PBS. Wanneer u aanhangende cellen reinigt met PBS in een celkweekschaaltje, verplaatst u het PBS naar de zijwand of laat u het in het schaaltje vallen.
- Voeg na aspiratie van PBS 0,5-1 ml 0,25% trypsine EDTA-oplossing toe aan de celkweekschaal of kolf. Schud voorzichtig om het hele celoppervlak te bedekken. Plaats de celkweekschaal of -kolf ongeveer 1 minuut in een incubator bij 37 °C of bij RT totdat de cellen afgerond en gescheiden zijn. Observeer exfoliatie van cellen met behulp van een omgekeerde microscoop.
- Voeg een gelijk volume vers geformuleerde D10 toe om de vertering van trypsine te beëindigen. Spoel het onderste oppervlak van de celkweekkolf door met een pipetteerpistool om ervoor te zorgen dat alle cellen gescheiden zijn.
- Breng de B16F10-GP-celsuspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 4 minuten bij RT op 163 x g .
- Aspireer het supernatans op en gooi het weg. Resuspendeer de cellen in 1-2 ml D10 voor neerslag. Breng de B16F10-GP-celsuspensie over in een nieuwe celkweekschaal of -kolf met 8-10 ml D10 en incubeer vervolgens in een celincubator bij 37 °C bij 5% CO2.
- Verzamel op de dag van tumorimplantatie B16F10-GP-cellen met een dichtheid van ongeveer 90%, zoals beschreven in stap 2.1.1 tot 2.1.4. Zuig na het centrifugeren het supernatans op en gooi het weg. Resuspendeer de celneerslag in 1 ml PBS.
- Tel levensvatbare cellen met behulp van een 0,4% trypan blauwe hemocytometer. Voeg PBS toe om de cel te verdunnen tot 5 x 105 cellen per 100 μL. Leg de cellen tot gebruik op ijs.
3. Buitenbaarmoederlijke inoculatie van B16F10-GP-cellen in het bilaterale liesgebied van muizen
- Zuig 100 μL bereide B16F10-GP-celsuspensie op met behulp van een spuit van 1 ml. Draai tegen de buiswand om de luchtbellen naar boven te verplaatsen en duw op de zuiger om de bovenste luchtbel naar buiten te verplaatsen.
- Houd de muis in rugligging en laat zijn buik zien. Druk met een vinger op de rechter achterpoot van de muis in rugligging zodat de huid in de rechter liesstreek volledig bloot komt te liggen (hetzelfde geldt voor de linker liesstreek).
- Verwijder de vacht op de buik met ontharingscrème en reinig vervolgens de bilaterale buik met katoen dat 75% ethanol bevat.
- Voordat u de naald inbrengt, moet u ervoor zorgen dat de huid in de liesstreek strakker is. Steek de naald in een hoek van 45° in de onderhuidse ruimte van de liesstreek van het bovenbeen. Zorg ervoor dat de naald naar boven is afgeschuind en de diepte van de naald tot 0.5-1 cm.
- Pas voorzichtige afzuiging toe vóór de injectie, als er geen bloed is, injecteer dan de cellen die langzaam in het onderhuidse weefsel worden geïnjecteerd. Observeer tegelijkertijd een kleine bolus (vorming van een vloeistofzak) in het onderhuidse gebied.
- Verwijder na de injectie de naald, plaats deze in de naaldendoos en plaats de muis terug in zijn kooi.
4. Adoptieve overdracht van P14 T-cellen naar tumordragende muizen
- Voer adoptieve overdracht uit bij tumordragende muizen 6-8 dagen na tumorimplantatie, wanneer de tumoren voelbaar zijn (ongeveer 3-5 mm in diameter). Intraperitoneaal injecteren 4 mg cyclofosfamide de dag voor overdracht 28,29,30.
OPMERKING: Het doel van CTX-injectie is om ruimte te creëren in het lymfecompartiment voor adoptief overgedragen T-cellen door prolifererende lymfocyten tijdelijk te elimineren. - Isoleer lymfocyten uit de milt en LN's van naïeve P14 transgene muizen zoals hieronder beschreven31,32 (6-10 weken oud, hetzelfde geslacht als tumordragende muizen om afstotingsproblemen te voorkomen).
