Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65658
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 1, 1
1Department of Neuroscience, Biomedicine and Movement, University of Verona, 2Laboratory of Molecular Neurovirology, Faculty of Health Science, University of Brasília, 3Viral Pseudotype Unit, Medway School of Pharmacy, Universities of Kent and Greenwich at Medway
* These authors contributed equally

Summary

וירוסים מדומים (PVs) הם נגיפים פגומים בשכפול המשמשים לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בתנאים בטוחים יותר מאשר טיפול בנגיפים אותנטיים. מוצג כאן פרוטוקול מפורט המראה כיצד ניתן להשתמש ב- SARS-CoV-2 PVs כדי לבדוק את יכולת הנטרול של נסיוב החולים לאחר חיסון COVID-19.

Abstract

וירוסים מדומים (PVs) הם כלים מולקולריים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור אינטראקציות בין וירוס מארח ולבדוק את יכולת הנטרול של דגימות בסרום, בנוסף לשימוש הידוע יותר שלהם בריפוי גנטי להעברת גן מעניין. PVs פגומים בשכפול מכיוון שהגנום הנגיפי מחולק לפלסמידים שונים שאינם משולבים ב- PVs. מערכת בטוחה ורב-תכליתית זו מאפשרת שימוש ב-PVs במעבדות ברמת בטיחות ביולוגית 2. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה כללית לייצור PVs לנטי-ויראליים המבוססים על שלושה פלסמידים שהוזכרו כאן: (1) פלסמיד עמוד השדרה הנושא את גן המדווח הדרוש לניטור הזיהום; (2) פלסמיד האריזה הנושא את הגנים לכל החלבונים המבניים הדרושים לייצור PVs; (3) פלסמיד ביטוי הגליקופרוטאין של מעטפת פני השטח הקובע את הטרופיזם של הנגיף ומתווך את כניסת הנגיפים לתא המארח. בעבודה זו, SARS-CoV-2 Spike הוא הגליקופרוטאין במעטפת המשמש לייצור של SARS-CoV-2 פסאודו-וירוסים פסאודו-טייפ שאינם משוכפלים.

בקצרה, תאי אריזה (HEK293T) הודבקו יחד עם שלושת הפלסמידים השונים בשיטות סטנדרטיות. לאחר 48 שעות, הסופרנאטנט שהכיל את ה-PVs נקצר, סונן ואוחסן בטמפרטורה של -80°C. ההדבקה של SARS-CoV-2 PVs נבדקה על ידי לימוד הביטוי של הגן המדווח (luciferase) בקו תא המטרה 48 שעות לאחר ההדבקה. ככל שהערך עבור יחידות לומינסנציה יחסית (RLUs) גבוה יותר, כך שיעור הזיהום/התמרה גבוה יותר. יתר על כן, PVs זיהומיות נוספו לדגימות הסרום בדילול סדרתי כדי לחקור את תהליך הנטרול של כניסת פסאודו-וירוסים לתאי המטרה, שנמדד כירידה בעוצמת RLU: ערכים נמוכים יותר המתאימים לפעילות נטרול גבוהה.

Introduction

וירוסים מדומים (PVs) הם כלים מולקולריים המשמשים במיקרוביולוגיה לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח לפתוגן-פתוגן 1,2,3,4. PVs מורכבים מחלק פנימי, הליבה הנגיפית, המגנה על הגנום הנגיפי, וחלק חיצוני, הגליקופרוטאינים המעטפתיים על פני השטח של הנגיף המגדירה את הטרופיזם5. פסאודו-וירוס אינו כשיר לשכפול בתא היעד מכיוון שהוא אינו מכיל את כל המידע הגנטי ליצירת חלקיקים נגיפיים חדשים. שילוב זה של תכונות מוזרות הופך PVs חלופה בטוחה וירוס wildtype. וירוסים מסוג Wildtype, לעומת זאת, הם פתוגניים מאוד ולא ניתן להשתמש בהם במעבדות BSL 2 לניתוח6.

ההדבקה של PVs יכולה להיות מנוטרת על ידי גן reporter, בדרך כלל קידוד חלבון פלואורסצנטי (GFP, RFP, YFP) או אנזים המייצר מוצרים כימילומינסנטיים (luciferase). זה נכלל באחד פלסמידים המשמשים לייצור PV משולב בגנום של pseudovirus7.

