le développement et l’application de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par la protéolyse ciblant les chimères (PROTACS)

Summary

Nous décrivons ici des protocoles pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par protéolyse ciblant les chimères (PROTACS) qui impliquent les ubiquitine ligases Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) et Cereblon (CRBN). Les méthodes biophysiques illustrées ici comprennent la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie de biocouche (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC).

Abstract

Les ligases E3 et les protéines ciblées pour la dégradation peuvent être induites à former des complexes par des molécules hétérobifonctionnelles dans un processus en plusieurs étapes. La cinétique et la thermodynamique des interactions impliquées contribuent à l’efficacité de l’ubiquitination et à la dégradation de la protéine qui en résulte. Les techniques biophysiques telles que la résonance plasmonique de surface (SPR), l’interférométrie des biocouches (BLI) et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) fournissent des informations précieuses qui peuvent être utilisées dans l’optimisation de ces interactions. À l’aide de deux systèmes modèles, une boîte à outils de dosage biophysique pour comprendre la coopérativité de la formation de complexes ternaires et l’impact de « l’effet crochet » sur la cinétique de liaison a été établie. Dans un cas, une molécule de protéolyse ciblant la chimère (PROTAC) qui induisait la formation d’un complexe ternaire entre Brd4^BD2 et VHL a été évaluée. La molécule hétérobifonctionnelle, MZ1, a des affinités nM à la fois pour la protéine Brd4^BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) et pour le complexe VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Pour ce système, des tests SPR, BLI et ITC robustes ont été développés qui ont reproduit les résultats publiés démontrant la coopérativité de la formation de complexes ternaires. Dans l’autre cas, une molécule induisant des complexes ternaires entre une protéine de 46,0 kDa, PPM1D, et le cerveau [CRBN (319-442)] a été étudiée. La molécule hétérobifonctionnelle, BRD-5110, a un SPR K_D = 1 nM pour PPM1D mais une liaison beaucoup plus faible contre le complexe CRBN tronqué (319-442) (SPR K_D= ~ 3 μM). Dans ce cas, la liaison pour le CRBN dans le SPR n’était pas saturable, ce qui a entraîné un « effet d’hameçon ». Les exigences en matière de débit et de réactifs pour le SPR, le BLI et l’ITC ont été évaluées, et des recommandations générales pour leur application aux projets PROTAC ont été fournies.

Introduction

La polyubiquitination des protéines dans la cellule est un processus étroitement régulé qui implique des enzymes de la famille des ubiquitines ligases ^1,2. Les enzymes terminales de la voie sont les ubiquitine ligases E3 qui attachent de manière covalente les molécules d’ubiquitine à leurs partenaires de liaison aux protéines³. La polyubiquitination de ces partenaires de liaison aux protéines les cible pour la dégradation protéolytique par le protéasome⁴. Ce système fait partie du processus d’homéostasie des protéines qui a été exploité thérapeutiquement pour induire la dégradation des protéines impliquées dans la maladie⁵. Les petites molécules qui induisent l’interaction entre les ligases de l’ubiquitine E3, telles que la ligase E3 de Von Hippel-Lindau (VHL) ou le cerveau (CRBN), sont généralement composées d’une ogive de liaison à la ligase E3 reliée par un liant flexible à une ogive qui se lie à la protéine ciblée pour la dégradation. Ces molécules hétérobifonctionnelles sont communément appelées chimères ciblant la protéolyse ou PROTACS⁶.

Le développement de PROTACS consiste à évaluer la capacité des molécules à induire la dégradation des protéines dans les cellules. De nombreux systèmes de dosage cellulaire ont été développés pour surveiller l’interaction induite entre la protéine cible et les composants de la ligase E3, tels que VHL ou CRBN, lors du traitement des cellules avec une molécule PROTAC. L’un de ces tests cellulaires, le système nanoluc-Halotag⁷, implique une ligase E3 fusionnée à l’accepteur Halotag et une protéine cible marquée avec un donneur nanoluc. La formation d’un complexe ternaire rapproche le donneur nanoluc et l’accepteur Halotag, ce qui permet le transfert d’énergie du donneur à l’accepteur, ce qui entraîne l’émission de lumière. Les variations de ce système peuvent être utilisées pour évaluer la perméabilité cellulaire des molécules PROTACS⁸ ou les changements dans le niveau relatif d’ubiquitination de la protéine cible⁹. Bien que ces systèmes cellulaires soient essentiels à l’optimisation de PROTACS, la formation de complexes entre les ligases E3 et les protéines ciblées pour la dégradation est un processus en plusieurs étapes^10,11. La cinétique et la thermodynamique des interactions binaires et ternaires impliquées contribuent à l’ubiquitination de l’efficacité et à la dégradation de la protéine^12,13,14 qui en résulte.

On y décrit des protocoles qui peuvent être adaptés pour la caractérisation biophysique de la formation de complexes ternaires induite par PROTACS à l’aide de la résonance plasmonique de surface (SPR), de l’interférométrie de biocouche (BLI) et de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC). Les protocoles SPR et ITC pour la molécule MZ1 PROTAC qui induit la formation de complexes ternaires entre Brd4^BD2 et VHL dérivés des rapports de littérature^13,15 et décrits ici ont permis de récapituler les résultats rapportés avec quelques modifications des procédures rapportées^, qui seront discutées. Une description d’un test BLI utilisé pour évaluer la formation de complexes ternaires entre MZI, Brd4^BD2 et VHL est incluse dans ce rapport. Les mesures d’affinité de BLI étaient cohérentes avec celles observées dans le SPR et l’ITC. Un protocole précédemment publié dans lequel un test SPR a été développé pour évaluer la formation de complexes ternaires induite par PROTAC entre PPM1D, une protéine phosphatase Ser/Thr dont l’expression est induite de manière dépendante de p53¹⁶, et CRBN est également décrit. Dans ce cas, la molécule PROTAC a une affinité nanomolaire pour PPM1D mais seulement une affinité micromolaire pour CRBN. Dans ce cas, la liaison de la molécule PROTAC au CRBN n’est pas saturable, ce qui entraîne l’« effet crochet » couramment observé. L’effet d’hameçon est une propriété de trois systèmes corporels dans lesquels il y a deux espèces qui peuvent former un complexe hétérotrimérique lorsque les deux sont liées à une molécule de pontage (Figure 1)¹⁷. L’effet d’hameçon est observé lorsque l’espèce pontière est en concentration excessive par rapport aux deux autres espèces. L’état résultant est un état dans lequel les interactions binaires surpassent les interactions ternaires. Les systèmes où l’effet d’hameçon est observé nécessitent des considérations spécifiques sur la conception expérimentale discutées dans le présent rapport. Des concepts généraux et des exigences en réactifs pour l’évaluation de l’utilisation de tests biophysiques pour l’évaluation de la formation de complexes ternaires induite par PROTAC sont fournis.

Protocol

Toutes les protéines ont été surexprimées dans E. coli avec un bon rendement et une bonne pureté (>80%) selon les protocoles de la littérature18. La biotinylation a été réalisée à l’aide d’une réaction catalysée par BirA18. Toutes les petites molécules ont été préparées à 1 mM de solutions mères dans du DMSO à 100 %. Les procédures décrites dans le présent document ne nécessitent pas d’équipement de sécurité ou de précautions de l…

Representative Results

La caractérisation du complexe binaire VHL : MZ1 et du complexe ternaire VHL : MZ1 : Brd4BD2 peut être trouvée dans la Figure 2 (ITC), la Figure 3 (BLI) et la Figure 4 (SPR) en utilisant un tampon très similaire. Le KD extrait des tests orthogonaux est cohérent. La coopérativité peut être calculée par K D (binaire) / KD (ternaire), ce qui est très positif (15 de l’ITC ou 26 de …

Discussion

La caractérisation biophysique des interactions binaires et ternaires entre les molécules PROTAC et leurs partenaires de liaison aux protéines peut fournir des informations uniques et complémentaires par rapport aux systèmes cellulaires largement utilisés. Comprendre l’affinité entre chaque ogive d’une molécule PROTAC et ses partenaires de liaison aux protéines peut aider à orienter les efforts de chimie médicinale vers l’optimisation de ces interactions. Des structures cristallines de complexes PROTAC t…

Materials

96-plate	Greiner	655076	flat-bottom, black plates used In BLI experiments
96-well plate	Nunc	73520-120	Plate use for ITC sample preparation
96-well plate	Greiner	650101	Plate used to prepare samples for SPR experiments
Auto iTC200 micro-calorimeter	Malvern Panalytical		Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Instrument used to perform SPR experiments
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2
NTA sensor chip	Cytiva	BR100532	SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued.
Plate cover	Malvern	PQA0001	Cover for Nunc 96-well plate (73520-120)
Plate cover	Cytiva	28975816	Plate cover for Greiner plate (650101)
Series S SA sensor chip	Cytiva	BR100531	SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors	Sartorius	18-509	Coated sensors used in BLI experiments