NOTITIE: Voer de volgende procedures uit in een bioveiligheidskast om strikt steriele omstandigheden te garanderen.- Zet twee schaaltjes van 6 cm klaar en voeg 3 ml R2 medium toe aan een van de schaaltjes en 3 ml RBL buffer aan het andere schaaltje. Plaats een celfilter van 70 μm in de petrischaal met RBL-buffer.
- Euthanaseer P14-muizen in luchtdichte containers die isofluraan bevatten, gevolgd door cervicale dislocatie. Pas het aantal P14-muizen aan op basis van het aantal ontvangende muizen.
- Oogst de milt-, lies- en oksellymfeklieren van de geëuthanaseerde muizen en breng ze over naar schalen van 6 cm met 4 ml R2-medium en plaats ze op ijs.
- Plaats de milt in een zeef gedrenkt in 3 ml RBL-buffer, maal de milt met de putter in de spuit van 1 ml. Incubeer de cellen gedurende 1-2 minuten bij RT en beëindig de reactie vervolgens met 3 ml koud R2-medium.
- Vermaal de LN's met de putter in de spuit van 1 ml totdat er alleen bindweefsel in de zeef met een celfilter van 70 μm achterblijft. Spoel het filter af met koud R2-medium en breng de celsuspensie over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer de monsters bij 500 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C.
- Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen met 3 ml PBS. Gebruik een celfilter van 70 μm om vlokkig materiaal uit de celsuspensie te verwijderen.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 6 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen met 3 ml PBS en plaats de buis op ijs. Neem een klein monster, meng met trypanblauw en tel de cellen met behulp van een bloedceltelplaat.
- Bepaal het percentage P14-cellen (levend/dood-CD45.1+CD8+Vα2+) door middel van flowcytometrie. Zorg ervoor dat de overgedragen donorcellen een duidelijke congene marker vertonen met ontvangende muizen (tumordragende B6-muizen zijn CD45.2+). Voer kleuring uit voorafgaand aan de overdracht om het juiste fenotype van de overgebrachte cellen te verifiëren.
- Voeg 5 x 104- 1 x 105 cellen toe aan een centrifugebuis van 1,5 ml met 1 ml FACS-buffer. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g bij 4 °C gedurende 3 min.
- Gooi het supernatant weg, tik op de bodem van de buis om de cellen te verspreiden en plaats de buis op ijs.
- Bereid het volgende geconjugeerde antilichaammengsel 9,32 verdund in 100 μL FACS-buffer: anti-CD8, 1:200; anti-TCR Vα2, 1:100; anti-CD45.1, 1:200; Levende/dode vlek, 1:400. (Tabel met materialen).
- Centrifugeer het antilichamenmengsel gedurende 3 minuten bij 15.000 x g om de deeltjes samen te voegen. Leg het mengsel op ijs en bescherm het tegen licht door het in folie te wikkelen. Neem alleen het supernatans om het opzuigen van deeltjes te voorkomen.
- Resuspendeer de cellen in 100 μL van het antilichaammengsel en meng grondig door op de buiswand te tikken. Na het wikkelen in aluminiumfolie, incubeer je de buis gedurende 30 minuten op ijs.
- Was de cellen 2x met FACS buffer. Centrifugeer de buis bij 500 x g bij 4 °C gedurende 3 min. Resuspendeer de cellen met 200 μL FACS-buffer en breng de celsuspensie over naar een stroombuis.
- Laat de stroombuis met gekleurde cellen op een flowcytometer lopen om het percentage levende/dode-CD45.1+CD8+Vα2+-cellen te bepalen.
OPMERKING: Over het algemeen herbergde meer dan 90% van de CD8+ T-cellen van P14-transgene muizen Vα2+TCR's, die specifiek zijn voor H-2Db GP33-41-epitoop van LCMV (lymfocytisch choriomeningitisvirus).
- Bereken het absolute aantal levende/dode-CD45.1+CD8+Vα2+-cellen door het percentage te vermenigvuldigen met het aantal levende cellen dat is verkregen in de stappen 4.2 en 4.3.
- Zuig 200 μL P14-cel (5 x 105 cellen) suspensie op met een insulinespuit van 100 U en verwijder belletjes. Het aanvankelijke aantal getransfereerde naïeve P14-cellen (5 x 103 - 5 x 105) had geen invloed op het fenotype van de getransfereerde cellen9.
- Plaats de muizen in een kooi en verwarm ze 5-10 minuten met een infraroodlamp om de staartader uit te zetten. Houd op zijn plaats met een muisfixator van de juiste grootte, maak de staart recht en veeg deze af met een watje dat 75% ethanol bevat om de aderen zichtbaar te maken.