קיימים כיום מספר סוגים של ליבות PV, כולל חלקיקים שמקורם בלנטי-ויראלי המבוססים על גנום HIV-1. היתרון הגדול של PVs מבוססי HIV-1 על פני פלטפורמות אחרות הוא תהליך האינטגרציה הפנימי שלהם בגנום תא היעד8. למרות ש- HIV-1 הוא נגיף מדבק מאוד והוא הגורם הסיבתי לאיידס, וקטורים לנטי-ויראליים אלה בטוחים לשימוש בגלל צעדי האופטימיזציה הנרחבים לאורך השנים. תנאי בטיחות אופטימליים הושגו עם הכנסת 2 וקטורים לנטי-ויראליים מהדורהשני, בהם הגנים הנגיפיים התרוקנו מבלי להשפיע על יכולות ההתמרה9. הדור השלישי והרביעי תרמו לבטיחות מוגברת של טיפול בווקטורים לנטי-ויראליים עם פיצול נוסף של הגנום הנגיפי לפלסמידיםנפרדים 10,11. הדורות האחרונים של PVs משמשים בדרך כלל לייצור וקטורים לנטי-ויראליים לריפוי גנטי.

PVs יכולים לשמש לחקר אינטראקציות בין וירוסים ותאים מארחים, הן בשלב הייצור והן בשלב הזיהום. PVs משמשים במיוחד במבחני נטרול פסאודו-וירוסים (PVNA). PVNA מאומתים באופן נרחב כדי להעריך את פוטנציאל הנטרול של סרום או פלזמה על ידי מיקוד הגליקופרוטאין הנגיפי במעטפתPV 12,13. פעילות נטרול, המתבטאת בריכוז מעכב 50 (IC50), מוגדרת כדילול של סרום/פלזמה החוסם 50% מכניסת חלקיקי הנגיפים14. בפרוטוקול זה, תיארנו את הקמתו של PVNA לבדיקת פעילות הנוגדנים נגד תסמונת נשימה חריפה חמורה - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) בסרה שנאספה לפני ואחרי קבלת מנת חיסון דחף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הנוכחי אושר על ידי ועוקב אחר הנחיות הוועדה האתית של אוניברסיטת ורונה (פרוטוקול אישור מספר 1538). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מהנבדקים האנושיים שהשתתפו במחקר. דגימות דם שלמות נאספו ממתנדבי עובדי בריאות (HCW) שהיו בתהליך קבלת חיסונים נגד SARS-CoV-2. דגימות אלה נאספו בצינורות פלסטיק המכילים נוגדי קרישה לבידוד הבא של סרום15.

כל התהליכים הבאים חייבים להתבצע במכסה מנוע ביולוגי סוג 2, בעבודה בתנאים סטריליים. הטיפול בווירוסים חייב להתבצע בזהירות, ויש לנטרל את כל תוצרי הפסולת בתמיסת אקונומיקה מדוללת. סקירה כללית של הפרוטוקול מוצגת באיור 1.

Figure 1
איור 1: ייצוג גרפי של בדיקת נטרול. (A) ייצור PV, (B) טיטרציה PV ו-(C) בדיקת נטרול. כל ההליכים מבוצעים במכסה מנוע ביולוגי סוג 2 בתנאים סטריליים. שלב הטיטרציה (B) צריך להתבצע כדי לתקנן את רמות ההדבקה של PVs לפני השימוש בבדיקת הנטרול (C). נתון זה נוצר עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

1. ייצור PVs SARS-CoV-2 ובדיקת זיהומיות

  1. זרע 5 x 105 HEK293T תאים במדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM, גלוקוז גבוה, 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) בצלחת 6 בארות (6WP) כדי להגיע לצפיפות תאים מתאימה התואמת למגיב הטרנספקציה בו נעשה שימוש. במקרה של ביצוע transfection עם polyehtylenimine (PEI) (להכין את מגיב בעקבות הוראות היצרן), להבטיח כי התאים להגיע 40-60% צפיפות ביום transfection (שלב 1.3). שמור את התאים באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO2.
  2. לפני הטרנספקציה, החלף את מדיום התא המשומש בתווך טרי ללא אנטיביוטיקה (DMEM, גלוקוז גבוה, 10% FBS, 1% L-גלוטמין) כדי להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר.
    הערה: יום לאחר הזריעה, HEK293T התאים מוכנים להדבקה.
  3. תאי HEK293T דבק Transfect עם מגיב transfection מתאים על פי הוראות היצרן. אם אתם משתמשים ב-PEI, הכינו שתי תערובות ועקבו אחר השלבים הבאים.
    1. להכנת תערובת A, הוסף 500 ng של פלסמיד אריזה pCMV-dR8.9116, 750 ng של פלסמיד כתב pCSFLW16, ו 450 ng של SARS-CoV-2 Spike המבטא פלסמיד ב 100 μL של מדיום סרום מופחת.
    2. להכנת תערובת B, יש להוסיף 17.5 מיקרוליטר PEI (ריכוז: 1 מ"ג/מ"ל) ל-100 מיקרוליטר של מדיום הסרום המופחת.
    3. תנו לשתי התערובות לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות. לאחר מכן, ערבבו את התוכן של שתי השפופרות יחד על ידי הוספת תערובת PEI B לתערובת DNA A.
    4. דוגרים על הצינור למשך 20-30 דקות ב-RT. מעבירים את הצינור בעדינות כל 3-4 דקות כדי לשפר את הערבוב. לבסוף, מוסיפים את התערובת לתאי HEK293T.
  4. 16-20 שעות לאחר הטרנספקציה, החלף את מדיום התרבית ב- DMEM טרי ומלא. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2, כדי לאפשר ייצור PVs על ידי תאים נגועים.
  5. 72 שעות לאחר הטרנספקציה, קצרו את הסופרנאטנט המכיל PVs. לאחר מכן צנטריפוגה ב 1600 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר פסולת תאים ותאים מתים ולסנן אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר תאית אצטט.
  6. שלב אופציונלי: כדי להגדיל את התפוקה הסופית של טיטר PV, בצע טרנספקציות מרובות, אחסן את המדיה התאית המכילה PVs ורכז אותה באמצעות צינורות ריכוז.
  7. המשך ישירות עם השלבים הבאים ("טיטרציה PVs", סעיף 2) או aliquot את המדיום המכיל PV בצינורות מתאימים כדי לאחסן ב -80 ° C עד לשימוש. הכינו aliquot נוסף (400-500 μL) שישמש לטיטרציה.
    הערה: ביצוע aliquots מרובים יבטיח שחזור בין ניסויים על ידי הימנעות מחזורי הפשרה והקפאה מוגזמים.

2. טיטרציה PVs

  1. השתמש בתווך הטרי המכיל PV לשלבים הבאים או הפשיר את aliquot הבדיקה (שלב 1.7) כדי לבצע את הטיטרציה של הזן הנגיפי החדש. הקפאת aliquots של אותו מלאי PV יבטיח שחזור.
  2. הוסף 50 μL של DMEM מלא (או תווך שלם תואם לקו תאי היעד בשימוש) בכל הבארות של צלחת באר 96 (96WP) הדרוש כדי לבדוק לשכפל את מלאי PV, משאיר שורה "A" ריקה. הוסף 100 μL של מלאי PVs לשורה "A". בהתבסס על מספר התכשירים שיש לבדוק, השאירו עמודה אחת ללא הנגיף כבקרה "תאית בלבד" (איור 2).
  3. פיפטה 50 μL משורה A לשורה B וחזור על תהליך זה עד שורה G כדי לקבל דילול סדרתי של המלאי הראשוני. מחק את עוצמת הקול העודפת מהשורה האחרונה.
  4. נתק תאיםבאמצעות טריפסין/אתילאנדיאמין טטראצטי חומצה 1x (EDTA) במאגר הפוספט של דולבקו במי מלח 1x (DPBS 1x), לאחר הסרת המדיום המשומש ושטיפת תאים עם DPBS 1x פעמיים. הכנת תאים לצפיפות של 4 x 105 תאים / מ"ל.
    הערה: בפרוטוקול זה, זיהום PVs נבדק על קו התאים הרגיש HEK293T/ACE2; תאים כאלה נגזרו מ-HEK293T, שהותמרו באמצעות וקטור לנטי-ויראלי כדי לבטא קולטן ACE2.
  5. הוסף 50 μL של תרחיף התא לכל באר כדי להבטיח ספירת תאים של 2 x 104 תאים לכל באר.
  6. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2, למשך 48 שעות.
  7. לאחר הדגירה, בצע את בדיקת לוציפראז כדי לקבל את הקריאה בהתאם להוראות היצרן. הוסף 100 μL של מגיב luciferase לבארות לדגור בחושך ב RT במשך 2 דקות. העבירו את התוכן של כל באר לצלחת שחורה של 96 בארות (תואמת לקורא הלוחות הזמין) וקראו את הלוחות בקורא צלחות 96 בארות.
    הערה: הלומינומטר המשמש לקריאת לוציפראז יפיק קובץ גיליון אלקטרוני עם הנתונים הגולמיים והלא מעובדים שישמשו לניתוח במורד הזרם (במקרה זה, קובץ Excel). ההדבקה של הנגיף תתבטא כיחידות לומינסנציה יחסית (RLU) (המתוארות בסעיף 4.1).

