유전자 조작 마우스 모델에서 악성 말초 신경초 종양 식별, 진단 및 등급 지정
Summary
우리는 유전자 조작 쥐의 신경계 신생물이 인간 쥐의 병리를 정확하게 재현하는지 여부를 평가하는 방법론을 개발했습니다. 여기서는 이러한 조직학적 기술, 정의된 병리학적 기준 및 배양 방법론을 P 0-GGFβ3 마우스 모델에서 발생하는 신경섬유종 및 악성 말초 신경초 종양에 적용합니다.
Abstract
상염색체 우성 종양 감수성 증후군인 신경섬유종증 1형(NF1) 환자는 일반적으로 망상신경섬유종(PN)이 발생하며, 이후 매우 공격적인 악성 말초 신경초초 종양(MPNST)으로 변합니다. PN이 MPNST로 전환되는 과정을 이해하는 것은 NF1이 있는 인간에게서 볼 수 있는 PN-MPNST 진행을 정확하게 복제하는 유전자 조작 마우스(GEM) 모델의 가용성에 의해 촉진될 것입니다. 불행히도 Nf1 절제가 있는 GEM 모델은 이 프로세스를 완전히 재현하지 못합니다. 이를 통해 슈반(Schwann) 세포에서 미토겐 뉴레굴린-1(NRG1)이 과발현되어 고주파의 MPNST로 발전하는 PN이 발생하는 GEM 모델인 P 0-GGFβ3 마우스를 개발하게 되었습니다. 그러나 P 0-GGFβ3 마우스의 종양형성 및 종양 진행이 NF1 환자에서 관찰되는 과정을 정확하게 모델링하는지 여부를 결정하기 위해서는 먼저 P0-GGFβ3 말초 신경초 종양의 병리학이 인간 종양의 병리를 재현한다는 것을 증명해야 했습니다.
여기에서는 P 0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3을 사용하여 GEM 모델에서 말초 신경계 신생물을 정확하게 진단하고 등급을 매기는 데 사용되는 특수 방법론을 설명합니다. Trp53+/- 마우스를 예로 들 수 있습니다. PN 및 MPNST를 진단하는 데 사용되는 조직학적, 면역조직화학적, 조직화학적 방법, 이러한 신생물을 병리학을 모방하는 다른 종양 유형과 구별하는 방법 및 이러한 신생물의 등급을 매기는 방법에 대해 설명합니다. GEM MPNST의 초기 배양 확립, 면역세포화학을 사용하여 이러한 배양을 특성화하는 방법, 동종 이식편을 설정하여 종양원성을 검증하는 방법에 대해 논의합니다. 종합적으로 이러한 기술은 GEM 모델에서 발생하는 PN 및 MPNST의 병리를 특성화하고 이러한 쥐 종양의 병리학을 인간 종양과 비판적으로 비교합니다.
Introduction
지난 30년 동안 수많은 실험실에서 인간 암 관련 돌연변이를 마우스 게놈에 도입하거나 인간 암에서 과발현되는 유전자 산물을 과발현하여 인간 암의 마우스 모델을 만들려고 시도했습니다. 그 결과 유전자 조작 마우스(GEM) 모델은 새로 도입된 게놈 변형이 종양 형성을 시작한다는 것을 확립하고, 종양 진행에 기여하는 다른 후속 유전적 또는 후성유전학적 변화를 식별하고, 종양 시작 및 진행을 유도하는 주요 신호 전달 경로를 정의하는 등 다양한 목적으로 사용할 수 있습니다. 면역 결핍 마우스의 사용에 의존하는 orthotopic 이종이식 모델과 달리 GEM 암 모델은 완전한 기능을 갖춘 면역 체계를 가지고 있으므로 후보 치료제에 대한 반응을 보다 정확하게 모델링할 수 있습니다. 그러나 이와 같은 목적으로 GEM 암 모델을 사용할 때는 조사관이 GEM 신생물로 관찰한 것이 인간 신생물과 관련이 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이 검증에는 GEM 신생물의 병리학에 대한 철저한 평가와 GEM 신생물의 병리학적 특징이 해당 인간 종양 유형의 병리를 재현하는지 여부에 대한 결정이 포함되어야 합니다.
