Выделение и культивирование первичных волосковых клеток улитки у новорожденных мышей
Summary
В данной статье мы представляем подробный протокол выделения и культивирования первичных волосковых клеток улитки у мышей. Первоначально орган корти препарировали из неонатальных (в возрасте 3-5 дней) мышиных улиток под микроскопом. Впоследствии клетки ферментативно переваривали в одноклеточную суспензию и идентифицировали с помощью иммунофлуоресценции через несколько дней в культуре.
Abstract
Волосковые клетки улитки являются сенсорными рецепторами слуховой системы. Эти клетки расположены в кортиевом органе, органе чувств, отвечающем за слух, в костном лабиринте внутреннего уха. Кохлеарные волосковые клетки состоят из двух анатомически и функционально различных типов: наружных и внутренних волосковых клеток. Повреждение любого из них приводит к потере слуха. Примечательно, что внутренние волосковые клетки не могут регенерировать, и их повреждение является необратимым. Следовательно, культивирование первичных волосковых клеток in vitro необходимо для изучения защитных или регенеративных эффектов волосковых клеток улитки. Это исследование было направлено на поиск метода выделения и культивирования волосковых клеток мышей.
После ручного удаления боковой стенки улитки слуховой эпителий тщательно отделяли от кохлеарного модиолы под микроскопом, инкубировали в смеси, состоящей из 0,25% трипсина-ЭДТА, в течение 10 мин при 37 °С и осторожно суспендировали в питательной среде с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл. Клеточную суспензию пропускали через клеточный фильтр, фильтрат центрифугировали, а клетки культивировали в 24-луночных планшетах. Волосковые клетки были идентифицированы на основе их способности экспрессировать механотрансдукционный комплекс, миозин-VIIa, который участвует в двигательном напряжении, а также путем селективного мечения F-актина с помощью фаллоидина. Клетки достигали >90% слияния через 4 дня в культуре. Этот метод может улучшить наше понимание биологических характеристик культивируемых волосковых клеток in vitro и продемонстрировать эффективность культур кохлеарных волосковых клеток, создавая прочную методологическую основу для дальнейших слуховых исследований.
Introduction
Волосковые клетки улитки играют важную роль в обнаружении звука и передаче сигнала к слуховому нерву. Волосковые клетки — это механистические клетки, которые функционируют как первичные сенсорные рецепторы и преобразуют звуковые колебания в электрические сигналы у позвоночных. Сенсорный эпителий внутреннего уха млекопитающих состоит из одного ряда внутренних волосковых клеток и трех рядов наружных волосковых клеток. В разных основных участках мембраны волосковые клетки воспринимают звуки на разных частотах (от 20 до 2000 Гц)1. Функция наружных волосковых клеток заключается в активном механическом процессе усиления, который помогает тонко настроить внутреннее ухо млекопитающих, обеспечивая высокую чувствительность к звуку. Внутренние волосковые клетки отвечают за распознавание звуков. После ступенчатой деполяризации акустическая информация передается в мозг через слуховые нервные волокна2.
Потеря слуха может быть вызвана генетическими дефектами, старением, шумовой травмой или чрезмерным использованием ототоксических препаратов, которые представляют собой серьезную проблему для здоровья во всем мире 3,4. Потеря слуха в основном возникает в результате необратимого повреждения волосковых клеток5. Что касается потери слуха, вызванной шумом, то, несмотря на то, что исследователи достигли консенсуса по некоторым деталям ее этиологии, отсутствует всестороннее понимание многочисленных механизмов, лежащих в ее основе. Наружные волосковые клетки особенно уязвимы к акустическому передержанию6. Механочувствительные волосковые клетки улитки участвуют в возрастной тугоухости; Однако молекулярные и клеточные механизмы, лежащие в основе дегенерации волосковых клеток, остаются неизвестными. Некоторые изменения в молекулярных процессах приводят к старению волосяных клеток, окислительному стрессу, реакции на повреждение ДНК, аутофагии и дисрегуляции экспрессии и транскрипции генов, связанных со специализацией волосяных клеток7.
Поскольку внутреннее ухо заключено в височную кость, глубоко в самой твердой кости тела, оно экспериментально недоступно, что создает проблему для исследований механизмов восстановления и регенерации волосковых клеток. Таким образом, создание культур in vitro для изучения функции волосковых клеток стало идеальным методом для исследования механизмов регенерации и повреждения внутреннего уха. Процедуры приготовления кохлеарных органотипических культур были описаны в более ранних работах 8,9,10. Исследователи по всему миру используют различные методы кохлеарной микродиссекции и подготовки поверхности. Несмотря на сохраняющиеся проблемы, различные системы первичных культивирования волосяных клеток были успешно созданы in vitro. Культуры кохлеарных органов содержат различные типы клеток, включая волосковые клетки, клетки Дейтера, клетки Хенсена, столбчатые клетки и волокна слухового нерва. Глубокое понимание изменений в волосковых клетках на клеточном и молекулярном уровнях после травмы позволит разработать более мощные исследовательские инструменты. Это исследование было направлено на демонстрацию шагов по изоляции кохлеарных органов от новорожденных мышей и ферментативному отделению обильных волосковых клеток для исследований in vitro. Природу культивируемых клеток подтверждали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания.
Protocol
Representative Results
Discussion
По сравнению с клеточной линией HEI-OC1 первичные культуры волосковых клеток более точно воспроизводили физиологическое состояние клеток in vivo. Таким образом, метод первичного культивирования слуховых клеток, основанный на выделении живых клеток из органов улитки и их немедленном культи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (NFSC 82101224 YG)
Materials
| 100 mm BioLite cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 130182 | using for culture |
| 35 mm Nunc cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 150318 | using for culture |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | using for culture |
| 70 µm cell strainers | BD Company | 352350 | using for filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescent staining |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | immunofluorescent staining |
| day 3-5 neonatal murine | provided by Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | using for culture |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | using for culture |
| Forceps | Dumont | 5# | using for dissection |
| Leica anatomy microscope | Germany | S9i | using for dissection |
| Penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | using for culture |
| Rabbit plyclonal to Myosin VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescent staining |
| Scissor | Belevor | 10cm/04.0524.10 | using for dissection |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescent staining |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | using for culture |
References
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046 (2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