Figure 2
איור 2: פריסה מייצגת של לוח באר 96 עבור טיטרציה PV. נפח קבוע של סופרנאטנט המכיל PV מתווסף לשורה A, עמודות 1-11, ומדולל סדרתית. העמודה האחרונה נותרת כפקד "תא בלבד". נתון זה נוצר עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

3. בדיקת נטרול

  1. להפשיר סרה של חולים על קרח. יש להשבית דגימות סרום על ידי דגירה בטמפרטורה של 56°C למשך 30 דקות.
  2. בלוח באר 96, הוסף 50 μL של DMEM טרי ושלם (או תווך שלם תואם לקו תאי היעד בשימוש) בכל אחת מהבארות הבאות: משורה B (עמודות 1-10) לשורה H (עמודות 1-10). שים 95 μL של DMEM טרי ושלם בשורה A (עמודות 1-10). הוסף 50 μL ו- 100 μL של DMEM מלא לבארות של עמודות 11 ו- 12, בהתאמה. אלה יהיו הפקדים הנגועים (בקרת וירוסים, או VC) והלא נגועים (תאים בלבד, או CC), בהתאמה (איור 3).
  3. הוסף 5 μL של דגימות סרום/פלזמה מומתות חום בשורה A (עמודות 1-10). כל מדגם יהיה כפול. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, ערבבו את הדגימות בשורה הראשונה והעבירו 50 מיקרוליטר של מדיום המכיל סרום משורה A לשורה B. חזרו על התהליך הזה עד לשורה האחרונה (איור 3). יש להשליך את 50 μL הנותרים.
  4. הפשירו את המספר הדרוש של אליציטוטים של PVs ודללו ל ≥ 104 RLU/mL. הוסף 50 μL של התווך המדולל המכיל PV לכל באר (מעמודה 1 לעמודה 11) באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי להגיע לדילול 1:1 של סרום / פלזמה מומתים בחום לנגיף. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2, למשך שעה אחת כדי לאפשר לנוגדנים בדגימות הסרום להיקשר לחלבון הספייק SARS-CoV-2 על PVs.
  5. הכינו לפחות 5 מ"ל תרחיף של תאים רגישים (HEK293T/ACE2) בצפיפות תאים של 4 x 105 תאים/מ"ל. הוסף 50 μL של תרחיף התא לכל באר ודגר ב 37 ° C ו 5% CO2, במשך 48 שעות.
  6. לאחר הדגירה, בצע את קריאת בדיקת לוציפראז בהתאם להוראות היצרן, כמתואר בשלב 2.7.
    הערה: הלומינומטר המשמש לקריאת לוציפראז יפיק קובץ גיליון אלקטרוני (במקרה זה, .xlsx) עם הנתונים הגולמיים והלא מעובדים שישמשו לניתוח במורד הזרם (קובץ הבדיקה של לוציפראז).

Figure 3
איור 3: ייצוג לוחות בהתבסס על דילול בסרום. אדום בהיר מתאים לכמות גבוהה יותר של סרום, ונתיב כחול בהיר (עמודה 11) מתאים לבקרת תאים נגועים (VC, בקרת וירוסים). נתיב כחול בהיר (עמודה 12) מתאים לתאים לא נגועים (CC, בקרת תאים). נתון זה נוצר עם BioRender. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

4. ניתוח טיטרציה

  1. בקובץ הבדיקה Luciferase, הקצה את השמות/כותרות לדוגמאות המתאימות.
  2. הכפל את מדד RLU בגורמי הדילול (מהחלק העליון לחלק התחתון של הרשת: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x) כדי לקבל RLU/mL. אם משתמשים בגורמי דילול שונים, שנו את גורמי הכפל בהתאם.
  3. חשב את הממוצע RLU/מ"ל עבור כל תכשיר PV.