- Steek de naald evenwijdig aan de staartader en trek de zuiger voorzichtig terug. Als er bloed in de spuit stroomt, duw dan langzaam de celsuspensie in de ader.
OPMERKING: Als er tijdens de injectie weerstand of zwelling van de staart is, moet de injectiepositie worden aangepast. De injectieplaats moet beginnen aan het distale uiteinde. - Nadat de injectie is voltooid, trekt u de naald er snel uit en drukt u zachtjes met een watje op de injectieplaats. Plaats de muis terug in een nieuwe schone kooi en observeer hem enkele minuten nauwkeurig op eventuele bijwerkingen.
5. Resectie van de primaire tumor
NOTITIE: Zorg ervoor dat alle chirurgische instrumenten voor gebruik zijn geautoclaveerd. Steriliseer het operatiegebied in de bioveiligheidskast met 75% ethanol, gevolgd door UV-straling gedurende ten minste 30 minuten. Draag schone jassen, hoeden, maskers en steriele handschoenen tijdens de operatie.
- Wanneer de tumor voelbaar is (ongeveer 5 mm in diameter), verwijdert u de primaire tumor.
- Verdoof de muizen met intraperitoneale injectie van ketamine (75 mg/kg). Knijp in het voetkussen om de mate van anesthesie te evalueren, als er geen pijnreflex is, geeft dit de juiste timing voor de operatie aan. Als de achterpoten zijn teruggetrokken, geef dan nog een dosis van 10-30 μL.
OPMERKING: Als alternatief, intraperitoneale medetomidine (1 mg/kg lichaamsgewicht; Domitor) wordt aanbevolen om muizen te verdoven. - Breng de uitdrogende preventieve zalf aan op muizenogen. Verwijder de vacht op de buik met ontharingscrème om het operatieveld volledig bloot te leggen.
- Plaats de muis in een bioveiligheidskast en plaats deze op een anatomisch bord bedekt met schoon absorberend papier in rugligging, zodat de lengteas van de muis evenwijdig is aan de experimentator.
NOTITIE: Om een strikt steriele omgeving te behouden, moeten de volgende procedures worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. - Desinfecteer de buik van de muizen met een watje gedrenkt in povidonjodium. Snijd de huid in de buurt van de tumordragende plaats in met een steriel scalpel of een oogheelkundige schaar. Steek de gesloten schaarpunt in de incisie om de tumor duidelijk bloot te leggen. Let er bij het insnijden van de huid op dat u de lieslymfeklieren niet beschadigt.
- Houd tijdens het verwijderen van de tumor de capsule zo intact mogelijk. Verwijder voorzichtig en voorzichtig het bindweefsel naast de tumor met een steriele schaar. Verwijder de tumor in situ volledig, anders kan deze terugkeren.
6. Intranodale injectie van B16F10-GP-cellen in de lieslymfeklier
OPMERKING: Na bilaterale tumorklaring werden B16F10-GP-cellen geïnjecteerd in de unilaterale lieslymfeklier en werd PBS in de andere kant geïnjecteerd.
- Zuig 20 μL (5 x 104 cellen) B16F10-GP-celsuspensie op met een insulinespuit van 100 E, verwijder belletjes en injecteer vervolgens in één lieslymfeklier. Injecteer een gelijk volume PBS in de lieslymfeklier aan de andere kant.
- Breng tijdens de injectie de naald in vanaf het distale uiteinde van de lymfeklier en steek de naald vervolgens langzaam in het midden van de lymfeklier. Op dit moment, als de vloeistof nauwkeurig in de lymfeklier wordt geïnjecteerd, kan worden gezien dat de lymfeklier aanzienlijk opzwelt.
NOTITIE: Wanneer de naald vanaf het distale uiteinde van de lymfeklier wordt ingebracht, zorg er dan voor dat u de knoop niet doorboort.
- Breng tijdens de injectie de naald in vanaf het distale uiteinde van de lymfeklier en steek de naald vervolgens langzaam in het midden van de lymfeklier. Op dit moment, als de vloeistof nauwkeurig in de lymfeklier wordt geïnjecteerd, kan worden gezien dat de lymfeklier aanzienlijk opzwelt.
