Handling and Tagging Techniques for Implanting Juvenile American Shad with a New Acoustic Microtransmitter(어린 미국 샤드에 새로운 음향 마이크로송신기를 이식하기 위한 취급 및 태깅 기술)

Summary

이 기사에서는 최적의 취급 관행과 음향 마이크로 송신기를 어린 미국 샤드에 이식하기 위한 자세한 절차를 제공합니다. 우리의 실험실 연구 결과는 이러한 태깅 기술이 생존 가능성이 높은 어린 미국 전어의 현장 연구에서 구현될 수 있음을 시사합니다.

Abstract

수력 발전 시스템을 통해 이동하는 어린 미국 전어(Alosa sapidissima)의 행동과 생존을 더 잘 이해하기 위해 원격 측정 기술을 사용하는 것은 전조가 특히 취급에 민감한 것으로 널리 알려져 있기 때문에 어려운 일이었습니다. 이 연구의 목표는 태깅 과정의 해로운 영향을 최소화하고 어린 미국 갯배의 태깅 후 생존을 극대화하는 새로운 음향 마이크로 송신기를 사용하여 태깅 프로토콜을 개발하는 것이었습니다. 물 밖 취급을 제한하고 태그 부착 전후에 기수 염수(1,000ppm 7.5)의 사용을 제한하면 간단한 가슴 이식 방법을 사용하여 태그를 붙인 샤드의 생존율이 향상되었습니다. 이 프로토콜은 음향 송신기로 청소년 샤드에 태그를 지정하기 위한 자세한 단계별 절차를 제공합니다. 이 절차를 사용하여 태그를 붙이고 실험실에서 60일 동안 보관한 물고기의 생존율은 81.5%인 반면, 태그가 없는 물고기는 70%였습니다. 이 연구에서 개발된 성공적인 태깅 및 처리 관행은 어린 샤드 및 기타 민감한 종의 현장 원격 측정 연구에 적용될 수 있습니다.

Introduction

미국 전어(Alosa sapidissima)는 미국 동부 해안이 원산지인 소하성 어종입니다. 서식지 가용성이 감소하고 수력 발전 댐의 개발이 증가함에 따라 원래 범위에서 모래의 개체수가 감소했습니다 ^1,2. 어린 모래 및 기타 알로신은 바다로 이동할 때 수력 발전 구조물을 통과할 때 특히 부상과 사망에 취약할 수 있습니다(^3,4,5). 수력 발전 댐에서 어린 모래의 통과율과 생존율을 이해하는 것은 이러한 시설의 재허가와 종의 복원 노력을 알리는 데 매우 중요합니다. 그러나 바다로 이동하는 미국 갯벌의 통과율과 생존율을 평가하기 위한 성공적인 태깅 기술은 부족합니다. 원격 측정 연구를 위해 송신기로 태그된 Shad는 태그가 지정되지 않은 추론 모집단을 대표해야 하며 태그 또는 태그 지정 프로세스에 의해 부정적인 영향을 받아서는 안 됩니다 ^6,7.

어린 청어를 추적하는 능력을 향상시키기 위해 PNNL(Pacific Northwest National Laboratory)은 미국 청어와 유사한 압축 체형을 가진 기타 어종을 연구하기 위한 새로운 음향 마이크로 송신기를 개발했습니다. 미국산 전어와 다른 알로신을 연구할 때 흔히 겪는 어려움 중 하나는 다른 종에 비해 취급, 운송 및 꼬리표에 대한 민감성입니다. 예를 들어, Raquel et ^al.8 은 그들의 연구에서 어린 아메리카 갯청어의 취급 및 트럭 운송의 사망률이 다른 5종의 어린 물고기보다 일관되게 더 높다는 것을 발견했습니다. 어린 미국새도마뱀에 태그를 붙이려는 노력을 평가한 몇 안 되는 발표된 연구들 중에서,^{7일 후} 최저 2%9에서 태그 부착 후 48시간 후 100%까지 광범위한 생존율이 보고되었으며^, 태그가 붙은 어린 새드에 대한 장기 생존 및 전달자 보유에 대한 정보는 거의 없다.

미국 갯가마와 같은 민감한 종을 성공적으로 처리하고 태그를 지정하는 데 있어 어려움은 그들의 이주, 행동 및 서식지 사용에 대한 지식 격차를 조명했습니다. 수력 발전 댐을 통한 이동을 추적할 수 있는 능력은 미국 샤드의 통과 및 생존율에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다. 기존 수력 발전 시설에 대한 관리 결정과 이전에 연구되지 않은 어종 및 생활 단계에 대한 영향을 최소화하는 시스템에 대한 새로운 설계를 알리는 데 도움이 될 것입니다. 새로운 트랜스미터 기술이 개발됨에 따라 편향을 최소화하고 통과 및 생존을 정확하게 평가하기 위해서는 트랜스미터와 태깅 프로세스의 영향을 이해하는 것이 필수적입니다. 이 연구의 목적은 새로운 음향 마이크로 송신기로 태그된 어린 미국 샤드의 60일 생존을 평가하고 샤드에 대한 태그의 부정적인 영향을 줄여 태그가 지정되지 않은 것과 더 비교할 수 있도록 하는 처리 및 태그 지정 프로토콜을 제공하는 것이었습니다.

Protocol

PNNL은 실험동물 관리 평가 및 인증 협회(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care)의 인증을 받았습니다. 미국산 샤드는 실험동물의 관리 및 사용에 대한 연방 가이드라인에 따라 처리되었으며,11 본 연구의 프로토콜은 PNNL의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)를 준수하고 승인하여 수행되었습니다. 1. 포스트 태깅 회수 탱크의 준비 소금기가 있는 바닷물(7.5ppt)을 쉽게 구할 수 없는 경우 방출 전 1-2일 동안 적절한 통기 및 순환으로 모래를 유지하기 위한 정적 시스템을 사용하십시오(그림 1). 정적 인 원형 탱크에 에어 리프트 시스템을 설치하여 통기를 제공하십시오. PVC 파이프를 탱크 측면에 연결하여 티가 상단에 위치하고, 다른 티가 중간 근처에 있으며, 스크리닝 피팅이 파이프 바닥에 끼워지도록 합니다. 다음으로 에어 스톤을 압축 공기 라인에 연결하고 에어 스톤을 스크린 근처의 파이프 바닥에 놓습니다.알림: 스크린은 물고기가 공수 시스템으로 헤엄치는 것을 방지합니다. 에어리프트의 출구 포트(중간 PVC 티)가 약 절반 정도 잠길 때까지 탱크에 깨끗한 물을 채웁니다. 그런 다음 물을 끕니다.다음으로, 포트를 빠져나가는 폭기된 물이 물고기가 방향을 잡을 수 있는 방향 흐름을 생성할 때까지 전원을 켜고 공기 공급을 늘립니다. 상업용 바다 소금을 첨가하여 7.5ppt의 기수 염수 용액을 만들고 녹을 때까지 저어줍니다. 2. 바닷물 물고기 근원 물통 및 바닷물 마취 해결책의 준비 물 7.5L당 천일염 0.5g을 계량하여 양동이에 녹입니다.알림: 3.5단계에서 샤드를 포함하는 동일한 양의 담수를 추가하여 최종 농도 7.5ppt를 생성합니다. 다른 양동이에 물 1리터당 7.5g의 바다 소금을 계량하고 녹입니다.바닷물 1리터당 120mg의 중탄산나트륨으로 완충된 트리카인 메탄설포네이트(MS-222) 120mg을 추가합니다. 마취 버킷에 보조 공기를 추가합니다. 3. 기수 바닷물로 물 대 물 이동을 가진 모래의 수집 다른 양동이에 깨끗한 물을 부분적으로 채우고 미리 옆에 놓습니다.tag잉 소스 탱크. 그물이나 손을 사용하여 샤드가 양동이로 헤엄쳐 들어가도록 부드럽게 안내합니다. 양동이에 적절한 수의 물고기가 있으면 양동이를 똑바로 세우고 구멍이 뚫린 뚜껑으로 고정합니다. 뚜껑을 통해 여분의 물을 붓고 물고기가 목표량의 담수(즉, 최종 7.5ppt 염수 소스 버킷 부피의 절반)에 포함된 상태로 유지합니다. 2.1단계에서 준비한 바닷물 소스 버킷에 샤드와 담수를 부드럽게 붓습니다.알림: 최종 염도는 7.5ppt입니다. 용존 산소를 허용 가능한 수준으로 유지하기 위해 수족관 공기 펌프와 에어 스톤을 사용하여 사전 tag 어류 소스 버킷에 보충 공기를 제공합니다(>90% 포화가 이상적임). 4. 샤드에 음향 송신기 이식 트랜스미터를 70% 에탄올로 20분 동안 소독하고 사용하기 전에 멸균수로 헹굽니다. 매끄럽고 미세한 메쉬(~0.4mm)가 있는 딥 그물을 사용하여 소스 버킷에서 마취 버킷으로 물고기를 그물로 묶습니다. Shad는 수온 및 기타 수질 매개변수에 따라 ~2-3분 내에 평형과 척추 반사를 잃어야 합니다. 4단계로 완전히 마취되면12단계에서 장갑을 낀 손을 사용하여 물고기를 젖은 측정판에 부드럽게 올려 길이를 얻습니다. 물고기를 가라지 저울로 물이 채워진 계량 보트로 옮겨 무게를 측정합니다. 길이와 무게, 음향 태그 코드, 비늘 손실 또는 출혈과 같은 태그 부착 전 물고기의 상태에 대한 모든 설명을 기록합니다. 마취제 바닷물로 채워진 이송 용기에 물고기를 넣고 음향 송신기와 함께 물고기 외과 의사에게 전달합니다. V-홈이 있는 젖은 방수 폼 패드에 왼쪽이 아래를 향하도록 생선을 놓습니다(그림 2A).알림: V-홈은 절차 중에 물고기가 너무 많이 미끄러지는 것을 방지하고 물고기의 입 주위에 물이 고이도록 하여 아가미 위로 물을 적극적으로 끌어들일 수 있습니다. 중력 공급 저수지에 부착된 튜브를 통해 물고기의 입에 신선한 물을 공급합니다. 소독된 또는 새로운 #11 스테인리스 스틸 수술용 칼날을 사용하여 가슴 지느러미의 말단 끝 근처에 있는 근종체 사이를 수직으로 3mm 길이로 절개합니다. 필요한 경우 생선의 피부를 가리고 있는 경우 칼날 끝의 비늘을 제거하십시오.송신기를 절개 부위에 조심스럽게 삽입하고 전체 태그가 체강 내부에 놓일 때까지 뒤쪽으로 밉니다(그림 2B). 필요한 경우 메스의 뭉툭한 끝(또는 끝이 가는 집게)을 사용하여 태그를 조심스럽게 완전히 삽입합니다. 태그가 지정된 물고기를 폭기와 함께 7.5ppt 바닷물의 작은 용기에 넣어 물고기가 마취에서 회복할 수 있도록 합니다. 물고기가 평형을 되찾으면 회수 용기에서 7.5ppt의 바닷물이 들어 있는 태그 부착 후 저장 탱크로 물을 옮깁니다. 태그가 지정된 물고기가 방출 전 1-2일 동안 바닷물에서 회복되도록 합니다.