5. ניתוח בדיקת נטרול PVs

  1. בקובץ הגיליון האלקטרוני של בדיקת Luciferase (במקרה זה, .xlsx), הקצה את הכותרות המתאימות לדגימות שנבדקו. הזן את מקדם הדילול של המדגם (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1,280x, 2,560x, 5,120x). חשב את Log10 של גורמי הדילול.
  2. חשב את ה-RLU הממוצע של בקרת לא נגוע ונגוע (איור 3, עמודות 11 ו-12, בהתאמה). ערכים אלה יהיו שימושיים עבור הנורמליזציה בשלב 5.5.
  3. פתח מסמך חדש לניתוח נתונים. בחר ניתוח X/Y, הזן X כמספרים ו- Y כ - Enter 2 שכפל ערכים בעמודות משנה זו לצד זו.
  4. הזן ערכי Log10 (דילול) כמספרי X. הזן את ה- RLU הכפול של הדגימות.
  5. עבור אל נתח > נרמל > סמן בדגל את כל הדגימות באותו גיליון. הזן את הערכים הממוצעים של VC ו- CC ב - כיצד מוגדר 0%?, וכיצד מוגדר 100%?, בהתאמה. לחץ על אישור.
  6. בגליון הנתונים המנורמל, עבור אל ניתוח ניתוחי XY > > ניתוחים לא ליניאריים (התאמת עקומה). סמן בדגל את כל הדוגמאות ולחץ על אישור. עבור תגובת מינון - אינהיביציה, בחר log(inhibitor) לעומת תגובה מנורמלת - שיפוע משתנה.
  7. תחת אילוץ, שנה את HillSlope ל - Must להיות קטן מ- 0.
  8. תחת פלט, סמן בדגל צור טבלת סיכום וגרף. לחץ על אישור כדי לקבל את הניתוחים הסופיים. גליון עבודה עם תבנית לניתוח מסופק בקובץ משלים 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר את הייצור של SARS-CoV-2 PVs ויישום במורד הזרם של PVs אלה כדי לנתח את פעילות הנטרול של סרום / פלזמה של נבדקים שקיבלו חיסון נגדCOVID-19 17. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לייצר פסאודוטיפים של כל וריאנט דאגה SARS-CoV-2 (VOC) כדי לבחון את האבולוציה של התגובה המנטרלת. למרות פרוטוקול זה המאפשר את המחקר של תגובה חיסונית הומורלית לאחר חיסון COVID-19, ניתן להתאים אותו כדי לבדוק בקלות את נטרול של סרה / פלזמה שונים נגד וירוסים שונים 13,18,19.

איור 4A מייצג את התוספת של דילול הסרום (Log(dilution)) המתאימה לעלייה של אות RLU. לכן, ככל שדילול הדגימה גבוה יותר, כך כניסת הנגיף פחות חסומה (איור 4A). נתון זה מתבטא גם באחוז הנטרול (איור 4B).

תוצאת IC50 מראה את יכולת הנטרול של נסיוב חיסון יחיד לאורך זמן. בדוגמה שדווחה באיור 4C, הנבדק פיתח פעילות הומורלית חזקה נגד הנגיף ארבעה שבועות לאחר החיסון; עם זאת, לאחר 16 שבועות IC50 דומה לזה שלפני מתן החיסון. במקרה זה, PVNA הראה אובדן פוטנציאל נטרול לאורך זמן.

Figure 4
איור 4: תוצאות מייצגות של PVNA. (A) אחוזי הדבקה (RLU) ו-(B) אחוזי נטרול מוצגים בשבוע 0 (W0, לפני החיסון); W4 (ארבעה שבועות לאחר החיסון); W16 (שישה עשר שבועות לאחר W0). (C) ערכי IC50 באותן נקודות זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1: תבנית ניתוח נטרול. דף עבודה עם תבנית לביצוע ניתוח הנטרול. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות ששימוש בנגיף wildtype מדמה את הזיהום בפועל, PVs לנטי-ויראליים הם אפשרות בטוחה יותר לחקור את המנגנונים הקשורים לכניסה וזיהום ויראלי ללא דרישות הבטיחות המחמירות הדרושות לעבודה עם וירוסים פתוגניים 4,20,21. PVs מורכבים מליבה נגיפית פגומה בשכפול המוקפת בגליקופרוטאין מעטפת פני השטח של נגיף פתוגני שהיא מטרת המחקר.

