ضربة قاضية من FAM83A للتحقق من دورها في نمو خلايا سرطان عنق الرحم وحساسية سيسبلاتين
Summary
هنا ، نعرض إجراءات ضربة قاضية FAM83A ؛ المقايسات للكشف عن آثاره على انتشار خلايا سرطان عنق الرحم وهجرتها وغزوها ؛ وتوعية هذه الخلايا بالسيسبلاتين. توفر هذه الدراسة جينا مستهدفا واعدا لسرطان عنق الرحم ومرجعا لمزيد من أبحاث الأدوية.
Abstract
يحمل استكشاف الجينات المستهدفة للورم أهمية قصوى للوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه. في هذه الدراسة ، نوضح الخطوات المتضمنة في تحديد الجين المستهدف للورم FAM83A في سرطان عنق الرحم. أولا ، تم استخدام مجموعة بيانات أطلس جينوم السرطان للتحقق من صحة التعبير والأهمية النذير ل FAM83A لدى النساء. تم استخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) لضربة قاضية لجين FAM83A في خلايا HeLa و C33a . بعد ذلك ، تم إجراء تلطيخ 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) لتحديد التأثيرات على قدرات تكاثر الخلايا السرطانية. تم إجراء التئام الجروح وفحوصات إدخال الغشاء المسامي لتقييم هجرة الخلايا السرطانية وقدرات الغزو.
تم استخدام النشاف الغربي لتحديد مستويات البروتين المرتبطة بموت الخلايا المبرمج. تم استخدام تلطيخ JC-1 لتقييم تغيرات وظيفة الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، تم استخدام تدخل سيسبلاتين (ديامينيدي كلوروبلاتين ، DDP) لتقييم الإمكانات العلاجية للجين المستهدف. تم إجراء قياس التدفق الخلوي وفحوصات تكوين المستعمرات لمزيد من التحقق من صحة الخصائص المضادة للسرطان للجين. نتيجة لذلك ، تبين أن ضربة قاضية FAM83A تمنع انتشار وهجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم وتوعية هذه الخلايا بالسيسبلاتين. تتحقق هذه المنهجيات الشاملة بشكل جماعي من صحة FAM83A كجين مستهدف مرتبط بالورم ، مما يبشر بالخير كهدف علاجي محتمل في الوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه.
Introduction
يعد سرطان عنق الرحم مصدر قلق عالمي لأنه أحد الأنواع الرائدة في الأورام الخبيثة النسائية في جميع أنحاء العالم وهو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان لدى النساء1. ترتبط الجراحة الجذرية والعلاج الكيميائي الإشعاعي بمعدلات شفاء عالية في المرحلة الأولية. ومع ذلك ، فإن نتائج العلاج للمرضى في المرحلة المتقدمة من سرطان عنق الرحم الذين يصابون بمرض نقيلي غير مواتية للغاية2. لذلك ، من الأهمية بمكان زيادة فهم الآليات البيولوجية الكامنة وراء هجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة للوقاية من هذا المرض وعلاجه.
إن تحديد الجينات المستهدفة المشاركة في تطور السرطان وإيجاد طرق لتثبيط تعبيرها أو عملها يمثل خيارات علاجية واعدة. في هذه الدراسة ، حددنا FAM83 كجين مسبب للسرطان وحققنا في آثاره المثبطة على خلايا C33a و HeLa. تم الإبلاغ عن الجينات المسرطنة لعائلة FAM83 (FAM83A-H) على نطاق واسع في السرطانات البشرية 3,4. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن أن FAM83A يتم تنظيمه في سرطان الرئة5 والثدي6 والمبيض7 والبنكرياس8 ، مما يشير إلى أن FAM83A يلعب دورا مهما في تطور السرطان من خلال تعزيز الانتشار والغزو والسمات الشبيهة بالخلايا الجذعية ومقاومة الأدوية في الخلايا السرطانية. الأهم من ذلك ، تم تحديد FAM83A كواحد من الجينات المرشحة الجديدة المرتبطة بتطور آفة عنق الرحم والتسرطن9. على الرغم من تأكيد ارتفاع تعبير FAM83A في خلايا سرطان عنق الرحم البشرية ، إلا أن التأثير المحدد والآليات الأساسية ل FAM83A في سرطان عنق الرحم لا تزال غير واضحة.
في هذه الدراسة ، نحدد البروتوكولات المشاركة في تحديد FAM83A كجين مستهدف للورم في سرطان عنق الرحم واستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) لضربة قاضية لجين FAM83A في خلايا HeLa و C33a . تم إجراء تلطيخ 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) لتحديد التأثيرات على تكاثر الخلايا السرطانية ، بينما ساعد التئام الجروح وفحوصات إدخال الغشاء المسامي في تقييم هجرة الخلايا السرطانية وقدرات الغزو.
تم إجراء النشاف الغربي لتحديد مستويات البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج ، وتم استخدام تلطيخ JC-1 لتقييم تغيرات وظيفة الميتوكوندريا. وهكذا ، أبلغنا أن FAM83A يلعب دورا مهما في تكاثر الخلايا ، ورم خبيث ، وغزو في سرطان عنق الرحم. من خلال خلل الميتوكوندريا المرتبط بمسار PI3K / AKT وموت الخلايا المبرمج ، قامت FAM83A بالضربة القاضية بتوعية خلايا سرطان عنق الرحم بالسيسبلاتين (ديامينيدي كلوروبلاتين ، DDP). توفر هذه الدراسة هدفا جديدا لسرطان عنق الرحم وربما سرطانات أخرى ومرجعا لتطوير استراتيجيات للتغلب على مقاومة الخلايا السرطانية لبعض أدوية العلاج الكيميائي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد التحقيق في الجينات المستهدفة للورم ذا أهمية قصوى للوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه. إن فهم الجينات المحددة التي تلعب دورا مهما في تطور سرطان عنق الرحم وتطوره يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الجزيئية الأساسية للمرض. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تحديد هذه الجينات المستهدفة إلى تطوير استرات…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة مكتب Jingzhou للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2020HC06).
Materials
| Cells and Medium Formulation | |||
| C33a | American Type Culture Collection | ||
| Hela | American Type Culture Collection | ||
| Modified medium | 10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin) | ||
| Antibody Information | |||
| AKT | 4691, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Bcl2 | 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:1,000 | |
| Caspase 3 | 19677-1-AP, Proteintech Group, Inc | ‘1:2,000 | |
| cleaved-caspase3 | abs132005; Absin Bioscience Inc. | ‘1:1,000 | |
| Cytc | 10993-1-AP; Proteintech Group | ‘1:1,000 | |
| GAPDH | 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc. | ‘1:8,000 | |
| mTOR | 2983, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| PI3K | 4292, Cell Signaling Technology Inc | ‘1:1,000 | |
| p-AKT | 4060, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-mTOR (Ser2448) | #5536, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| p-PI3K p85 subunit | 17366, Cell Signaling Technology Inc. | ‘1:1,000 | |
| Secondary antibodies | GB23303, Servicebio | ‘1:2,000 | |
| Materials | |||
| 6-well plate | Corning, NPY | ||
| Alexa Fluor 555 | Beyotime | ||
| BCA Protein assay kit | Beyotime, China | P0011 | |
| ChemiDoc XRS Imager System | BioRad | ||
| Enhanced chemiluminescence detection kit | Servicebio, Inc.,China | cat. no. G2014 | |
| Fluorescence microscope | Olympus Corporation, Tokyo, Japan | ||
| Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix | 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China | ||
| Inverted microscope | Olympus, Tokyo, Japan; | ||
| Millicell transwell inserts | Millipore,Bedford, MA, USA | ||
| Mitochondrial membrane potential assay kit | Beyotime, China | ||
| PMSF | ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China | #ST506 | |
| Real-time quantitative PCR instrument | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China. | ||
| RIPA Lysis Buffer | Beyotime Biotech, Jiangsu, China | ||
| TRIzol reagent | Invitrogen | 15596026 | |
| TRIzol reagent | Takara Bio Inc., Otsu, Japan | ||
| Software | |||
| Image-Pro | plus 6.0 | ||
References
- Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
- Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
- Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
- Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
- Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
- Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
- Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
- Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
- Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
- Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
- Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
- Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
- Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
- Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
- Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).
