Summary

זיהוי סוג סיבים של שרירי השלד האנושיים

Published: September 22, 2023
doi:

Summary

פרוטוקול זה מדגים בידוד של סיב יחיד משרירי השלד האנושיים המיובשים בהקפאה וסיווג סוג סיבים על פי איזופורם שרשרת כבדה מיוסין (MHC) באמצעות טכניקת כתמת הנקודות. לאחר מכן ניתן לנתח דגימות סיבים MHC I ו-II מזוהות עבור הבדלים ספציפיים לסוג הסיבים בביטוי חלבונים באמצעות כתמים מערביים.

Abstract

ניתן להשתמש בטכניקה המתוארת כאן כדי לזהות איזופורמים ספציפיים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC) במקטעים של סיבי שריר בודדים באמצעות הכתמת נקודות, להלן זיהוי שרשרת כבדה של האוסין שליעל ידי Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). פרוטוקול זה מתאר את תהליך הייבוש בהקפאה של שרירי השלד האנושיים ובידוד מקטעים של סיבי שריר בודדים. באמצעות MyDoBID, סיבים מסוג I ו- II מסווגים עם נוגדנים ספציפיים MHCI ו- IIa, בהתאמה. סיבים מסווגים משולבים לאחר מכן לדגימות ספציפיות לסוג הסיבים עבור כל ביופסיה.

סך החלבון בכל דגימה נקבע על ידי אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילאמיד נתרן דודציל-סולפט (SDS-PAGE) וטכנולוגיית ג’ל המופעלת על ידי UV. סוג הדגימות של הסיבים מאומת באמצעות כתמים מערביים. מתוארת גם החשיבות של ביצוע נורמליזציה של העמסת חלבונים כדי לשפר את זיהוי חלבון המטרה על פני כתמים מערביים מרובים. היתרונות של איחוד סיבים מסווגים לדגימות ספציפיות לסוג סיבים בהשוואה לסיבים מערביים יחידים, כוללים רב-תכליתיות דגימה, תפוקת דגימה מוגברת, השקעה קצרה יותר בזמן ואמצעים לחיסכון בעלויות, כל זאת תוך שמירה על מידע יקר ערך ספציפי לסוג הסיב שלעתים קרובות מתעלמים ממנו באמצעות דגימות שריר הומוגניות. מטרת הפרוטוקול היא להשיג זיהוי מדויק ויעיל של סיבים מסוג I ו-II שבודדו מדגימות שרירי שלד אנושיים מיובשים בהקפאה.

סיבים בודדים אלה משולבים לאחר מכן ליצירת דגימות ספציפיות לסוג I וסוג II. יתר על כן, הפרוטוקול מורחב וכולל זיהוי של סיבים מסוג IIx, תוך שימוש באקטין כסמן לסיבים שהיו שליליים עבור MHCI ו- MHCIIa, אשר אושרו כסיבי IIx על ידי כתם מערבי. לאחר מכן משתמשים בכל דגימה ספציפית לסוג הסיב כדי לכמת את הביטוי של חלבוני מטרה שונים באמצעות טכניקות קרישה מערביות.

Introduction

שריר השלד הוא רקמה הטרוגנית, בעלת תכונות מטבוליות והתכווצות תאיות מובהקות התלויות בשאלה אם התא (סיבים) הוא עווית איטית (סוג I) או עווית מהירה (סוג II). ניתן לזהות את סוג הסיב על ידי בחינת איזופורמים של שרשרת מיוזין כבדה (MHC), הנבדלים זה מזה במספר דרכים, כולל זמן התכווצות, מהירות הקיצור ועמידות בפני עייפות1. איזופורמים עיקריים של MHC כוללים סוג I, סוג IIa, סוג IIb וסוג IIx והפרופילים המטבוליים שלהם הם חמצוניים (סוג I ו- IIa) או גליקוליטיים (IIx, IIb)1. חלקם של סוגי סיבים אלה משתנה בסוג השריר ובין המינים. סוג IIb נמצא באופן נרחב בשרירי מכרסמים. שרירי האדם אינם מכילים סיבים מסוג IIb ומורכבים בעיקר מאיזופורמים מסוג MHC מסוג I ו- IIa, עם חלק קטן מסיבי IIx2. פרופילי ביטוי החלבונים משתנים בין סוגי סיבים שונים, וניתן לשנות אותם עם הזדקנות3, פעילות גופנית 4,5 ומחלה6.

לעתים קרובות מתעלמים או לא מאפשרים למדוד תגובות תאיות בסוגים שונים של סיבי שריר השלד בגלל בדיקת הומוגנטים של שרירים (שילוב של כל סוגי הסיבים). כתם מערבי חד-סיבתי מאפשר חקירה של חלבונים מרובים בסיבי שריר בודדים7. מתודולוגיה זו שימשה בעבר לייצור מאפיינים חדשניים ואינפורמטיביים של סיב בודד שלא ניתן היה להשיג באמצעות תכשירים הומוגניים. עם זאת, ישנן כמה מגבלות של המתודולוגיה המערבית המקורית של כתם סיב יחיד, כולל האופי הגוזל זמן, חוסר היכולת לייצר שכפול דגימות, והשימוש בריאגנטים כימילומינסנציה משופרת (ECL) יקרים ורגישים. אם נעשה שימוש ברקמה טרייה, שיטה זו מוגבלת עוד יותר בשל אילוצי הזמן של הצורך לבודד סיבים בודדים במסגרת זמן מוגבלת (כלומר, 1-2 שעות). למרבה המזל, ריסון זה מתמתן על ידי בידוד מקטעים חד-סיביים מרקמה מיובשת בהקפאה8. עם זאת, איסוף סיבים מדגימות מיובשות בהקפאה מוגבל על ידי גודל ואיכות הרקמה הביופסית.

זיהוי סוג הסיבים בשיטת הכתמת נקודות9 הורחב והורחב באופן משמעותי בפרוטוקול מקיף זה. בעבר, הוכח כי מעט כמו ~ 2-10 מ”ג של רקמת שריר במשקל רטוב מספיק לייבוש בהקפאה וניתוח חלבון איזופורם MHC סיב יחיד9. Christensen et al.9 השתמשו ב-30% מקטע סיבים ~1 מ”מ כדי לזהות את איזופורם MHC הקיים על ידי כתם נקודה, אשר אושר על ידי כתם מערבי. עבודה זו הראתה כי על ידי החלפת כתם מערבי בכתמים נקודתיים, העלויות הכוללות הופחתו פי ~ 40 (עבור 50 מקטעי סיבים). לאחר מכן “אוגמו” סיבים לדגימות מסוג I ו-II, שאפשרו שכפול ניסיוני9. עם זאת, התקבלו רק שתי דגימות ספציפיות לסוג הסיבים: סוג I (MHCI חיובי) וסוג II (סיבים חיוביים MHCII), עם דגימות מסוג II המכילות תערובת של MHCIIa ו- MHCIIx 6,10. יש לציין כי הפרוטוקול הנוכחי מדגים כיצד ניתן לזהות סיבי IIx טהורים מסוג IIx ומספק זרימת עבודה מפורטת ביותר (המסוכמת באיור 1), כולל אסטרטגיות לפתרון בעיות נפוצות בפרוטוקול.

Protocol

דגימות שריר אנושיות נלקחו מהווסטוס לטרליס מ n = 3 (2 גברים, 1 נקבה), בגילאי 70-74 שנים בתנאים סטריליים באמצעות הרדמה מקומית (Xylocaine) ומחט ברגסטרום שונה עבור יניקה ידנית11,12. הדגימות היו תת-קבוצה של מחקר קודם שאושר על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי באוניברסיטת ויקטור?…

Representative Results

זיהוי סיבי שריר בודדים מסוג MHCI, MHCIIa ו-MHCIIx באמצעות כתם נקודותמאפיין של MyDoBID הוא סיווג של עוצמת האות MHC ו-Actin המשתנה בסיב נתון (איור 4A). סוג הסיבים זוהה על-ידי נוכחות או היעדר איזופורמים MHCI ו-IIa (איור 4B). שישה סיבים לא הראו זיהוי MHC או אקטין (actin), מה שמצביע…

Discussion

אוסף סיבים
בהתבסס על מספר שנות ניסיון, רוב החוקרים יכולים לשלוט בטכניקה זו; עם זאת, תרגול מוביל לאיסוף סיבים מהיר ויעיל יותר לניתוחים במורד הזרם. כדי שניתן יהיה לבודד 30 מקטעי סיבים בודדים באיכות לאיגום, מומלץ לאסוף 50 מקטעי סיבים בכל דגימה. מומלץ ללמוד היטב את סרטון איסוף הסיבים ו?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

הנוגדנים נגד MHC I (A4.840) ו- MHCIIa (A4.74) ששימשו במחקר זה פותחו על ידי ד”ר H. M. Blau והנוגדן נגד MHCIIx (6H1) פותח על ידי ד”ר C. A. Lucas והתקבל מבנק Hybridoma למחקרים התפתחותיים (DSHB), הודות לחסות המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה למדעי הביולוגיה (איווה סיטי, IA). אנו מודים לוויקטוריה ל. ויקסמה על שסיפקה את דגימות השריר האנושי למחקר זה. רוב התמונות באיור 1 נלקחו מ-BioRender.com.

מימון:
מחקר זה לא זכה למימון חיצוני.

Materials

1x Denaturing buffer Make according to recipe Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributing companies  1x denaturing buffer is made by diluting 3x denaturing buffer 1 in 3 v/v with 1X Tris-HCl (pH 6.8). Store at -20 °C.
3x Denaturing buffer Make according to recipe Constituents can be sourced from Sigma-Aldrich or other chemical distributors 3x denaturing buffer contains: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M urea, 10% 2-mercaptoethanol, and 0.001% bromophenol blue, pH 6.8.  Store at -20 °C.
95% Ethanol N/A 100% ethanol can be sourced from any company Diluted to 95% with ultra-pure H2O.
Actin rabbit polyclonal antibody Sigma-Aldrich   A2066 Dilute 1 in 1,000 with BSA buffer.
Analytical scales Mettler Toledo Model number: MSZ042101
Antibody enhancer Thermo Fischer Scientific 32110 Product name is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beaker (100 mL) N/A N/A
Benchtop centrifuge Eppendorf 5452 Model name: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer. Diploma Store bought
BSA buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3 BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich  BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002 Bovine serum albumin (BSA), Phosphate-buffered saline (PBS), and Sodium azide (NaN3). Store at 4 °C.
Cassette opening lever  Bio-Rad Laboratories 4560000 Used to open the precast gel cassettes.
Chemidoc MP Imager  Bio-Rad Laboratories Model number: Universal hood III Any imaging system with Stain-Free gel imaging capabilities.
Criterion blotter Bio-Rad Laboratories 1704070 Includes ice pack, transfer tray, roller, 2 cassette holders, filter paper, foam pads and lid with cables.
Criterion Cell (Bio-Rad) Bio-Rad Laboratories 1656001
ECL (enhanced chemiluminescence) Bio-Rad Laboratories 1705062 Product name: Clarity Max Western ECL Substrate.
Electrophoresis buffer 1x Tris Glycine SDS (TGS) Bio-Rad Laboratories 1610772 Dilute 10x TGS 1 in 10 with ultra-pure H2O.
Filter paper, 0.34 mm thick Whatmann 3030917 Bulk size 3 MM, pack 100 sheets, 315 x 335 mm.
Fine tissue dissecting forceps Dumont F6521-1EA Jeweller’s forceps no. 5.
Flat plastic tray/lid   N/A N/A Large enough to place the membrane on. Ensure the surface is completely flat.
Freeze-drying System Labconco 7750030 Freezone 4.5 L with glass chamber sample stage.
Freezer -80 o N/A N/A Any freezer with a constant temperature of -80 °C is suitable.
Gel releasers 1653320 Bio-Rad Slide under the membrane to gather or move the membrane.
Grey lead pencil N/A N/A
 Image lab software  Bio-Rad Laboratories N/A Figures refers to software version 5.2.1 but other versions can used.
Incubator Bio-Rad Laboratories 1660521 Any incubator that can be set to 37 °C would suffice.
Lamp N/A N/A
Magnetic stirrer with flea N/A N/A
Membrane roller  Bio-Rad Laboratories 1651279 Can be purchased in the Transfer bundle pack. However, if this product is not available, any smooth surface cylindrical tube long enough to roll over the membrane would suffice. 
Microcentrifuge tubes  (0.6 mL) N/A N/A
Mouse IgG HRP secondary Thermo Fisher Scientific 31430 Goat anti-Mouse IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilute at 1 in 20,000 in blocking buffer.
Mouse IgM HRP secondary Abcam ab97230 Goat Anti-Mouse IgM mu chain. Use at the same dilution as mouse IgG.
Myosin Heavy Chain I (MHCI) primary antibody DSHB A4.840  Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIa (MHCIIa) primary antibody DSHB A4.74  Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Myosin Heavy Chain IIx (MHCIIx) primary antibody DSHB 6H1 Dilution range: 1 in 200 to 1 in 500 in BSA buffer.
Nitrocellulose Membrane 0.45 µm  Bio-Rad Laboratories 1620115 For Western blotting.
Petri dish lid N/A N/A
Plastic tweezers N/A N/A
Power Pack  Bio-Rad Laboratories 164-5050 Product name: Basic power supply.
Protein ladder Thermo Fisher Scientific 26616 PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa.
PVDF Membrane 0.2 µm Bio-Rad Laboratories 1620177
Rabbit HRP secondary Thermo Fisher Scientific 31460 Goat anti-Rabbit IgG (H+L), RRID AB_228341. Dilution same as mouse secondary antibodies.
Rocker N/A N/A
Ruler N/A N/A
Scissors N/A N/A
Stereomicroscope Motic SMZ-168
Stripping buffer Thermo Fisher Scientific 21059 Product name: Restore Western Blot Stripping Buffer.
Tissue (lint free) Kimberly-Clark professional 34120 Product name: Kimwipe.
Transfer buffer (1x Tris Glycine buffer (TG), 20% Methanol) TG: Bio-Rad Laboratories   Methanol: Merck TG buffer: 1610771           Methanol: 1.06018 dilute 10x TG buffer with ultra-pure H2O to 1x. Add 100% Methanol to a final concentration of 20% Methanol. Store at 4 °C.
Transfer tray Bio-Rad Laboratories 1704089
 UV-activation precast gel Bio-Rad Laboratories 5678085 Gel type: 4–15% Criterion TGX Stain-Free Protein Gel, 26 well, 15 µL.
Vortex N/A N/A
Wash buffer (1x TBST) 10x TBS: Astral Scientific  Tween 20: Sigma  BIOA0027-4L 1x TBST recipe: 10x Tris-buffered saline (TBS) is diluted down to 1x with ultra-pure H2O, Tween 20 is added to a final concentration of 0.1%. Store buffer at 4 °C.
Wash containers Sistema Store bought Any tupperware container, that suits the approximate dimensions of the membrane would suffice.

References

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  2. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273 (2012).
  3. Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
  4. Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
  5. Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
  6. Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256 (2022).
  7. Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
  8. Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
  9. Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473 (2019).
  10. Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
  11. Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
  12. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  13. Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
  14. Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
  15. Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
  16. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
  17. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).

Play Video

Cite This Article
Latchman, H. K., Wette, S. G., Ellul, D. J., Murphy, R. M., Frankenberg, N. T. Fiber Type Identification of Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (199), e65750, doi:10.3791/65750 (2023).

View Video