Méthodologie pour inactiver métaboliquement les bactéries pour la recherche sur Caenorhabditis elegans
Summary
La source de nourriture de Caenorhabditis elegans en laboratoire est Escherichia coli vivant. Étant donné que les bactéries sont métaboliquement actives, elles présentent une variable confondante dans les études métaboliques et médicamenteuses chez C. elegans. Un protocole détaillé pour inactiver métaboliquement les bactéries à l’aide de paraformaldéhyde est décrit ici.
Abstract
Caenorhabditis elegans est un organisme modèle commun pour la recherche en génétique, développement, vieillissement, métabolisme et comportement. Étant donné que C. elegans consomme un régime de bactéries vivantes, l’activité métabolique de leur source de nourriture peut confondre les expériences visant à rechercher les effets directs de diverses interventions sur le ver. Pour éviter les effets confondants du métabolisme bactérien, les chercheurs de C. elegans ont utilisé plusieurs méthodes pour inactiver métaboliquement les bactéries, y compris l’irradiation ultraviolette (UV), l’élimination par la chaleur et les antibiotiques. Le traitement UV est relativement faible et ne peut pas être utilisé en culture liquide car chaque plaque doit être examinée pour une destruction bactérienne réussie. Une deuxième méthode de traitement, la chaleur meurtrière, affecte négativement la texture et la qualité nutritionnelle de la bactérie, conduisant à l’arrêt du développement de C. elegans. Enfin, le traitement antibiotique peut modifier directement la physiologie de C. elegans en plus d’empêcher la croissance bactérienne. Ce manuscrit décrit une méthode alternative pour inactiver métaboliquement les bactéries à l’aide du paraformaldéhyde (PFA). Le traitement PFA réticulant les protéines dans les cellules bactériennes pour empêcher l’activité métabolique tout en préservant la structure cellulaire et le contenu nutritionnel. Cette méthode est à haut débit et peut être utilisée dans la culture liquide ou les plaques solides, car le test de croissance d’une plaque de bactéries traitées au PFA valide l’ensemble du lot. L’inactivation métabolique par traitement PFA peut être utilisée pour éliminer les effets confondants du métabolisme bactérien sur les études de supplémentation en médicaments ou en métabolites, la résistance au stress, la métabolomique et le comportement chez C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans a été proposé à l’origine comme organisme modèle en 19651 et a depuis été largement adopté dans les études sur la génétique, le développement, le comportement, le vieillissement et le métabolisme2. En raison de la grande taille de son couvain et de sa cuticule transparente, C. elegans est particulièrement bien adapté au criblage à haut débit avec des rapporteurs fluorescents3. Leur cycle de vie court, leur reproduction hermaphrodite et leur homologie génétique avec l’homme font également de C. elegans un système modèle précieux pour les études sur le développement4 et la biologie du vieillissement5. De plus, C. elegans est relativement facile à entretenir. Les vers peuvent être cultivés en culture liquide ou sur des plaques de gélose solide et consommer un régime de bactéries vivantes Escherichia coli OP504.
Cependant, la source de nourriture vivante de C. elegans peut confondre les études sur le métabolisme, la supplémentation en médicaments et le comportement. Étant donné que les bactéries vivantes ont leur propre métabolisme, les conditions expérimentales qui affectent les bactéries modifient également les nutriments et les métabolites disponibles pour les vers. Par exemple, les différences dans les concentrations bactériennes de fer, d’acides aminés et de folate ont des effets divers sur le développement, la physiologie et la durée de vie de C. elegans 6. De nombreuses pratiques de laboratoire courantes peuvent provoquer de tels changements dans la composition nutritionnelle et les métabolites produits par l’OP50. Plus précisément, l’exposition à la 5-fluoro-2′-désoxyuridine (FUdR), un composé couramment utilisé pour empêcher la reproduction chez C. elegans, provoque de grands changements dans l’expression du gène OP50, y compris les voies de biosynthèse des acides aminés7. Les bactéries vivantes peuvent également confondre les études dans lesquelles C. elegans est complété par de petites molécules, car les bactéries peuvent métaboliser partiellement ou complètement les composés actifs. De plus, les effets de ces petites molécules sur les bactéries peuvent, à leur tour, modifier la physiologie de C. elegans, comme cela a été rapporté avec le médicament qui prolonge la durée de vie, la metformine8. Enfin, les bactéries vivantes peuvent modifier l’environnement du ver d’une manière qui modifie le comportement, par exemple en sécrétant des odorants attrayants9, en produisant des neuromodulateurs exogènes10 et en créant des gradients d’oxygène dans une pelouse bactérienne dense11.