- Hecht de incisie met 2-3 hechtingen met een 3-0 hechtdraad. Desinfecteer de huid rond de wond met katoen geïmpregneerd met povidonjodium. Zorg ervoor dat u de lymfeklieren omzeilt tijdens het hechten.
- Plaats de muis in een schone kooi en houd hem warm met behulp van infrarood licht in de laterale decubituspositie. Houd continu in de gaten totdat het bewustzijn is hersteld. Zorg ervoor dat de muizen die een operatie hebben ondergaan, niet worden teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren totdat ze volledig hersteld zijn.
- Geef buprenorfine elke 4-6 uur gedurende 3 opeenvolgende dagen na de operatie om postoperatieve pijn te verlichten (in een dosis van 0,1-0,5 mg/kg, SQ of IP). Houd de voedings-, drink-, bewegings- en activiteitsgebieden van de muizen in de gaten. Meestal herstellen muizen binnen 3 dagen van een chirurgisch trauma.
OPMERKING: Als muizen niet in staat zijn om de normale voeding en activiteiten te hervatten en tekenen van infectie vertonen, raadpleeg dan een dierenarts voor interventie of euthanaseer het. - Offer muizen op verschillende tijdstippen: dag 8 en dag 18 na intranodale injectie van tumorcellen. Herstel geactiveerde donorcellen met behulp van flowcytometrie-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het schematische diagram van deze experimentele opzet is weergegeven in figuur 1A. In totaal werden 5 x 105 B16F10-GP-cellen in 100 μL PBS subcutaan (s.c.) geïmplanteerd in het bilaterale liesgebied van CD45.2 C57BL/6J-muizen. Na 7 dagen werden deze tumordragende muizen intraperitoneaal (i.p.) geïnjecteerd met 4 mg CTX, gevolgd door de adoptieve overdracht van 5 x 105 CD45.1+P14-cellen via staart intraveneuze (i.v.) injectie. Toen tumoren groeiden tot ongeveer 3-5 mm in diameter (ongeveer 7 dagen na overdracht van P14-cellen), werden primaire tumoren verwijderd en werden 5 x 104 B16F10-GP-cellen in 20 μL PBS rechtstreeks geïnjecteerd in unilaterale lieslymfeklieren. De lieslymfeklier aan de andere kant werd geïnjecteerd met gelijke volumes PBS. Representatieve hematoxyline- en eosinekleuring (H&E, 100x) van de niet-gemetastaseerde lymfeklier (nLN) en gemetastaseerde lymfeklier (mLN) op aangegeven tijdstippen worden weergegeven in figuur 1B. De structuur van nLN was intact. In het vroege stadium van LN-metastase (D8) was mLN gedeeltelijk bezet met tumorcellen (zwarte pijl), en er is nog steeds een resterend gebied met lymfocyten die niet zijn binnengedrongen door tumorcellen (rode pijl). In het late stadium van LN-metastase (D18) is mLN gevuld met tumorcellen die gepaard gaan met tumorangiogenese en kleine lymfocyten. Geactiveerde P14-cellen die in TdLN werden teruggevonden, produceerden een hoog niveau van IFN-γ na GP33-41 peptidestimulatie 9,31. Hier werden de percentages geactiveerde P14-cellen geanalyseerd door middel van flowcytometrie op verschillende tijdstippen en de poortstrategie wordt weergegeven in figuur 2. De frequentie van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in perifeer bloed in het vroege stadium (D8) en het late stadium (D18) is respectievelijk 2,81% en 1,48% (Figuur 3A). Van tumorspecifieke CD8+ T-cellen is gemeld dat ze zich tijdens het ontstaan van de tumor strikt in dLN bevinden en dat niet-drainerende LN beperkte donorcellen herstelde33. Het percentage antigeenspecifieke P14-cellen in nLN was stabiel tijdens LN-metastase. Intrigerend is dat antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in mLN in het vroege stadium tijdelijk werden gestimuleerd, wat blijkt uit de hogere frequentie van P14-cellen in vergelijking met nLN, terwijl deze in het late stadium sterk afnam (Figuur 3B).
