Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos
Summary
En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.
Abstract
Las células ciliadas cocleares son los receptores sensoriales del sistema auditivo. Estas células se encuentran en el órgano de Corti, el órgano sensorial responsable de la audición, dentro del laberinto óseo del oído interno. Las células ciliadas cocleares consisten en dos tipos anatómica y funcionalmente distintos: células ciliadas externas e internas. El daño a cualquiera de ellos resulta en pérdida de audición. En particular, como las células ciliadas internas no pueden regenerarse y el daño a ellas es permanente. Por lo tanto, el cultivo in vitro de células ciliadas primarias es indispensable para investigar los efectos protectores o regenerativos de las células ciliadas cocleares. Este estudio tuvo como objetivo descubrir un método para aislar y cultivar células ciliadas de ratón.
Tras la extracción manual de la pared lateral coclear, el epitelio auditivo se diseccionó meticulosamente del modiolo coclear al microscopio, se incubó en una mezcla compuesta por tripsina-EDTA al 0,25 % durante 10 min a 37 °C y se suspendió suavemente en medio de cultivo con una punta de pipeta de 200 μL. La suspensión celular se pasó a través de un filtro celular, el filtrado se centrifugó y las células se cultivaron en placas de 24 pocillos. Las células ciliadas se identificaron en función de su capacidad para expresar un complejo de mecanotransducción, la miosina-VIIa, que está implicada en las tensiones motoras, y mediante el marcaje selectivo de la F-actina mediante faloidina. Las células alcanzaron >90% de confluencia después de 4 d en cultivo. Este método puede mejorar nuestra comprensión de las características biológicas de las células ciliadas cultivadas in vitro y demostrar la eficiencia de los cultivos de células ciliadas cocleares, estableciendo una base metodológica sólida para futuras investigaciones auditivas.
Introduction
Las células ciliadas cocleares desempeñan un papel importante en la detección del sonido y la transmisión de señales al nervio auditivo. Las células ciliadas son células mecanicistas que funcionan como receptores sensoriales primarios y convierten las vibraciones sonoras en señales eléctricas en los vertebrados. El epitelio sensorial del oído interno de los mamíferos comprende una sola fila de células ciliadas internas y tres filas de células ciliadas externas. En diferentes áreas básicas de membrana, las células ciliadas perciben sonidos a diferentes frecuencias (entre 20 y 2.000 Hz)1. La función de las células ciliadas externas es un proceso de amplificación mecánica activa que ayuda a afinar el oído interno de los mamíferos, confiriendo una alta sensibilidad al sonido. Las células ciliadas internas son responsables de detectar los sonidos. Después de la despolarización graduada, la información acústica se transmite al cerebro através de las fibras nerviosas auditivas.
La pérdida de audición puede ser causada por defectos genéticos, envejecimiento, traumatismos por ruido o el uso excesivo de medicamentos ototóxicos, que constituyen un importante problema de salud en todo el mundo 3,4. La pérdida de audición se debe principalmente a un daño irreversible en las células ciliadas5. Con respecto a la pérdida de audición inducida por ruido, aunque los investigadores han llegado a un consenso sobre varios detalles de su etiología, se carece de una comprensión completa de los numerosos mecanismos subyacentes. Las células ciliadas externas son particularmente vulnerables a la sobreexposición acústica6. Las células ciliadas cocleares mecanosensibles están implicadas en la pérdida de audición relacionada con la edad; Sin embargo, los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a la degeneración de las células ciliadas siguen siendo desconocidos. Varios cambios en los procesos moleculares conducen al envejecimiento de las células ciliadas, al estrés oxidativo, a la respuesta al daño del ADN, a la autofagia y a la desregulación de la expresión y transcripción de genes relacionados con la especialización de las células ciliadas.
Como el oído interno está encerrado en el hueso temporal, en lo profundo del hueso más duro del cuerpo, es experimentalmente inaccesible, lo que supone un reto para las investigaciones sobre los mecanismos de reparación y regeneración de las células ciliadas. Por lo tanto, el establecimiento de cultivos in vitro para investigar la función de las células ciliadas se ha convertido en un método ideal para la investigación de los mecanismos de regeneración y lesión del oído interno. Los procedimientos para la preparación de cultivos organotípicos cocleares han sido descritos en estudios previos 8,9,10. Investigadores de todo el mundo han empleado diversas técnicas de microdisección coclear y preparación de superficies. A pesar de los desafíos persistentes, se han establecido con éxito varios sistemas de cultivo primario de células ciliadas in vitro. Los cultivos de órganos cocleares contienen varios tipos de células, incluidas las células ciliadas, las células de Deiters, las células de Hensen, las células pilares y las fibras del nervio auditivo. Una comprensión profunda de los cambios en las células ciliadas a nivel celular y molecular después de una lesión permitirá el desarrollo de herramientas de investigación más poderosas. Este estudio tuvo como objetivo demostrar los pasos para aislar órganos cocleares de ratones neonatos y separar enzimáticamente las células ciliadas abundantes para estudios in vitro. La naturaleza de las células cultivadas se confirmó mediante tinción de inmunofluorescencia.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con la línea celular HEI-OC1, los cultivos primarios de células ciliadas replicaron con mayor precisión el estado fisiológico de las células in vivo. Por lo tanto, el método de cultivo primario auditivo establecido mediante el aislamiento de células vivas de los órganos cocleares y su cultivo inmediato parece ser una herramienta valiosa para la investigación exhaustiva de los sistemas auditivos. Ciertas técnicas son cruciales para una cultura exitosa. En primer lugar, minimizar la duración de l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NFSC 82101224 a YG)
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
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