udvikling og anvendelse af biofysiske assays til evaluering af ternær kompleks dannelse induceret af proteolyse rettet mod kimærer (PROTACS)

Summary

Her beskriver vi protokoller for den biofysiske karakterisering af ternær kompleks dannelse induceret af proteolyse rettet mod kimærer (PROTACS), der involverer ubiquitin ligaserne Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) og Cereblon (CRBN). Biofysiske metoder illustreret heri omfatter overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC).

Abstract

E3-ligaser og proteiner, der er målrettet mod nedbrydning, kan induceres til dannelse af komplekser af heterobifunktionelle molekyler i en flertrinsproces. Kinetikken og termodynamikken af de involverede interaktioner bidrager til effektiviteten af ubiquitination og deraf følgende nedbrydning af proteinet. Biofysiske teknikker såsom overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) giver værdifuld information, der kan bruges til optimering af disse interaktioner. Ved hjælp af to modelsystemer blev der etableret et biofysisk assayværktøjssæt til forståelse af kooperativiteten af ternær kompleks dannelse og virkningen af ‘krogeffekten’ på bindingskinetikken. I et tilfælde blev et proteolyse rettet mod kimær (PROTAC) molekyle, der inducerede ternær kompleks dannelse mellem Brd4^BD2 og VHL, evalueret. Det heterobifunktionelle molekyle, MZ1, har nM-affiniteter for både Brd4^{BD2-proteinet} (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) og VHL-komplekset (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Til dette system blev der udviklet robuste SPR-, BLI- og ITC-assays, der gengav offentliggjorte resultater, der demonstrerede samarbejdsevnen af ternær kompleks dannelse. I det andet tilfælde blev et molekyle, der inducerede ternære komplekser mellem et 46,0 kDa-protein, PPM1D og cereblon [CRBN (319-442)] undersøgt. Det heterobifunktionelle molekyle, BRD-5110, har en SPR K D = 1 nM for PPM1D, men meget svagere binding mod det afkortede CRBN (319-442) kompleks (SPR K_D = ~ 3 μM). I dette tilfælde var bindingen for CRBN i SPR ikke mættet, hvilket resulterede i en “krogeffekt”. Krav til gennemløb og reagens for SPR, BLI og ITC blev evalueret, og der blev givet generelle anbefalinger til deres anvendelse på PROTAC-projekter.

Introduction

Polyubiquitinering af proteiner i cellen er en stramt reguleret proces, der involverer enzymer i Ubiquitin Ligase-familien ^1,2. De terminale enzymer i vejen er E3 ubiquitin ligaser, der kovalent binder ubiquitinmolekyler til deres proteinbindende partnere³. Polyubiquitinationen af disse proteinbindende partnere er rettet mod dem til proteolytisk nedbrydning af proteasomet⁴. Dette system er en del af proteinhomeostaseprocessen, der er blevet terapeutisk udnyttet til at fremkalde nedbrydning af proteiner involveret i sygdom⁵. Små molekyler, der inducerer interaktionen mellem E3 ubiquitinligaser, såsom Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) eller cereblon (CRBN), består typisk af et E3-ligasebindende sprænghoved forbundet med en fleksibel linker til et sprænghoved, der binder til proteinet, der er målrettet mod nedbrydning. Disse heterobifunktionelle molekyler kaldes almindeligvis proteolyse rettet mod kimærer eller PROTACS⁶.

Udviklingen af PROTACS indebærer evaluering af molekylers evne til at inducere nedbrydning af proteiner i celler. Mange cellulære analysesystemer er blevet udviklet, der overvåger den inducerede interaktion mellem målproteinet og E3-ligasekomponenterne, såsom VHL eller CRBN, efter behandling af cellerne med et PROTAC-molekyle. Et sådant cellulært assay, nanoluc-Halotag-systemet⁷, involverer en E3-ligase fusioneret til Halotag-acceptoren og et målprotein mærket med en nanoluc-donor. Ternær kompleks dannelse bringer nanolucdonoren og Halotag-acceptoren i nærhed, hvilket muliggør overførsel af energi fra donoren til acceptoren, hvilket resulterer i udsendelse af lys. Variationer af dette system kan bruges til at vurdere den cellulære permeabilitet af PROTACS-molekyler⁸ eller ændringer i det relative niveau af målproteinubiquitination⁹. Mens disse cellulære systemer er afgørende for at drive optimeringen af PROTACS, er dannelsen af komplekser mellem E3-ligaser og proteiner, der er målrettet mod nedbrydning, en flertrinsproces^10,11. Kinetikken og termodynamikken i de involverede binære og ternære interaktioner bidrager til effektivitet, ubiquitination og deraf følgende nedbrydning af proteinet^12,13,14.

Heri beskrives protokoller, der kan tilpasses til den biofysiske karakterisering af ternær kompleks dannelse induceret af PROTACS ved anvendelse af overfladeplasmonresonans (SPR), biolagsinterferometri (BLI) og isotermisk titreringskalorimetri (ITC). SPR- og ITC-protokoller for MZ1 PROTAC-molekylet, der inducerer ternær kompleks dannelse mellem Brd4^BD2 og VHL afledt af litteraturrapporter^13,15 og beskrevet her, var i stand til at rekapitulere de rapporterede resultater med en vis ændring af de rapporterede procedurer^, som vil blive diskuteret. En beskrivelse af et BLI-assay, der anvendes til at evaluere ternær kompleks dannelse mellem MZI, Brd4^BD2 og VHL, er inkluderet i denne rapport. Affinitetsmålinger fra BLI var konsistente med dem, der blev observeret i SPR og ITC. En tidligere offentliggjort protokol, hvori der blev udviklet et SPR-assay til vurdering af den PROTAC-inducerede ternære komplekse dannelse mellem PPM1D, en Ser/Thr-proteinphosphatase, hvis ekspression induceres på en p53-afhængig måde¹⁶, og CRBN, beskrives også. I dette tilfælde har PROTAC-molekylet en nanomolær affinitet for PPM1D, men kun en mikromolær affinitet for CRBN. I dette tilfælde er bindingen af PROTAC-molekylet til CRBN ikke mættet, hvilket resulterer i den almindeligt observerede “krogeffekt”. Krogeffekten er en egenskab ved tre kropssystemer, hvor der er to arter, der kan danne et heterotrimerisk kompleks, når begge er bundet til et bromolekyle (figur 1)¹⁷. Krogeffekten observeres, når brobygningsarten er i overskydende koncentration i forhold til de to andre arter. Den resulterende tilstand er en, hvor de binære interaktioner udkonkurrerer de ternære interaktioner. De systemer, hvor krogeffekten observeres, kræver specifikke eksperimentelle designovervejelser, der diskuteres i denne rapport. Generelle begreber og reagenskrav til evaluering af anvendelsen af biofysiske assays til evaluering af PROTAC-induceret ternær kompleks dannelse er tilvejebragt.

Protocol

Alle proteinerne blev overudtrykt i E. coli med godt udbytte og renhed (>80%) efter litteraturprotokollerne18. Biotinylering blev udført under anvendelse af en BirA-katalyseret reaktion18. Alle små molekyler blev fremstillet ved 1 mM stamopløsninger i 100% DMSO. De procedurer, der er beskrevet heri, kræver ikke specialiseret laboratoriesikkerhedsudstyr eller forholdsregler. Standard laboratorie personlige værnemidler (PPE) bør anvendes (dvs. lab coat, sikkerh…

Representative Results

Karakterisering af VHL: MZ1 binært kompleks og VHL: MZ1: Brd4BD2 ternært kompleks kan findes i figur 2 (ITC), figur 3 (BLI) og figur 4 (SPR) ved hjælp af en meget lignende buffer. KD ekstraheret fra ortogonale assays er konsistent. Kooperativiteten kan beregnes af K D (binær) / KD (ternær), hvilket er meget positivt (15 fra ITC eller 26 fra SPR). Karakteris…

Discussion

Biofysisk karakterisering af de binære og ternære interaktioner mellem PROTAC-molekyler og deres proteinbindende partnere kan give unik og komplementær indsigt i forhold til udbredte cellulære systemer. Forståelse af affiniteten mellem hvert sprænghoved af et PROTAC-molekyle og dets proteinbindende partnere kan hjælpe med at guide medicinalkemiske bestræbelser mod optimering af disse interaktioner. Tidligere publicerede krystalstrukturer af ternære PROTAC-komplekser har afsløret, at atomer i linkerregionen kan …

Materials

96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments