Her beskriver vi isolasjon, kultur og adipogen induksjon av stromale vaskulære fraksjonsavledede preadipocytter fra periaorta-fettvev fra mus, noe som muliggjør studier av perivaskulær fettvevsfunksjon og dens forhold til vaskulære celler.
Perivaskulært fettvev (PVAT) er et fettvevsdepot som omgir blodkar og viser fenotypene til hvite, beige og brune adipocytter. Nylige funn har kastet lys over den sentrale rollen som PVAT i regulering av vaskulær homeostase og deltakelse i patogenesen av kardiovaskulære sykdommer. En helhetlig forståelse av PVAT egenskaper og regulering er av stor betydning for utviklingen av fremtidige terapier. Primærkulturer av periaortaadipocytter er verdifulle for å studere PVAT-funksjonen og krysstalen mellom periaortaadipocytter og karceller. Denne artikkelen presenterer en økonomisk og gjennomførbar protokoll for isolering, kultur og adipogen induksjon av stromale vaskulære fraksjonsavledede preadipocytter fra periaortafettvev fra mus, som kan være nyttig for modellering av adipogenese eller lipogenese in vitro. Protokollen skisserer vevsbehandling og celledifferensiering for dyrking av periaortaadipocytter fra unge mus. Denne protokollen vil gi den teknologiske hjørnesteinen på benksiden for undersøkelsen av PVAT-funksjonen.
Perivaskulært fettvev (PVAT), en perivaskulær struktur sammensatt av en blanding av modne adipocytter og en stromal vaskulær fraksjon (SVF), antas å interagere med den tilstøtende karveggen via sitt sekretami parakrensk1. Som en kritisk regulator av vaskulær homeostase er PVAT-dysfunksjon involvert i patogenesen av kardiovaskulære sykdommer 2,3,4. SVF for adipocyttvev består av flere forventede cellepopulasjoner, inkludert endotelceller, immunceller, mesotheliumceller, nevronceller og fettstam- og stamceller (ASPCer)5,6. Det er velkjent at ASPC-er bosatt i SVF av fettvev kan gi opphav til modne adipocytter5. SVF antas å være en kritisk kilde til modne adipocytter i PVAT. Flere studier har vist at PVAT-SVF kan differensiere til modne adipocytter under spesifikke induksjonsbetingelser 6,7,8.
For tiden er det to isolasjonssystemer for å isolere SVF fra fettvev, det ene er enzymatisk fordøyelse og det andre er ikke-enzymatisk9. Enzymatiske metoder resulterer vanligvis i et høyere utbytte av kjernefysiske stamceller10. Hittil har fordelene med SVF for å fremme vaskulær regenerering og neovaskularisering i sårheling, urogenitale og kardiovaskulære sykdommer blitt mye demonstrert11, spesielt i dermatologi og plastikkirurgi12,13. Imidlertid har de kliniske anvendelsesutsiktene for PVAT-avledet SVF ikke blitt godt utforsket, noe som kan tilskrives mangelen på en standardisert metode for isolering av SVF fra PVAT. Målet med denne protokollen er å etablere en standardisert tilnærming for isolering, kultur og adipogen induksjon av SVF-avledede preadipocytter fra muse-PVAT som omgir thorax aorta, noe som muliggjør videre undersøkelse av PVAT-funksjon. Denne protokollen optimaliserer vevsbehandling og celledifferensieringsteknikker for dyrking av periaortaadipocytter oppnådd fra unge mus.
Vi foreslår en praktisk og gjennomførbar tilnærming for isolering og adipogen induksjon av SVF-avledede preadipocytter fra periaortafettvev fra mus. Fordelene med denne protokollen er at den er enkel og økonomisk. Tilstrekkelig antall mus er avgjørende for vellykket isolasjon, da utilstrekkelig vev kan resultere i lav SVF-tetthet og dårlig veksttilstand, noe som til slutt påvirker lipogen effektivitet. I tillegg er musealder en viktig faktor å vurdere da det adipogene potensialet til SVF avtar med alderen. Rask o…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82130012 og 81830010) og Nurture-prosjektene for grunnforskning ved Shanghai Chest Hospital (tilskuddsnummer: 2022YNJCQ03).
0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
12-well plate | Labselect | 11210 | |
15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
Surgical scissor | Beyotime | FS001 |