Representative Results

2020년 예비 시험과 2021년 장기 보유 연구의 두 가지 일련의 태깅 평가가 청소년 샤드 태깅의 효능을 다루기 위해 수행되었습니다. 2020년 11월 PNNL에서 새로운 음향 마이크로송신기를 미국 샤드에 이식하는 데 선호되는 방법을 결정하기 위해 예비 실험실 평가가 수행되었습니다. 프로토타입 송신기 설계(n =4, P1-P4)는 서로 다른 태깅 위치(위, 가슴, 골반 및 등)와 쌍을 이루어 총 4개의 고유한 음향 송신기 태깅 위치 처리(치료당 n =40마리, 표 1)를 결합했습니다. 모든 실험 물고기는 처리 및 저장 탱크에 무작위로 할당되었습니다. 테스트 물고기는 14일 동안 각 처리에서 동일한 수의 물고기(즉, 처리당 20마리)가 있는 2개의 저장 탱크에 보관되었습니다. 평가의 처음 2일 동안 샤드는 기수 염수(7.5ppt)에 보관하고 태깅 및 취급에서 회복되도록 했습니다. 그런 다음 평가 기간의 나머지 기간 동안 탱크를 유동 담수로 전환했습니다. 예비 평가를 위해 태그가 지정된 물고기와 지느러미 잘린 컨트롤의 크기는 포크 길이가 50-80mm였습니다. 가슴 절개를 통해 이식한 물고기의 어린 갯벌 생존율과 태그 유지율은 다른 태그 부착 기술에 비해 가장 높았습니다(그림 3). 추가 파일럿 평가는 또한 물 대 물 이동과 같은 취급 기술과 태그 부착과 같은 스트레스가 많은 사건 전후에 기수 염수에 물고기를 잡는 것이 생존율을 높이는 데 중요하다는 것을 보여주었습니다. 예비 평가의 성공적인 태깅 및 취급 프로토콜을 사용하여 2021년 PNNL에서 가슴 절개 태깅 방법을 사용하여 음향 송신기에 이식된 어린 미국 샤드의 장기 60d 생존 및 태그 유지를 평가하기 위한 실험실 연구가 수행되었습니다. 장기 평가에는 예비 평가에 사용된 P1 설계와 형태 및 크기가 유사한 개선된 프로토타입 설계인 더미 송신기 P5(그림 4)가 사용되었습니다. 더미 P5 태그의 평균 치수와 무게는 길이 7.6mm× 직경 2.3mm, 공기 중 무게 0.058g(표준 편차 0.002g)으로 태그 부담이 <1%였습니다. 기능적 구성 요소가 있는 프로토타입 음향 송신기(그림 4)의 크기는 길이 7.6mm x 직경 2.0mm이고 공기 중 무게는 0.050g입니다. 장기 평가에 사용된 어린 미국 모래는 테스트 당시 4개월 동안 포로로 잡혀 있었습니다. 이 실험은 60일 동안 두 개의 수조에 동일한 수의 처리 및 대조 물고기를 보유하도록 설계되었지만 태그 지정 시 나머지 갯지렁이 수는 낮았습니다. 따라서 섀드에 대한 태그 지정 기술의 장기적인 효능을 더 잘 이해하기 위해 대조군보다 태그가 지정된 치료 그룹에 더 많은 샤드를 무작위로 할당했습니다. 두 개의 수조에는 각각 27마리의 처리 물고기와 9-10개의 대조 물고기가 있었습니다. 그러나 A 전차(13.8%)의 생존율은 B 전차(78.4%)보다 현저히 나빴다. Fisher의 정확 검정, p < 0.001) 각 탱크 내에서 태그가 지정된 그룹과 대조군 간의 생존율 차이는 없었으며 여기에는 탱크 B에 대한 결과만 포함됩니다. 샤드(포크 길이 69-105mm, 무게 3.9-11.7g)는 가슴 절개(n =27)를 사용하여 P5 송신기로 태그하거나 대조군(n =10)에 할당했습니다. 대조군 물고기는 ~20초 동안 수술 패드에 놓이는 것을 포함하여 동일한 절차를 사용하여 처리되었지만 핀 클립이나 절개를 받지 않았으며 송신기를 이식하지도 않았습니다. 태그를 붙인 후, 두 처리 그룹은 1일 동안 기수 염수(7.5ppt)에 보관된 다음 나머지 연구 기간 동안 유동 강물로 전환했습니다. 60일 생존율은 태그가 붙은 그룹이 81.5%, 태그가 붙지 않은 대조군이 70%였다(그림 5). 이 평가에서 태그가 지정된 물고기의 생존은 원격 측정 연구에서 태그 추방을 사망 사건과 구별할 수 없기 때문에 생존 및 태그 유지로 정의되었습니다. 두 그룹 간의 생존율에는 유의한 차이가 없었다(Fisher의 정확 검정, P = 0.884). 그러나 표본 크기가 작기 때문에 차이를 탐지하는 검정력은 38.4%였습니다. 처리 간의 차이를 감지하는 능력은 낮았지만 장기 평가 결과는 이 처리 및 태깅 프로토콜을 사용하여 음향 송신기와 함께 미국 샤드를 이식하는 데 중간 정도의 성공을 거둘 수 있음을 보여줍니다. 그림 1: 기수(brageish) 염수로 채워진 사후 태깅 회수 탱크. 공수 시스템은 정적 탱크에 산소를 공급합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 : Juvenile American shad의 음향 송신기 이식. 가슴 절개가 있는 (A) 및 절개부에 더미 P5 송신기가 삽입된 (B) 청소년 미국 샤드. 샤드의 입은 파란색 튜브에서 흐르는 물에 부분적으로 잠겨 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  그림 3: 태그가 지정되지 않은 대조군 1개 그룹과 태그가 지정된 청소년 미국 샤드 그룹 4개를 사용한 예비 14일 평가에 대한 생존율. 태그 처리는 4개의 태그 위치(위, 가슴, 골반 및 등)로 구성되었으며 각 위치는 고유한 송신기 프로토타입(P1-P4)과 쌍을 이룹니다. 태그가 지정된 물고기의 생존은 생존과 태그 유지로 정의되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  그림 4: 어린 미국 청어에 태그를 지정하기 위한 음향 및 더미 송신기. (A) 기능성 음향 마이크로 송신기 및 (B) 5 d 실험실 생존 연구에 사용 된 더미 P60 프로토 타입 송신기. 눈금자의 숫자 4-7은 센티미터를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  그림 5 : 장기 60 d 보유 연구에 대한 미국 샤드의 생존율. 어린 샤드는 태그가 지정되지 않았거나(태그가 지정되지 않은 컨트롤, 실선) 더미 송신기로 태그가 지정되었습니다(태그가 지정된 [Pectoral P5]; 점선). 태그가 지정된 그룹의 생존은 생존과 태그 유지로 정의되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  태그 유형 태그 위치 N 포크 길이 (mm) 평균 태그 무게(SD; g) 태그 부담 (%) 생존율(%) 태그/클립까지의 평균 시간(Mean Time to Tag/Clip) 레인지 평균(SD) P1 (피1) 위의 40 50 – 76 60 (6.0) 0.058 (0.003) 1.5 – 5.2 45 12 P2 (P2) 가슴의 40 50 – 78 60 (7.3) 0.039 (0.001) 1.0 – 3.2 80 23 P3 시리즈 골반 40 50 – 70 58 (5.3) 0.039 (0.001) 1.0 – 4.1 55 26 P4 시리즈 등쪽 40 50 – 80 61 (6.8) 0.088 (0.004) 0 60 57 제어 NA(클립) 40 50 – 80 59 (5.7) 해당 없음 0 92.5 14 표 1: 예비 평가의 일환으로 프로토타입 송신기(P1-P4)를 이식하거나 상부 꼬리 및 하부 꼬리 지느러미 클립(대조군)으로 표시된 미국 청어에 대한 태깅 및 생존 정보.대조군의 태그 위치는 해당 없음(NA)으로, 이 물고기는 핀 클립(Clip)만 받았습니다. 태그 유형 P4는 중립적으로 부력 있는 디자인이었습니다. 평균의 표준 편차(SD)는 괄호 안에 나열되어 있습니다.

Discussion

수력 발전 시설 주변의 어린 미국 샤드 움직임을 연구해야 할 필요성으로 인해 태그가 지정된 샤드의 생존을 개선하기 위한 취급 및 태그 지정 프로토콜의 개발이 촉발되었습니다. PNNL에서는 바닷물을 사용하지 않고 새로운 음향 송신기로 어린 모래를 이식하려는 초기 시도로 24시간 이내에 100% 사망률을 기록했습니다. 그 후, 신중하게 개발된 취급 및 태깅 프로토콜은 미국 샤드에 음향 마이크로송신기를 이식할 수 있으며 높은 생존율(81.5%)로 실험실 환경에서 장기간 보관할 수 있음을 보여주었습니다. 물 밖 취급을 최소화하고 태그를 붙이기 전후에 소금기 있는 소금물을 사용하는 것이 어린 미국 전후에 태그를 붙이는 데 필수적이었습니다.

예비 평가에서 50mm의 작은 샤드는 4가지 이식 방법을 사용하여 더미 트랜스미터로 태그를 지정했습니다. 성인 샤드 13,14,15를 태그하는 가장 일반적인 방법 중 하나인 위 태그는 파일럿 테스트 중에 유망한 결과를 보였지만 예비 평가 동안 태그 손실 발생률이 높았습니다. 골반 절개를 통한 착상은 성인 트웨이트 샤드의 움직임을 연구하는 데 성공적으로 사용되었으며¹⁶ 등쪽 부착물은 어린 아메리칸 샤드의 단기 모니터링에 사용되었다¹⁰. 최근에는 가슴 절개를 통한 태그 이식을 사용하여 강과 해양 환경 모두에서 성체 전어의 장기적인 움직임을 연구했습니다¹⁷. PNNL의 예비 평가에서 가슴 절개 위치는 평가된 다른 3개 위치보다 더 나은 성능을 보였으며 7-d 태그 부착 후 생존율은 90% 이상이었습니다.

전반적으로, 이러한 평가의 결과는 태그가 지정된 샤드의 생존이 음향 송신기의 배터리 수명 기간을 초과하는 태그가 지정되지 않은 샤드의 생존과 비슷하다는 것을 보여주었으며, 이는 5초마다 전송되는 음향 신호로 ~30일이 될 것으로 예상됩니다.

이 송신기 설계 및 태깅 프로토콜은 현장 응용 분야에서 미국 청어와 같은 작고 민감하며 멸종 위기에 처한 어종을 연구할 수 있는 큰 가능성을 보여주므로 연구원이 수력 발전 시설 근처의 물고기 이동에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 이 태깅 기술은 수력 발전 댐의 배수로와 발전소에 접근할 때 음향 태깅된 어린 새의 행동을 연구하기 위해 다가오는 현장 응용 분야에서 사용될 것입니다. 하천 내 연구에서 얻은 결과는 이러한 시설의 관리 결정에 더 나은 정보를 제공할 수 있으며 어린 생애 단계 전반에 걸쳐 종을 보존하는 데 도움이 될 수 있습니다. 향후 연구에서는 현장 조건에서 강에 흐르는 물고기에 태그를 붙이고 추적하기 위한 이 절차의 효과를 평가해야 합니다. 또한 이러한 기술은 PIT(Passive Integrated Transponder) 태그를 사용하여 전신 또는 기타 민감한 종을 이식하는 데 쉽게 이전할 수 있으며, 이는 생애사 전반에 걸쳐 장기적인 모니터링을 제공할 수 있습니다.

Materials

#11 stainless steel surgical blade	Exel	29502	purchased from Med-Vet International; no real preference on blade vendor
#11 stainless steel surgical blade	Miltex	MIL4-311	purchased from Med-Vet International; no real preference on blade vendor
2 gallon bucket	Leaktite	#2GL White Pail
acoustic transmitter for American shad	Pacific Northest National Laboratory	Patent-Pending	BattelleIPID: 32500
air stone	Pentair	AS3
aquarium air pump	Tetra	Whisper
dissolved oxygen meter	YSI	ProODO or ProSolo
ethanol	Decon Laboratories	2805HC
fine mesh net	Blue Ribbon	ABLEC8
fish holding tank	Reiff Manufacturing	NA	round aquaculture tank
foam garden kneeler	Tommyco	12003
plastic storage container	Ziploc	discontinued; 8oz container with lid
PVC cement	Oatey	30821
PVC pipe	Charlotte Pipe	NA	PVC Schedule 40 2" diameter
PVC primer	Oatey	30757
PVC tee	Charlotte Pipe	NA	2" PVC Schedule 40 S x S x S Tee
sea salt	InstantOcean	SS15-10
silicone tubing 3/16"	Pentair	tp30s	tubing to supply water during tagging
sodium bicarbonate	Fisher Chemical	S233-500
sterile water	NA	NA	water is sterilized using an autoclave
tricaine methanesulfonate	Syndel USA	15650
tubing for airline	Hydromaxx	1403038050