종양 감수성 증후군 신경섬유종증 1형(NF1)은 인간 신경계에 영향을 미치는 가장 흔한 유전 질환으로, 출생아 3,000-3,500명당 약 1명꼴로 발생합니다 1,2,3. NF1에 감염된 개인은 피부(피부 신경 섬유종)와 큰 신경 및 신경총(망상 신경 섬유종)에 신경 섬유종으로 알려진 여러 양성 말초 신경초 종양이 발생합니다. 진피 신경섬유종과 망상신경섬유종은 모두 신체적, 행동적, 사회적 장애를 일으켜 환자의 삶의 질을 악화시키지만, 망상신경섬유종(PN)은 특히 위험하다 4,5. 이는 PN이 생존율이 매우 낮은 공격적인 방추세포 신생물인 악성 말초신경초종양(MPNST)으로 자주 변형되기 때문입니다 1,2. 이러한 낮은 생존율은 대부분 현재 MPNST를 치료하는 데 사용되는 방사선 및 화학 요법이 효과가 없기 때문입니다. 그러나 새롭고 더 효과적인 치료법을 개발하는 것은 어려운 일이었습니다. 이는 NF1 환자에서 MPNST가 얼마나 흔하게 발생하는지에도 불구하고 여전히 희귀한 신생물이기 때문입니다. 결과적으로, 연구를 위해 많은 수의 인간 종양을 얻는 것은 매우 어렵습니다. 임상시험을 위해 MPNST를 가진 충분한 환자를 모집하는 것도 어렵습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 신경섬유종 발병기전 및 PN-MPNST 진행을 유발하는 이상에 대한 추가 통찰력을 얻고 후보 치료제에 대한 전임상 시험을 촉진하는 것을 목표로 여러 GEM 모델이 생성되었습니다.
NF1 환자는 NF1 유전자의 한 사본에 불활성화 돌연변이가 있습니다. 신경섬유종 발병기전은 Schwann 세포 계통의 세포에서 나머지 기능적 NF1 유전자의 불활성화 돌연변이가 발생할 때 유발됩니다. 그러나 놀랍게도, 생식세포가 Nf1 돌연변이를 비활성화한 마우스를 생성했을 때, 그들은 신경섬유종 6,7을 개발하지 않았다. 다른 모든 세포 유형에서 Nf1-null Schwann 세포 및 Nf1 하플로불충분을 가진 마우스(Krox20-Cre;Nf1flox/- 마우스)가 발달한 망상형 신경섬유종(plexiform neurofibromas)은 신경섬유종 발병기전을 위해 추가적인 세포 유형에서 감소된 Nf1 유전자 투여량이 필요하다는 것을 시사했다8. 그럼에도 불구하고 Krox20-Cre의 망상 신경 섬유종; Nf1flox/- 마우스는 MPNST로 진행되지 않았으므로 인간 마우스의 생물학을 부분적으로만 모방했습니다. MPNST 발병기전은 Nf1 돌연변이가 Trp539 또는 Cdkn2a10과 같은 추가 종양 억제 유전자의 돌연변이와 짝을 이룰 때 발생했지만, 이러한 GEM 모델의 MPNST는 기존의 양성 신경총형 신경섬유종(benign plexiform neurofibromas)이 아닌 불확실한 생물학적 전위(ANNUBP)의 비정형 신경섬유종 신생물(atypical neurofibromatous neoplasm)에서 발생하거나 발생했다(13,14 참조). Suz12 및 Pten15와 같은 유전자에서 추가적인 MPNST 관련 기능 돌연변이를 도입하는 다른 모델뿐만 아니라 이러한 모델에 대한 우수한 검토를 위해).