PVs מבוססי HIV-1 הם אחת הפלטפורמות הנפוצות ביותר ואלה שימשו בפרוטוקול זה לייצור חלקיקים פסאודו-ויראליים של SARS-CoV-2. גן הכתב יכול להיות שונה בהתאם לשימוש ב- PVs; במקרה זה, הבחירה בגן לוציפראז ריפורטר מספקת קריאה קלה, מהירה ורגישה של ההדבקה של PVs המיוצרים.

PVs המבוססים על lentiviruses מיושמים באופן נרחב כדי לחקור תגובה הומורלית נגד HIV-122. טכנולוגיית PV יושמה באופן מיידי במהלך מגיפת COVID-19 האחרונה, שנגרמה על ידי SARS-CoV-2. SARS-CoV-2 הוא בטא-וירוס אנושי פתוגני ביותר, שזוהה לראשונה בסין (וו האן) שהפך למגיפה מהירה, וגרם ליותר מ-6 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם23,24. בגלל התיקוף של אסטרטגיות החיסון, המגפה נשלטה במידה רבה; עם זאת, ברוב האנשים הפגיעים, כגון חולי סרטן או אנשים החיים עם HIV, זה עדיין מהווה סיכון 25,26,27. בהקשר זה, עדיין יש צורך בבדיקות מתוקפות כדי לעקוב אחר התגובה ההומורלית של מתנגדי החיסונים במונחים של פעילות מנטרלת. במאמר זה תיארנו פרוטוקול פשוט שניתן לבצע בקלות במעבדות ללא גישה להכלה בקטגוריה 3. יתר על כן, פלטפורמת PV היא מערכת רב-תכליתית לחקר גרסאות שונות של נגיף SARS-COV-2. ואכן, על ידי שינוי פלסמיד המבטא מעטפות עם קוצים שונים, ניתן ליצור PVs של וריאנטים חדשים של SARS-CoV-2 או של כל וירוס קורונה אחר28. ניתן להשתמש בתיקי וירוסים אלה כדי להעריך את תגובתיות התגובה ההומורלית הנגרמת על ידי החיסון נגד הווריאנטים השונים המדאיגים 15,29,30,31,32. מידע זה יכול להנחות את הדור של חיסונים חדשים ויעילים יותר.

ניתן להיתקל בשלושה מכשולים עיקריים בעת ביצוע פרוטוקול זה בנוגע לתנאי טרנספקציה, כשל טיטרציה ו / או בדיקת נטרול. ראשית, תאי האריזה עשויים שלא להיות מספיק זורמים בזמן ההעברה. זה יכול להיות בגלל חוסר חומרים מזינים. ודא כי שלב 1.1. הוא עקב כראוי. אחרת, לבצע זריעה בבוקר של היום לפני transfection ו transfection את תאי האריזה מאוחר יותר למחרת כדי להגדיל את זמן הצמיחה. בעיה חוזרת ונשנית היא זיהום פוטנציאלי של תווך התא בין טרנספקציה להחלפת מדיום למחרת. במקרה זה, חזור על ההליך על ידי הגדלת הליך העיקור לפני השימוש בעת עבודה מתחת למכסה המנוע BSL2 או כלול אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהומים לא רצויים. שנית, אות לוציפראז שלא זוהה עלול להתרחש שניתן לייחס לשלבים שונים של ייצור PVs או למאפיינים של קו תאי המטרה. פלסמידים יש לחלץ עם ערכות ללא אנדוטוקסין. שלב הטרנספקציה הוא קריטי לתוצאת הפרוטוקול. מגיב PEI חייב להיות מוכן בריכוז הנכון של 1 מ"ג / מ"ל. בעדינות להעיף את הצינור במהלך הכנת תערובות transfection משפר את היווצרות של מתחמי DNA-PEI. כדי לוודא כי התאים כבר transfected כראוי, מומלץ לבצע את הבדיקה luciferase מיד לאחר קצירת התאים. בנוסף, כלול גליקופרוטאין מעטפת וירוס בקרה כגון VSV: VSV-PVs נותנים אותות RLU חזקים על שורות תאים אנושיים. יתר על כן, יש להזכיר כי קו תא היעד חייב לבטא את הקולטן, אשר מאומת בקלות באמצעות כתם מערבי או ציטומטריית זרימה.

שיטה זו כבר אופטימיזציה בעבר16 ביחס לתנאי הניסוי, כולל הבחירה של מגיב transfection, קביעת היחסים בין פלסמידים שונים הדרושים לייצור של PV, ואת הבחירה של קווי תא המטרה, השימוש luciferase כמו גנים reporter. עם זאת, כל מעבדה תצטרך לאמת את השיטות המוצעות בהתאם לציוד הזמין. לדוגמה, (שלב 2.7) דורש תוספת של 100 μL של מצע Luciferase כפי שהוצע על ידי היצרן: זה אופטימלי עבור קריאה של בדיקת luciferase עם קורא לוחות זמין כרגע. מצד שני, מעבדות אחרות המצוידות בקורא לוחות שונה עשויות להתאים את הפרוטוקול באמצעות מצעי לוציפראז שונים או נפחים של מגיב33. יתר על כן, מחברים אחרים הציעו להשתמש בחלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) כגן דיווח במקום לוציפראז. זה יכול להיחשב אם מעבדה מצוידת במלואה עבור קריאת GFP אבל לא luciferase34,35.

לסיכום, PVs היא מערכת גמישה ופשוטה המאפשרת לכמת את הזיהום באמצעות שיטת זיהוי פשוטה. היא מייצגת גישה חסכונית הנגישה יותר לקבוצות מחקר רבות ומאפשרת להימנע משימוש בנגיפים פתוגניים הדורשים מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 321. השימוש ב- PVs מייצג גישה מאופיינת היטב ובטוחה לחקר נטרול בתיווך נוגדנים אצל אנשים שחוו זיהום ו / או חיסון SARS-CoV-2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד עניינים.

Acknowledgments

אנו מכירים בתרומתם של מתנדבי עובדי מערכת הבריאות. פרויקט זה נתמך על ידי המחלקה למצוינות 2023/2027, MUR, איטליה. AR ו- DZ נתמכו על ידי PRIN2022 (מימון האיחוד האירופי; הדור הבאהאיחוד האירופי)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 μm filter SARSTEDT 83 1826
6-well plate SARSTEDT 83 3920
96-well plate SARSTEDT 8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merck 10403892
Black Opaque 96-well Microplate Perkin Elmer 60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium  SIGMA-ALDRICH D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x) AUROGENE AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum AUROGENE AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7 graphpad dotmatics NA In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells ATCC CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells ATCC CRL-3216 HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine  AUROGENE AU-X0550-100
Luminometer - Victor3 Perkin Elmer HH35000500 In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer' 
Opti-MEM Thermo Fisher Scientific 11058021 In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium' 
p8.91 packaging plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid Di Genova et al., 2021 A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin AUROGENE AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa) SIGMA-ALDRICH 408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126) Addgene 145839 This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid Addgene pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System Perkin Elmer 6066759 In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x AUROGENE AU-L0949-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963 (2012).
  2. Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945 (2021).
  3. McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695 (2022).
  4. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993 (2022).
  5. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963 (2018).
  6. D'Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693 (2022).
  7. Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
  8. Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016 (2020).
  9. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  10. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  11. Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
  12. Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116 (2013).
  13. Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379 (2021).
  14. Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
  15. Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38 (2021).
  16. Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236 (2021).
  17. Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
  18. Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
  19. Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
  20. Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346 (2014).
  21. Chen, M., Zhang, X. -E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
  22. Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
  23. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2022).
  24. Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
  25. Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554 (2022).
  26. Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089 (2022).
  27. Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
  28. Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58 (2023).
  29. Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22 (2022).
  30. Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
  31. Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471 (2023).
  32. Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437 (2023).
  33. da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520 (2022).
  34. Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651 (2021).
  35. Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745 (2021).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 201
וירוסים מדומים ככלי מולקולרי לניטור תגובות חיסוניות הומורליות נגד SARS-CoV-2 באמצעות בדיקת נטרול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fantoni, T., Bissoli, M., Stefani,… More

Fantoni, T., Bissoli, M., Stefani, C., Voi, M., Dabija, A., Casula, R., Minafra, D. L., da Fonseca Palmeira, J., Argañaraz, E. R., Mayora-Neto, M., Temperton, N. J., Zipeto, D., Ruggiero, A. Pseudotyped Viruses As a Molecular Tool to Monitor Humoral Immune Responses Against SARS-CoV-2 Via Neutralization Assay. J. Vis. Exp. (201), e65658, doi:10.3791/65658 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter