Identificere, diagnosticere og klassificere maligne perifere nerveskedetumorer i genetisk manipulerede musemodeller

Summary

Vi har udviklet en metode til at vurdere, om nervesystemets neoplasmer i gensplejsede mus præcist rekapitulerer patologien hos deres menneskelige modstykker. Her anvender vi disse histologiske teknikker, definerede patologiske kriterier og kulturmetoder til neurofibromer og ondartede perifere nerveskedetumorer, der opstår i P 0-GGFβ3-musemodellen.

Abstract

Patienter med autosomal dominant tumor susceptibility syndrom neurofibromatosis type 1 (NF1) almindeligvis udvikle plexiform neurofibromer (PNs), der efterfølgende omdannes til meget aggressive maligne perifere nerveskede tumorer (MPNSTs). Forståelse af den proces, hvormed en PN omdannes til en MPNST, ville blive lettet af tilgængeligheden af genetisk manipulerede mus (GEM) modeller, der nøjagtigt replikerer PN-MPNST-progressionen, der ses hos mennesker med NF1. Desværre rekapitulerer GEM-modeller med Nf1-ablation ikke denne proces fuldt ud. Dette førte os til at udvikle P 0-GGFβ3-mus, en GEM-model, hvor overekspression af Schwann-cellens mitogenneuregulin-1 (NRG1) i Schwann-celler resulterer i udvikling af PN’er, der udvikler sig til at blive MPNST’er med høj frekvens. For at afgøre, om tumorigenese og neoplastisk progression i P 0-GGFβ3-mus nøjagtigt modellerer de processer, der ses hos NF1-patienter, måtte vi først bevise, at patologien for P_0-GGFβ3 perifere nervekappetumorer rekapitulerer patologien hos deres menneskelige kolleger.

Her beskriver vi de specialiserede metoder, der anvendes til nøjagtigt at diagnosticere og klassificere neoplasmer i perifert nervesystem i GEM-modeller ved hjælp af P 0-GGFβ3 og P_0-GGFβ3; Trp53^+/- mus som eksempel. Vi beskriver de histologiske, immunohistokemiske og histokemiske metoder, der anvendes til at diagnosticere PN’er og MPNST’er, hvordan man skelner disse neoplasmer fra andre tumortyper, der efterligner deres patologi, og hvordan man klassificerer disse neoplasmer. Vi diskuterer etablering af tidlige passagekulturer fra GEM MPNST’er, hvordan man karakteriserer disse kulturer ved hjælp af immuncytokemi, og hvordan man verificerer deres tumorigenicitet ved at etablere allotransplantater. Samlet set karakteriserer disse teknikker patologien af PN’er og MPNST’er, der opstår i GEM-modeller og sammenligner kritisk patologien af disse murintumorer med deres menneskelige modstykker.

Introduction

I løbet af de sidste tre årtier har adskillige laboratorier forsøgt at skabe musemodeller af humane kræftformer ved at indføre humane kræftassocierede mutationer i musegenomet eller ved at overudtrykke et genprodukt, der er overudtrykt i humane kræftformer. De resulterende genetisk manipulerede mus (GEM) modeller kan anvendes til en række formål, såsom at fastslå, at den nyligt introducerede genomiske modifikation initierer tumorgenese, identificere andre efterfølgende forekommende genetiske eller epigenetiske ændringer, der bidrager til tumorprogression, og definere de vigtigste signalveje, der driver tumorinitiering og progression. I modsætning til ortopiske xenograftmodeller, der er afhængige af brugen af immundefekte mus, har GEM-kræftmodeller et fuldt funktionelt immunsystem og så mere præcist modelresponser på kandidatterapeutiske midler. Men når man bruger GEM-kræftmodeller til formål som disse, er det vigtigt, at efterforskere bekræfter, at observationer foretaget med GEM-neoplasmer er relevante for deres menneskelige modstykker. Denne validering bør omfatte en grundig vurdering af GEM-neoplasmernes patologi og en bestemmelse af, om de patologiske træk ved GEM-neoplasmerne rekapitulerer patologien af den tilsvarende humane tumortype.

Tumorfølsomhedssyndromet neurofibromatosis type 1 (NF1) er den mest almindelige genetiske sygdom, der påvirker det menneskelige nervesystem, der forekommer hos ca. 1 ud af hver 3.000-3.500 levendefødte ^1,2,3. Personer ramt af NF1 udvikle flere godartede perifere nerveskede tumorer kendt som neurofibromer i deres hud (dermale neurofibromer) og i store nerver og nerveplexuser (plexiform neurofibromer). Mens både dermale og plexiforme neurofibromer forværrer patientens livskvalitet ved at producere fysisk, adfærdsmæssig og / eller social svækkelse, er plexiforme neurofibromer (PN’er) særligt farlige ^4,5. Dette skyldes, at PN’er ofte omdannes til ondartede perifere nerveskedetumorer (MPNST’er), som er aggressive spindelcelleneoplasmer med en usædvanlig lav overlevelsesrate ^1,2. I vid udstrækning skyldes denne lave overlevelsesrate, at de radio- og kemoterapeutiske regimer, der i øjeblikket anvendes til behandling af MPNST’er, er ineffektive. Det har dog været udfordrende at udvikle nye, mere effektive terapier. Dette skyldes, at på trods af hvor ofte MPNST’er forekommer hos NF1-patienter, er de stadig sjældne neoplasmer. Som følge heraf er det meget vanskeligt at opnå et stort antal humane tumorer til undersøgelse; Det er også en udfordring at rekruttere nok patienter med MPNST’er til kliniske forsøg. For at overvinde disse begrænsninger er der genereret flere GEM-modeller med det formål at få yderligere indsigt i abnormiteterne, der driver neurofibromapatogenese og PN-MPNST-progression og for at lette prækliniske forsøg med terapeutiske kandidatmidler.

NF1-patienter har inaktiverende mutationer i en kopi af NF1-genet. Neurofibroma patogenese udløses, når en inaktiverende mutation i det resterende funktionelle NF1-gen forekommer i en celle i Schwann-celleafstamningen. Overraskende nok, da mus blev genereret med kimlinjeinaktiverende Nf1-mutationer, udviklede de imidlertid ikke neurofibromer ^6,7. Den efterfølgende demonstration af, at mus med Nf1-null Schwann-celler og Nf1-haploinsufficiens i alle andre celletyper (Krox20-Cre;Nf1^{floks / –} mus) udviklede plexiform neurofibromer foreslog, at reduceret Nf1 gendosering i yderligere celletyper var nødvendig for neurofibroma patogenese⁸. Selv da plexiform neurofibromer i Krox20-Cre; Nf1^{floks / –} mus udviklede sig ikke til at blive MPNST’er og efterlignede derfor kun delvist biologien hos deres menneskelige kolleger. MPNST-patogenese forekom, når Nf1-mutationer blev parret med mutationer i yderligere tumorsuppressorgener såsom Trp53⁹ eller Cdkn2a¹⁰, men MPNST’er i disse GEM-modeller udviklede de novo eller fra atypiske neurofibromatøse neoplasmer med usikkert biologisk potentiale (ANNUBP’er)^11,12 snarere end fra allerede eksisterende godartede plexiforme neurofibromer (se^13,14 for fremragende anmeldelser af disse modeller samt andre modeller, der introducerer yderligere MPNST-associeret tab af funktionsmutationer i gener som Suz12 og Pten¹⁵).

Disse musemodeller har været uvurderlige for at fastslå den rolle, som gener som NF1, TP53 og CDKN2A spiller i patogenesen af NF1-associerede neoplasmer i det perifere nervesystem og til prækliniske forsøg, der tester kandidatterapeutiske midler. Vi har dog stadig en ufuldstændig forståelse af den proces, hvormed plexiforme neurofibromer udvikler sig til at blive atypiske neurofibromatøse neoplasmer med usikkert biologisk potentiale (ANNUBPs¹⁶) og derefter MPNST’er. Der er for nylig gjort visse fremskridt med at forstå denne proces med den nylige rapport om, at mus med sletninger i Nf1 og ARF udvikler ANNUBP’er, der udvikler sig til at blive MPNST’er¹¹. Imidlertid eksisterer Nf1-mutationsbaserede musemodeller, der fuldt ud rekapitulerer processen med plexiform neurofibroma-MPNST-progression, der ses hos mennesker, endnu ikke. Derudover er det ikke klart, om der er flere forskellige veje, der fører til udvikling af MPNST’er. I betragtning af dette er det muligt, at de ovenfor beskrevne GEM’er kun modellerer en delmængde af flere forskellige veje, der fører til neurofibroma-MPNST-progression og MPNST-patogenese. Dette punkt understreges af, at MPNST’er også forekommer sporadisk, og at nogle sporadiske MPNST’er tilsyneladende ikke har NF1-mutationer ^17,18.

Selvom sidstnævnte punkt er blevet udfordret af Magollon-Lorenz et al.’s nylige forslag om, at i det mindste nogle sporadiske MPNST’er, der mangler NF1-mutationer , er melanomer eller en anden type sarkom¹⁹, har vi for nylig rapporteret en sporadisk MPNST og en cellelinje afledt af denne tumor (2XSB-celler), der var NF1 vildtype²⁰. Under karakteriseringen af modertumoren og 2XSB-cellelinjen udelukkede vi systematisk alternative diagnostiske muligheder, herunder melanom og de mange andre sarkomtyper, der rutinemæssigt overvejes i differentialdiagnosen af en sporadisk malign perifer nervekappetumor²⁰. Derudover bemærker vi, at Magollon-Lorenz et al. erkendte, at deres fund i de tre sporadiske MPNST-cellelinjer, som de studerede, ikke kunne generaliseres for at indikere, at alle tumorer identificeret som sporadiske MPNST’er ikke er MPNST’er.

For at konstruere en GEM-model, hvor neurofibroma og MPNST-patogenese ikke nødvendigvis var afhængige af specifikke tumorsuppressorgenmutationer, genererede vi transgene mus, hvor overekspression af den potente Schwann-cellemitogenneuregulin-1 (NRG1) blev drevet af Schwann-cellespecifik myelinproteinnul (P₀) promotor (P 0-GGFβ3-mus)²¹. Vi har tidligere vist, at humane neurofibromer, MPNST’er og MPNST-cellelinjer udtrykker flere NRG1-isoformer sammen med erbB-receptortyrosinkinaserne (erbB2, erbB3 og erbB4), der medierer NRG1-signalering, og at disse erbB-receptorer er konstitutivt aktiveret²². Vi har også vist, at farmakologiske hæmmere af erbB-kinaserne kraftigt hæmmer MPNST-proliferation²², overlevelse²³ og migration²⁴. I overensstemmelse med vores observationer hos mennesker udvikler P 0-GGFβ3-mus plexiforme neurofibromer²⁵, der udvikler sig til at blive MPNST’er med en høj frekvens^21,25. Vi har vist, at P 0-GGFβ3 MPNST’er, ligesom deres menneskelige kolleger, almindeligvis udvikler mutationer af Trp53 og Cdkn2a samt adskillige andre genomiske abnormiteter, der potentielt bidrager til tumorigenese²⁵. MPNST’er, der opstår i P 0-GGFβ3-mus, har ikke inaktiverende Nf1-mutationer. Ved hjælp af genetisk komplementaritet viste vi imidlertid, at NRG1 fremmer tumorigenese hos P 0-GGFβ3-mus overvejende gennem de samme signalkaskader, der ændres af Nf1-tab ²⁶; denne konklusion er baseret på vores konstatering af, at erstatning af NRG1-overekspression med Nf1-tab i nærvær af Trp53-haploinsufficiens (P _0-GGFβ3;Trp53^+/- mus) producerer dyr, hvor MPNST’er udvikler de novo, som det ses i cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- mus²⁷.

For at opnå denne og andre oplysninger, der viser, at P 0-GGFβ3-mus nøjagtigt modellerer processerne for neurofibromapatogenese og neurofibroma-MPNST-progression set hos mennesker med NF1, har vi udviklet specialiserede metoder til behandling af væv fra disse dyr, nøjagtigt diagnosticeret deres tumorer, klassificering af MPNST’erne, der opstår i disse mus, etablering og karakterisering af tidlig passage P_0-GGFβ3 og P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNST-kulturer og kritisk sammenligning af patologien for P 0-GGFβ3 PN’er og MPNST’er og P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNST’er til deres menneskelige modstykker. Mange af disse metoder kan generaliseres til andre GEM-modeller af nervesystemets neoplasi. Derudover er flere af disse metoder mere bredt anvendelige til GEM-modeller, hvor neoplasmer opstår i andre organsteder. Derfor præsenterer vi her en detaljeret beskrivelse af disse metoder.

Protocol

De procedurer, der er beskrevet her, blev godkendt af Medical University of South Carolina’s IACUC og blev udført af korrekt uddannet personale i overensstemmelse med NIH Guide for Care and Use of Laboratory Animals og MUSCs institutionelle retningslinjer for dyrepleje. 1. Bestemmelse af tumorpenetrans og overlevelse i P 0-GGFβ3 mus og identifikation af tumorer i disse dyr til yderligere karakterisering Generer kohorten af mus, der vil blive vurderet for…

Representative Results

Figur 2 illustrerer eksempler på groft tydelige neoplasmer, der forekommer i P 0-GGFβ3-mus. Tumorer, der let kan identificeres med det blotte øje, kan ses som masser, der udspiler kropsområder som vist i figur 2A (pil). Ved bestemmelse af, om neoplasma potentielt er en perifer nervekappetumor, er det vigtigt at fastslå, at tumoren er forbundet med en perifer nerve. I dette tilfælde viser en MR-scanning (figur 2B), a…

Discussion

De histologiske og biokemiske metoder, der præsenteres her, giver en ramme for diagnosticering og karakterisering af GEM-modeller af neurofibroma og MPNST-patogenese. I årenes løb har vi fundet, at disse metoder er ret nyttige til vurdering af patologien af perifere nervekappetumorer, der opstår i GEM-modeller 21,25,26. Men mens de protokoller, der er skitseret her, er nyttige til at bestemme, hvor præcist tumorer i GEM-mod…

Materials

100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31