秀丽隐杆线虫研究的代谢灭活细菌的方法
Summary
实验室中 秀丽隐杆线虫 的食物来源是活 的大肠杆菌。由于细菌具有代谢活性，因此它们在 秀丽隐杆线虫 的代谢和药物研究中存在混杂变量。本文描述了使用多聚甲醛代谢灭活细菌的详细方案。
Abstract
秀丽隐杆线虫是一种常见的模式生物，用于遗传学、发育、衰老、代谢和行为研究。由于秀丽隐杆线虫以活细菌为食，因此其食物来源的代谢活动可能会混淆寻找各种干预措施对蠕虫的直接影响的实验。为了避免细菌代谢的混杂效应，秀丽隐杆线虫研究人员使用了多种方法来代谢灭活细菌，包括紫外线 （UV） 照射、热杀灭和抗生素。紫外线处理的通量相对较低，不能用于液体培养，因为必须检查每个培养板是否成功杀灭细菌。第二种治疗方法是热杀灭，会对细菌的质地和营养质量产生负面影响，导致秀丽隐杆线虫的发育停滞。最后，抗生素治疗除了防止细菌生长外，还可以直接改变秀丽隐杆线虫的生理机能。本手稿描述了一种使用多聚甲醛 （PFA） 代谢灭活细菌的替代方法。PFA处理使细菌细胞内的蛋白质交联，以防止代谢活动，同时保持细胞结构和营养成分。该方法通量高，可用于液体培养或固体培养板，因为测试一板 PFA 处理过的细菌的生长可以验证整个批次。通过PFA处理的代谢灭活可用于消除细菌代谢对药物或代谢物补充、应激抗性、代谢组学和秀丽隐杆线虫行为研究的混杂影响。
Introduction
秀丽隐杆线 虫最初于 1965 年被提出为模式生物1 ，此后被广泛用于遗传学、发育、行为、衰老和代谢的研究2。由于其育雏尺寸大和角质层透明， 秀丽隐杆线 虫特别适合使用荧光报告基因进行高通量筛选3。它们的短生命周期、雌雄同体的繁殖以及与人类的遗传同源性也使 秀丽隐杆线虫 成为研究发育4 和衰老生物学5 的有价值的模型系统。此外， 秀丽隐杆线虫 相对容易维护。蠕虫可以在液体培养物或固体琼脂平板上生长，并食用活 的大肠杆菌 OP50 细菌4。
然而， 秀丽隐杆线虫 的活食来源可能会混淆新陈代谢、药物补充和行为的研究。由于活细菌有自己的新陈代谢，因此影响细菌的实验条件也会改变蠕虫可用的营养物质和代谢物。例如，细菌铁、氨基酸和叶酸浓度的差异对 秀丽隐杆线虫的 发育、生理和寿命有不同的影响6。许多常见的实验室实践可以引起OP50产生的营养成分和代谢物的这种变化。具体而言，暴露于5-氟-2′-脱氧尿苷（FUdR）（一种常用于防止 秀丽隐杆线虫繁殖的化合物）会引起OP50基因表达的广泛变化，包括氨基酸生物合成途径7。活细菌也可能混淆秀 丽隐杆线 虫补充小分子的研究，因为细菌可以部分或完全代谢活性化合物。此外，这些小分子对细菌的影响反过来可以改变 秀丽隐杆线虫 的生理机能，正如延长寿命的药物二甲双胍8所报道的那样。最后，活细菌可以通过改变行为的方式改变蠕虫的环境，例如分泌有吸引力的气味剂9，产生外源性神经调节剂10，以及在密集的细菌草坪中产生氧气梯度11。
为了减轻细菌代谢对 秀丽隐杆线虫 研究的混杂影响，已经开发了多种杀死细菌的方法（表1）。杀死OP50的三种常见策略是紫外线照射、热杀灭和抗生素治疗。虽然简单且成本相对较低，但这些方法中的每一种都可能对细菌和 秀丽隐杆线虫 产生不良影响。通过UV交联剂12 进行UV杀灭是低通量的，其速率受UV交联剂中可容纳的板数的限制。此外，在批次内，紫外线杀灭的功效可能因板而异，并且在大型实验中测试所有板的生长可能变得困难。通过将培养物暴露在 >60 °C 的温度下来热杀灭 OP50 会带来一系列单独的挑战。高温会破坏蠕虫所必需的营养物质并破坏细菌的细胞结构，从而产生更柔软的质地，从而减少蠕虫在食物上花费的时间13.这种方法也不能在 秀丽隐杆 线虫的整个生命周期中使用，因为喂食热杀灭细菌的蠕虫可以在发育早期停滞13。抗生素治疗是抑制细菌代谢的第三种常用方法14，但抗生素也可以改变蠕虫的生长和代谢15。
消除活细菌代谢效应同时保留细菌结构和必需营养素的一种解决方案是用多聚甲醛 （PFA） 杀死 OP5016。PFA 是一种甲醛聚合物，可以在细胞内交联蛋白质17，以防止细菌复制，而不会破坏内部细胞结构，如内质膜18。由于这种内部细胞结构的保留，PFA 处理的细菌没有表现出生长或代谢活动，但仍然是秀丽隐杆线虫16 的可食用和营养丰富的食物来源。 在这里，提供了一个详细的方案，显示了如何使用多聚甲醛代谢灭活细菌。
| 方法 | 所需材料 | 可 伸缩？ | 营养？ | 对蠕虫的影响？ | ||||
| 紫外线 | UV交联剂 | 受限于： | 是的 | 对 NGM12、23、24 寿命的可变影响 | ||||
| 适合UV交联剂的板数 | 对 FUdR24、26、27 寿命的可变影响 | |||||||
| 每块板的照射时间 | 食物偏好降低16 | |||||||
| 能够检查每个板的生长情况8 | ||||||||
| 热 | >60°C培养箱 | 是的 | 否：破坏细胞壁，降低营养价值 | 发育停滞 13 | ||||
| 食物偏好降低13 | ||||||||
| 延长 NGM31 的使用寿命 | ||||||||
| 抗生素 | 抗生素（卡那霉素、羧苄西林等） | 是的 | 是的 | 延迟生长发育15 | ||||
| 延长液体介质的使用寿命19 | ||||||||
| 延长 NGM15 的使用寿命 | ||||||||
| 全氟辛烷磺酸 | 0.5% 多聚甲醛 | 是的 | 是的 | 小育雏减少16 | ||||
| 开发时间增加小16 | ||||||||
| 食物偏好降低16 | ||||||||
表 1.杀死OP50的方法比较。 紫外线杀灭、热杀灭、抗生素治疗和 PFA 治疗对细菌的营养状况和喂食处理细菌的蠕虫的健康有不同的影响。这些复制灭活 大肠杆菌 的方法在所需的材料和可扩展性方面也有所不同。
Protocol
Representative Results
Discussion
相对于其他细菌杀灭方法，PFA杀灭的益处
PFA处理是一种高通量方法，可防止细菌代谢，同时保持秀丽隐杆线虫的营养食物来源。与其他方法相比，通过PFA处理杀死细菌具有多种优势。与紫外线处理不同，紫外线处理必须测试每个板才能成功杀灭，而一批 PFA 处理细菌中的单个板可以测试以验证第16 批。PFA处理在消除细菌代谢方面也非常有效（<strong class="xfig"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由美国国立卫生研究院R21AG059117和密歇根大学Paul F. Glenn衰老生物学研究实验室资助。SB由T32AG000114资助。ESK由NSF DGE 1841052资助。
Materials
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 |
|
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanol free solution |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
References
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