Afin d’atténuer les effets confondants du métabolisme bactérien sur la recherche sur C . elegans , plusieurs méthodes ont été mises au point pour tuer les bactéries (tableau 1). Trois stratégies courantes pour tuer l’OP50 sont l’irradiation UV, l’élimination de la chaleur et le traitement antibiotique. Bien qu’elles soient simples et relativement peu coûteuses, chacune de ces méthodes peut avoir des effets indésirables sur les bactéries et C. elegans. La destruction des UV via un réticulant UV12 est à faible débit et le taux est limité par le nombre de plaques pouvant contenir le réticulant UV. De plus, l’efficacité de la destruction des UV peut varier d’une plaque à l’autre au sein d’un lot, et les tests de croissance sur toutes les plaques peuvent devenir difficiles dans les grandes expériences. L’OP50 qui tue la chaleur en exposant la culture à des températures de >60 °C s’accompagne d’un ensemble distinct de défis. Une chaleur élevée peut endommager les nutriments essentiels pour le ver et détruire la structure cellulaire des bactéries, créant une texture plus douce qui diminue le temps que les vers passent sur la nourriture13. Cette méthode ne peut pas non plus être utilisée tout au long du cycle de vie de C. elegans , car les vers nourris avec des bactéries tuées par la chaleur peuvent s’arrêter tôt dans leur développement13. Le traitement antibiotique est une troisième méthode courante pour supprimer le métabolisme bactérien14, mais les antibiotiques peuvent également modifier la croissance et le métabolisme des vers15.
Une solution pour éliminer les effets métaboliques des bactéries vivantes tout en préservant la structure bactérienne et les nutriments essentiels est de tuer l’OP50 avec du paraformaldéhyde (PFA)16. Le PFA est un polymère de formaldéhyde qui peut réticuler les protéines à l’intérieur des cellules17 pour empêcher la réplication bactérienne sans détruire les structures cellulaires internes comme la membrane plasmique interne18. En raison de cette préservation de la structure cellulaire interne, les bactéries traitées au PFA ne présentent aucune croissance ni activité métabolique, mais restent une source de nourriture comestible et riche en nutriments pour C. elegans16. Ici, un protocole détaillé est fourni qui montre comment inactiver métaboliquement les bactéries à l’aide de paraformaldéhyde.
| Méthode | Matériel requis | Évolutif? | Nutritionnel? | Effets sur le ver ? | ||||
| UV | Réticulant UV | Limité par : | Oui | Effets variables sur la durée de vie sur NGM12, 23, 24 | ||||
| Nombre de plaques pouvant s’adapter à la réticulation UV | Effets variables sur la durée de vie sur FUdR24, 26, 27 | |||||||
| Temps d’irradiation par plaque | Diminution des préférences alimentaires16 | |||||||
| Possibilité de vérifier la croissance de chaque plaque8 | ||||||||
| Chaleur | Incubateur >60 °C | Oui | Non : détruit la paroi cellulaire, diminue la valeur nutritionnelle | Arrêt développemental 13 | ||||
| Diminution de la préférence alimentaire13 | ||||||||
| Prolonge la durée de vie du NGM31 | ||||||||
| Antibiotiques | Antibiotiques (kanamycine, carbénicilline, etc.) | Oui | Oui | Retarde la croissance et le développement15 | ||||
| Prolonge la durée de vie en milieu liquide19 | ||||||||
| Prolonge la durée de vie du NGM15 | ||||||||
| L’APF | 0,5 % de paraformaldéhyde | Oui | Oui | Diminution de la petite taille du couvain16 | ||||
| Faible augmentation du temps de développement16 | ||||||||
| Diminution des préférences alimentaires16 | ||||||||
Tableau 1. Comparaisons des méthodes pour tuer l’OP50. L’élimination des UV, l’élimination de la chaleur, le traitement antibiotique et le traitement par PFA ont des effets variés sur l’état nutritionnel des bactéries et la santé des vers nourris avec des bactéries traitées. Ces méthodes d’inactivation réplicative d’E. coli diffèrent également par les matériaux requis et l’évolutivité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Avantages de la destruction des PFA par rapport aux autres méthodes de destruction des bactéries
Le traitement par PFA est une méthode à haut débit pour prévenir le métabolisme bactérien tout en maintenant une source de nourriture nutritive pour C. elegans. L’élimination des bactéries par le biais d’un traitement PFA présente de multiples avantages par rapport aux autres méthodes. Contrairement au traitement UV, où chaque plaque doit être testée pour réussir à tuer, une s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été financés par le NIH R21AG059117 et les laboratoires Paul F. Glenn pour la recherche sur la biologie du vieillissement de l’Université du Michigan. SB a été financé par T32AG000114. ESK a été financé par NSF DGE 1841052.
Materials
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. . Elegans II. 33, (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nature reviews. Drug discovery. 5 (5), 387-398 (2006).
- Meneely, P. M., Dahlberg, C. L., Rose, J. K. Working with worms: Caenorhabditis elegans as a model organism. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 19 (1), (2019).
- Zhang, S., Li, F., Zhou, T., Wang, G., Li, Z. Caenorhabditis elegans as a useful model for studying aging mutations. Frontiers in Endocrinology. 11, 554994 (2020).
- Feng, M., Gao, B., Garcia, L. R., Sun, Q. Microbiota-derived metabolites in regulating the development and physiology of Caenorhabditis elegans. Frontiers in Microbiology. 14, 1035582 (2023).
- McIntyre, G., Wright, J., Wong, H. T., Lamendella, R., Chan, J. Effects of FUdR on gene expression in the C. elegans bacterial diet OP50. BMC Research Notes. 14 (1), 207 (2021).
- Cabreiro, F., et al. Metformin retards aging in c. Elegans by altering microbial folate and methionine metabolism. Cell. 153 (1), 228-239 (2013).
- Worthy, S. E., et al. Identification of attractive odorants released by preferred bacterial food found in the natural habitats of c. Elegans. PLoS One. 13 (7), e0201158 (2018).
- Chen, Y. C., Seyedsayamdost, M. R., Ringstad, N. A microbial metabolite synergizes with endogenous serotonin to trigger C. elegans reproductive behavior. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (48), 30589-30598 (2020).
- Kim, D. H., Flavell, S. W. Host-microbe interactions and the behavior of Caenorhabditis elegans. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 500-509 (2020).
- Gems, D., Riddle, D. L. Genetic, behavioral, and environmental determinants of male longevity in Caenorhabditis elegans. 유전학. 154 (4), 1597-1610 (2000).
- Qi, B., Kniazeva, M., Han, M. A vitamin-b2-sensing mechanism that regulates gut protease activity to impact animal’s food behavior and growth. eLife. 6, e26243 (2017).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in caenorhabditis elegans: A role for heat-shock factor and bacterial proliferation. 유전학. 161 (3), 1101-1112 (2002).
- Virk, B., et al. Folate acts in E. coli to accelerate C. elegans aging independently of bacterial biosynthesis. Cell Reports. 14 (7), 1611-1620 (2016).
- Beydoun, S., et al. An alternative food source for metabolism and longevity studies in Caenorhabditis elegans. Communications Biology. 4 (1), 258 (2021).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
- Felix, H. Permeabilized and immobilized cells. Methods in Enzymology. 137, 637-641 (1988).
- Lobritz, M. A., et al. Antibiotic efficacy is linked to bacterial cellular respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (27), 8173-8180 (2015).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 44 (4), 421-437 (2012).
- Shtonda, B. B., Avery, L. Dietary choice behavior in Caenorhabditis elegans. The Journal of Experimental biology. 209 (Pt 1), 89-102 (2006).
- MacNeil, L. T., Watson, E., Arda, H. E., Zhu, L. J., Walhout, A. J. Diet-induced developmental acceleration independent of tor and insulin in C. elegans. Cell. 153 (1), 240-252 (2013).
- Kumar, S., et al. Lifespan extension in C. elegans caused by bacterial colonization of the intestine and subsequent activation of an innate immune response. Developmental Cell. 49 (1), 100-117 (2019).
- Nakagawa, H., et al. Effects and mechanisms of prolongevity induced by Lactobacillus gasseri sbt2055 in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 15 (2), 227-236 (2016).
- Kaeberlein, T. L., et al. Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food. Aging Cell. 5 (6), 487-494 (2006).
- Beaudoin-Chabot, C., et al. The unfolded protein response reverses the effects of glucose on lifespan in chemically-sterilized C. elegans. Nature Communication. 13 (1), 5889 (2022).
- Komura, T., Takemoto, A., Kosaka, H., Suzuki, T., Nishikawa, Y. Prolonged lifespan, improved perception, and enhanced host defense of Caenorhabditis elegans by Lactococcus cremoris subsp. cremoris.Microbiology Spectrum. 10 (3), e0045421 (2022).
- Ye, X., Linton, J. M., Schork, N. J., Buck, L. B., Petrascheck, M. A pharmacological network for lifespan extension in Caenorhabditis elegans. Aging Cell. 13 (2), 206-215 (2014).
- Hastings, J., et al. Wormjam: A consensus C. elegans metabolic reconstruction and metabolomics community and workshop series. Worm. 6 (2), e1373939 (2017).
- O’Donnell, M. P., Fox, B. W., Chao, P. H., Schroeder, F. C., Sengupta, P. A neurotransmitter produced by gut bacteria modulates host sensory behaviour. Nature. 583 (7816), 415-420 (2020).
- Stuhr, N. L., Curran, S. P. Bacterial diets differentially alter lifespan and healthspan trajectories in C. elegans. Communications Biology. 3 (1), 653 (2020).
- Dirksen, P., et al. Cembio – the Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3 (Bethesda). 10 (9), 3025-3039 (2020).