이러한 마우스 모델은 NF1, TP53 및 CDKN2A와 같은 유전자가 NF1 관련 말초 신경계 신생물의 발병기전에서 수행하는 역할을 규명하고 후보 치료제를 테스트하는 전임상 시험에 매우 중요합니다. 그러나 우리는 여전히 망상형 신경섬유종이 불확실한 생물학적 잠재력(ANNUBPs16)의 비정형 신경섬유종성 신생물이 된 다음 MPNST가 되는 과정에 대해 불완전하게 이해하고 있습니다. Nf1 및 Arf에서 결실이 있는 마우스가 MPNST로 진행되는 ANNUBP를 개발한다는 최근 보고와 함께 이 과정을 이해하는 데 약간의 진전이 있었습니다11. 그러나 인간에서 볼 수 있는 망상형 신경섬유종-MPNST 진행 과정을 완전히 재현하는 Nf1 돌연변이 기반 마우스 모델은 아직 존재하지 않습니다. 또한 MPNST의 개발로 이어지는 여러 가지 뚜렷한 경로가 있는지 여부도 명확하지 않습니다. 이를 감안할 때, 위에서 설명한 GEM은 신경섬유종-MPNST 진행 및 MPNST 발병기전으로 이어지는 여러 다른 경로의 하위 집합만 모델링할 수 있습니다. 이 점은 MPNST가 또한 산발적으로 발생한다는 사실과 일부 산발적인 MPNST는 명백히 NF1 돌연변이를 가지고 있지 않다는 사실에 의해 강조된다17,18.
NF1 돌연변이가 결핍된 적어도 일부 산발성 MPNST는 흑색종 또는 다른 유형의 육종이라는 Magollon-Lorenz et al.의 최근 제안에 의해 이 후자의 주장에 도전받았지만, 우리는 최근에 산발적인 MPNST와 NF1 야생형20인 이 종양(2XSB 세포)에서 유래한 세포주를 보고했습니다. 모종양과 2XSB 세포주를 특성화하는 동안, 흑색종 및 산발성 악성 말초신경초 종양의 감별 진단에서 일상적으로 고려되는 여러 다른 육종 유형을 포함한 대체 진단 가능성을 체계적으로 배제했다20. 또한, Magollon-Lorenz 등은 그들이 연구한 3개의 산발적인 MPNST 세포주에서 발견한 결과가 산발성 MPNST로 확인된 모든 종양이 MPNST가 아니라는 것을 나타내기 위해 일반화할 수 없다는 것을 인정했습니다.
신경섬유종과 MPNST 발병기전이 특정 종양 억제 유전자 돌연변이에 반드시 의존하지 않는 GEM 모델을 구축하기 위해, 슈반(Schwann) 세포 특이적 미엘린 단백질 제로(P0) 프로모터(P 0-GGFβ3 마우스)에 의해 강력한 슈반(Schwann) 세포 미토겐 뉴레굴린-1(NRG1)의 과발현이 유도되는 형질전환 마우스를 생성했습니다.21. 우리는 이전에 인간 신경섬유종, MPNST 및 MPNST 세포주가 NRG1 신호전달을 매개하는 erbB 수용체 티로신 키나아제(erbB2, erbB3 및 erbB4)와 함께 여러 NRG1 동형을 발현하고 이러한 erbB 수용체가 구성적으로 활성화됨을 보여주었습니다22. 또한 erbB 키나아제의 약리학적 억제제가 MPNST 증식22, 생존23 및 이동을 강력하게 억제한다는 것을 입증했다24. 인간에 대한 우리의 관찰에 따라, P 0-GGFβ3 마우스는 고주파 21,25에서 MPNST로 진행되는 망상형 신경섬유종(plexiform neurofibroma)25을 발달시킨다. P0-GGFβ3 MPNST는 인간과 마찬가지로 일반적으로 Trp53 및 Cdkn2a의 돌연변이뿐만 아니라 종양형성에 잠재적으로 기여할 수 있는 수많은 다른 유전체 이상을 발생시킨다는 것을 보여주었다25. P 0-GGFβ3 마우스에서 발생하는 MPNST는 비활성화 Nf1 돌연변이를 갖지 않습니다. 그러나, 유전자 보완을 이용하여, NRG1이 Nf1 손실에 의해 변경되는 동일한 신호전달 캐스케이드를 통해 주로 P 0-GGFβ3 마우스에서 종양형성을 촉진한다는 것을 보여주었다26; 이 결론은 Trp53 하플로인부전(haploinsufficiency)이 있는 상태에서 Nf1 손실을 NRG1 과발현으로 대체한다는 우리의 발견에 근거한다(P0-GGFβ3;Trp53+/- 마우스)는 cis-Nf1+/-에서 볼 수 있듯이 MPNST가 de novo로 발달하는 동물을 생산합니다. Trp53+/- 마우스27.
P 0-GGFβ3 마우스가 NF1을 가진 인간에서 볼 수 있는 신경섬유종 발병 및 신경섬유종-MPNST 진행 과정을 정확하게 모델링한다는 것을 입증하는 이 정보와 기타 정보를 얻기 위해 당사는 이러한 동물의 조직을 처리하고, 종양을 정확하게 진단하고, 이러한 마우스에서 발생하는 MPNST의 등급을 매기고, 초기 통과 P0-GGFβ3 및 P0-GGFβ3을 확립하고 특성화하는 특수 방법론을 개발했습니다. Trp53+/- MPNST 배양 및 P 0-GGFβ3 PN 및 MPNST와 P0-GGFβ3의 병리학을 비판적으로 비교; Trp53+/- MPNST를 인간과 비교합니다. 이러한 방법론 중 다수는 신경계 종양의 다른 GEM 모델로 일반화할 수 있습니다. 또한 이러한 방법론 중 일부는 다른 장기 부위에서 신생물이 발생하는 GEM 모델에 더 광범위하게 적용할 수 있습니다. 따라서 여기서는 이러한 방법론에 대한 자세한 설명을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 제시된 조직학적 및 생화학적 방법은 신경섬유종 및 MPNST 발병기전의 GEM 모델을 진단하고 특성화하기 위한 프레임워크를 제공합니다. 수년에 걸쳐, 우리는 이러한 방법론이 GEM 모델 21,25,26에서 발생하는 말초 신경초 종양의 병리학을 평가하는 데 매우 유용하다는 것을 발견했다. 그러나 여기에 설명된 프로토콜은 GEM 모…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 신경 질환 및 뇌졸중 연구소(R01 NS048353 및 R01 NS109655 SLC의 보조금으로 지원되었습니다. R01 NS109655-03S1 – D.P.J.), 국립 암 연구소(R01 CA122804 – S.L.C.) 및 국방부(X81XWH-09-1-0086 및 W81XWH-12-1-0164 – S.L.C.).
Materials
| 100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
| 3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
| 6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
| Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
| Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
| Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
| CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
| CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
| CD31 | ABCAM | ab29364 | |
| CD34 | ABCAM | ab81289 | |
| CD86 | ABCAM | ab53004 | |
| Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
| Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
| Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
| Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
| Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
| Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
| Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| DMEM | Corning | 15-013-CV | |
| Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
| Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
| Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
| Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
| Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
| Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
| ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
| Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| Liquid Nitrogen | |||
| MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
| Microtome | |||
| Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
| Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
| Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
| Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
| P0-GGFβ3 mice | In house | ||
| Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
| Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
| Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
| pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
| Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
| PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
| Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
| PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
| Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
| S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
| SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
| Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
| Steel histology mold | |||
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
| Tissue Cassette | |||
| Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
| Trypsin | Corning | 25-051-31 |
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