Figuur 1: Schematisch diagram van de experimentele opzet. (A) C57BL/6J-muizen (CD45.2+) worden geïmplanteerd met 5 x 105 B16F10-GP-tumorcellen op het bilaterale liesgebied. Na 7 dagen worden deze muizen intraperitoneaal geïnjecteerd met 4 mg CTX, gevolgd door de adoptieve overdracht van verschillende congenically marked (CD45.1+) P14-cellen de volgende dag. Wanneer tumoren groeien tot een diameter van ongeveer 3-5 mm (ongeveer 7 dagen na overdracht van P14-cellen), worden primaire tumoren verwijderd, vervolgens worden 5 x 104 B16F10-GP-cellen in 20 μL PBS rechtstreeks geïnjecteerd in unilaterale inguinale lymfeklier en wordt de inguinale lymfeklier aan de andere kant geïnjecteerd met gelijke volumes PBS. (B) Representatieve hematoxyline- en eosinekleuring (H&E,100x) van de LN's. Afkortingen: s.c. = subcutaan; CTX= cyclofosfamide; i.v. = intraveneus; Sac = offer; nLN = niet-gemetastaseerde LN; mLN = gemetastaseerd LN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Poortstrategie voor flowcytometrie-analyse. Gating-strategie die wordt gebruikt om van donoren afgeleide geactiveerde antigeenspecifieke CD8+ T-cellen te identificeren. Afkortingen: L/D = levend/dood. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Dynamiek van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens LN-metastase. Het aandeel antigeenspecifieke CD8+ T-cellen in (A) perifeer bloed, (B) nLN en mLN op verschillende tijdstippen. Afkortingen: nLN = niet-gemetastaseerde LN; mLN = gemetastaseerd LN. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tijdens tumorigenese overspoelen antigeenpresenterende cellen (APC's) tumorantigenen en migreren naar TdLN waar ze CD8+ T-cellen primen. Na priming en activering verlaten CD8+ T-cellen het TdLN en infiltreren de tumor om tumorcellen te doden10. Door middel van TdLN-resectie en de toediening van FTY720, die de uitgang van immuuncellen uit de lymfoïde organen blokkeren, hebben verschillende onderzoeken de cruciale rol van TdLN aangetoond bij het waarborgen van de werkzaamheid van PD-1/PD-L1-checkpointtherapie34,35. In overeenstemming hiermee hebben we onlangs ontdekt dat tumorspecifieke geheugen-CD8+ T-cellen (TTSM) zich voornamelijk in TdLN bevinden, deze TdLN-TTSM-cellen dienen als bonafide responders op ICB9. Helaas verspreiden verschillende soorten kankercellen zich vaak naar TdLN's vanaf primaire tumorplaatsen, wat leidt tot structurele herbevestiging en disfunctie van immuuncellen in TdLN's. De verminderde kwantiteit en kwaliteit van CD8+ T-cellen in mLN's is al beschreven20,36. De dynamische veranderingen van CD8+ T-cellen, met name de tumorantigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens de LN-metastatische cascade, zijn echter niet opgehelderd.
Hier ontwikkelden we een handig muismodel om de dynamiek van systemische en lokale antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens het proces van LN-metastase te monitoren. B16F10-GP-melanoomcellen werden subcutaan geïmplanteerd in het bilaterale liesgebied, gevolgd door adoptieve overdracht met P14-cellen die specifiek konden worden geactiveerd door het van de GP afgeleide peptide GP33-41. Op dag 7 na celoverdracht, toen P14-cellen in liesachtige LN's volledig werden geactiveerd, primaire tumoren aan beide zijden werden verwijderd en B16F10-GP-cellen direct werden geïnjecteerd in unilaterale inguinale LN, werd een schijnoperatie aan de andere kant uitgevoerd door de injectie met gelijke volumes PBS. Dit ingenieuze ontwerp maakt het mogelijk om P14-cellen in mLN te vergelijken met niet-gemetastaseerde LN (nLN) binnen dezelfde muizen. Tegelijkertijd werden P14-cellen in periferiebloed in dezelfde muizen op verschillende tijdstippen tijdens LN-metastase gedetecteerd door de orbitale ader te bloeden. Afgezien van de frequenties van P14-cellen in periferiebloed en TdLN's in verschillende stadia tijdens LN-metastase, kunnen de transcriptionele en epigenetische eigenschappen van deze antigeenspecifieke CD8+ T-cellen verder worden onderzocht met andere technieken.
Houd er rekening mee dat verschillende stappen voorzichtig moeten worden uitgevoerd. Ten eerste moeten de primaire tumoren grondig worden weggesneden, omdat de resterende tumorcellen snel opnieuw zouden groeien. Ten tweede moet de operatie voorzichtig worden uitgevoerd, omdat tumorweefsels overvloedige nieuwe bloedvaten bevatten die meestal onvermijdelijk worden gebroken tijdens primaire tumorresectie en leiden tot de dood van chirurgische muizen als gevolg van massale bloedingen. Daarom is de timing van primaire tumorresectie van cruciaal belang. Over het algemeen is het relatief veilig om het te verwijderen wanneer de tumor ongeveer 5 x 5 mm groot wordt, en tumorcellen moeten nauwkeurig in LN worden geïnjecteerd in plaats van in de onderste of aangrenzende weefsels. Bovendien moet het volume van tumorcelsuspensies onder de 20 μL worden gehouden, anders zou morsen een nieuwe tumor buiten het LN vormen. Ten slotte is een beperking van dit protocol dat de operatie traumatisch is en dat muizen tijdens het genezingsproces een infectie kunnen ervaren, wat de eigenschappen van antigeenspecifieke CD8+ T-cellen zou beïnvloeden. Daarom is het van cruciaal belang om tijdens de operatie strikte asepsis te handhaven en moet een schijn-geopereerde PBS-injectie worden uitgevoerd om de impact van door injectie veroorzaakte fysieke schade aan de antigeenspecifieke CD8+ T-cellen uit te sluiten.
Over het algemeen bieden we een handig model om de antigeenspecifieke CD8+ T-cellen tijdens LN-metastasen te onderzoeken en de interacties tussen antigeenspecifieke CD8+ T-cellen en andere immuuncellen of stromacellen tijdens LN-metastasen kunnen ook worden opgehelderd. Bovendien kan het gemakkelijk worden uitgebreid naar verschillende andere tumormodellen. Gezamenlijk biedt dit protocol een bruikbaar voortplantingsmodel voor de studie van kankerimmunologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation for Outstanding Young Scholars of China (nr. 82122028 tot LX), de National Natural Science Foundation of China (nr. 82173094 tot LX), Natural Science Foundation of Chong Qing (nr. 2023NSCQ-BHX0087 tot SW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tube | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U insulin syringe | BD Biosciences | 320310 | |
| 15 mL conical tube | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 μm nylon cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-mouse CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone:A20 |
| B16-GP cell line | Beijing Biocytogen Co.Ltd, China | Custom | |
| BSA-V (bovine serum albumin) | Bioss | bs-0292P | |
| cell culture dish | BEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifuge | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Cyclophosphamide (CTX) | Sigma | PHR1404 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352052 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | |
| flow cytometer | BD | FACSCanto II | |
| hemocytometer | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD life science | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | |
| needle carrier | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldehyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-mouse TCR Vα2 | BioLegend | 127808 | Clone:B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD8a | BioLegend | 100734 | Clone:53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| sodium azide | Sigma | S2002 | |
| surgical forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| surgical scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| suture thread | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
References
- Morad, G., Helmink, B. A., Sharma, P., Wargo, J. A. Hallmarks of response, resistance, and toxicity to immune checkpoint blockade. Cell. 184 (21), 5309-5337 (2021).
- Korman, A. J., Garrett-Thomson, S. C., Lonberg, N. The foundations of immune checkpoint blockade and the ipilimumab approval decennial. Nat Rev Drug Discov. 21 (7), 509-528 (2022).
- Chamoto, K., et al. Mitochondrial activation chemicals synergize with surface receptor PD-1 blockade for T cell-dependent antitumor activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (5), E761-E770 (2017).
- Spitzer, M. H., et al. Systemic immunity is required for effective cancer immunotherapy. Cell. 168 (3), 487-502 (2017).
- Yost, K. E., et al. Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade. Nat Med. 25 (8), 1251-1259 (2019).
- Wu, T. D., et al. Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response. Nature. 579 (7798), 274-278 (2020).
- Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like cd8(+) t cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836 (2021).
- Schenkel, J. M., et al. Conventional type I dendritic cells maintain a reservoir of proliferative tumor-antigen specific Tcf-1+ CD8+ T cells in tumor-draining lymph nodes. Immunity. 54 (10), 2338-2353 (2021).
- Huang, Q., et al. The primordial differentiation of tumor-specific memory cd8(+) t cells as bona fide responders to pd-1/pd-l1 blockade in draining lymph nodes. Cell. 185 (22), 4049-4066 (2022).
- Kanda, Y., Okazaki, T., Katakai, T. Motility dynamics of T cells in tumor-draining lymph nodes: A rational indicator of antitumor response and immune checkpoint blockade. Cancers (Basel). 13 (18), 4616 (2021).
- Karaman, S., Detmar, M.
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Reticker-Flynn, N. E., et al. Lymph node colonization induces tumor-immune tolerance to promote distant metastasis. Cell. 185 (11), 1924-1942 (2022).
- Leong, S. P., et al. Impact of nodal status and tumor burden in sentinel lymph nodes on the clinical outcomes of cancer patients. J Surg Oncol. 103 (6), 518-530 (2011).
- Lyman, G. H., et al. Sentinel lymph node biopsy for patients with early-stage breast cancer: American society of clinical oncology clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 35 (5), 561-564 (2017).
- Wong, S. L., et al. Sentinel lymph node biopsy and management of regional lymph nodes in melanoma: American society of clinical oncology and society of surgical oncology clinical practice guideline update. Ann Surg Oncol. 25 (2), 356-377 (2018).
- Faries, M. B., et al. Completion dissection or observation for sentinel-node metastasis in melanoma. N Engl J Med. 376 (23), 2211-2222 (2017).
- Giuliano, A. E., et al. Effect of axillary dissection vs no axillary dissection on 10-year overall survival among women with invasive breast cancer and sentinel node metastasis: The ACOSOG Z0011 (alliance) randomized clinical trial. JAMA. 318 (10), 918-926 (2017).
- du Bois, H., Heim, T. A., Lund, A. W. Tumor-draining lymph nodes: At the crossroads of metastasis and immunity. Sci Immunol. 6 (63), eabg3551 (2021).
- An, S., et al. Locally trapping the c-c chemokine receptor type 7 by gene delivery nanoparticle inhibits lymphatic metastasis prior to tumor resection. Small. 15 (9), e1805182 (2019).
- Lee, C. K., et al. Tumor metastasis to lymph nodes requires yap-dependent metabolic adaptation. Science. 363 (6427), 644-649 (2019).
- Buchwald, Z. S., et al. Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy. J ImmunoTher Cancer. 8 (2), e000867 (2020).
- Siddiqui, I., et al. Intratumoral Tcf1+PD-1+CD8+ T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy. Immunity. 50 (1), 195.e10-211.e10 (2019).
- Ashton-Rickardt, P. G., et al. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. Cell. 76 (4), 651-663 (1994).
- Manjunath, N., et al. Effector differentiation is not prerequisite for generation of memory cytotoxic T lymphocytes. J Clin Invest. 108 (6), 871-878 (2001).
- Khan, O., et al. TOX transcriptionally and epigenetically programs CD8+ T cell exhaustion. Nature. 571 (7764), 211-218 (2019).
- North, R. J. Cyclophosphamide-facilitated adoptive immunotherapy of an established tumor depends on elimination of tumor-induced suppressor T cells. J Exp Med. 155 (4), 1063-1074 (1982).
- Maine, G. N., Mule, J. J. Making room for T cells. J Clin Invest. 110 (2), 157-159 (2002).
- Xue, G., et al. Adoptive cell therapy with tumor-specific th9 cells induces viral mimicry to eliminate antigen-loss-variant tumor cells. Cancer Cell. 39 (12), 1610.e9-1622.e9 (2021).
- Prokhnevska, N., et al. CD8+ T cell activation in cancer comprises an initial activation phase in lymph nodes followed by effector differentiation within the tumor. Immunity. 56 (1), 107.e5-124.e5 (2023).
- Wang, L., et al. Tumor transplantation for assessing the dynamics of tumor-infiltrating CD8+ T cells in mice. J Vis Exp. (172), e62442 (2021).
- Liu, Q., et al. Tumor-specific memory cd8(+) t cells are strictly resident in draining lymph nodes during tumorigenesis. Cell Mol Immunol. 20 (4), 423-426 (2023).
- Fransen, M. F., et al. Tumor-draining lymph nodes are pivotal in pd-1/pd-l1 checkpoint therapy. JCI Insight. 3 (23), e124507 (2018).
- Francis, D. M., et al. Blockade of immune checkpoints in lymph nodes through locoregional delivery augments cancer immunotherapy. Sci Transl Med. 12 (563), eaay3575 (2020).
- Garner, H., de Visser, K. E. Immune crosstalk in cancer progression and metastatic spread: A complex conversation. Nat Rev Immunol. 20 (8), 483-497 (2020).
