JoVE Journal > Behavior
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
행동분석학

High-Throughput Small Molecule Drug Screening voor leeftijdsgebonden slaapstoornissen met behulp van Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023
doi:
10.3791/65787
, , , , ,
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease,Southeast University

Summary

Gepresenteerd wordt een protocol voor high-throughput drug screening om de slaap te verbeteren door het slaapgedrag van fruitvliegjes te monitoren in een ouder Drosophila-model .

Abstract

Slaap, een essentieel onderdeel van de gezondheid en het algehele welzijn, vormt vaak een uitdaging voor oudere personen die vaak slaapstoornissen ervaren die worden gekenmerkt door een verkorte slaapduur en gefragmenteerde patronen. Deze slaapstoornissen correleren ook met een verhoogd risico op verschillende ziekten bij ouderen, waaronder diabetes, hart- en vaatziekten en psychische stoornissen. Helaas worden bestaande medicijnen voor slaapstoornissen in verband gebracht met aanzienlijke bijwerkingen zoals cognitieve stoornissen en verslaving. Daarom is de ontwikkeling van nieuwe, veiligere en effectievere medicijnen tegen slaapstoornissen dringend nodig. De hoge kosten en de lange experimentele duur van de huidige methoden voor het screenen van geneesmiddelen blijven echter beperkende factoren.

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve en high-throughput screeningsmethode die gebruik maakt van Drosophila melanogaster, een soort met een sterk geconserveerd slaapregulatiemechanisme in vergelijking met zoogdieren, waardoor het een ideaal model is voor het bestuderen van slaapstoornissen bij ouderen. Door verschillende kleine verbindingen toe te dienen aan oude vliegen, kunnen we hun effecten op slaapstoornissen beoordelen. Het slaapgedrag van deze vliegen wordt geregistreerd met behulp van een infraroodbewakingsapparaat en geanalyseerd met het open-source datapakket Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Dit protocol biedt een goedkope, reproduceerbare en efficiënte screeningsaanpak voor slaapregulatie. Fruitvliegjes zijn vanwege hun korte levenscyclus, lage houderijkosten en gebruiksgemak uitstekende onderwerpen voor deze methode. Ter illustratie: Reserpine, een van de geteste medicijnen, toonde het vermogen aan om de slaapduur bij oudere vliegen te bevorderen, wat de effectiviteit van dit protocol benadrukte.

Introduction

Slaap, een van de essentiële gedragingen die nodig zijn voor het overleven van de mens, wordt gekenmerkt door twee hoofdtoestanden: REM-slaap (Rapid Eye Movement) en niet-Rapid Eye Movement (NREM)-slaap1. NREM-slaap bestaat uit drie fasen: N1 (de overgang tussen waken en slapen), N2 (lichte slaap) en N3 (diepe slaap, langzame golfslaap), die de progressie van waakzaamheid naar diepe slaap1 vertegenwoordigen. Slaap speelt een cruciale rol in zowel de lichamelijke als de geestelijke gezondheid2. Veroudering vermindert echter de totale slaapduur, de slaapefficiëntie, het slow-wave slaappercentage en het REM-slaappercentage bijvolwassenen3. Oudere mensen hebben de neiging om meer tijd in lichte slaap door te brengen in vergelijking met langzame slaap, waardoor ze gevoeliger zijn voor nachtelijk ontwaken. Naarmate het aantal ontwaken toeneemt, neemt de gemiddelde slaaptijd af, wat resulteert in een gefragmenteerd slaappatroon bij ouderen, wat in verband kan worden gebracht met overmatige excitatie van Hprt-neuronen bij muizen4. Bovendien dragen leeftijdsgerelateerde dalingen van circadiane mechanismen bij aan een eerdere verschuiving in slaapduur 5,6. In combinatie met lichamelijke ziekte, psychologische stress, omgevingsfactoren en medicijngebruik maken deze factoren oudere volwassenen vatbaarder voor slaapstoornissen, zoals slapeloosheid, REM-slaapgedragsstoornis, narcolepsie, periodieke beenbewegingen, rustelozebenensyndroom en slaapstoornissen in de ademhaling 7,8.

Epidemiologische studies hebben aangetoond dat slaapstoornissen nauw verband houden met chronische ziekten bij ouderen9, waaronder depressie10, hart- en vaatziekten11 en dementie12. Het aanpakken van slaapstoornissen speelt een cruciale rol bij het verbeteren en behandelen van chronische ziekten en het verbeteren van de kwaliteit van leven van oudere volwassenen. Momenteel vertrouwen patiënten voornamelijk op geneesmiddelen zoals benzodiazepinen, niet-benzodiazepinen en melatoninereceptoragonisten om de slaapkwaliteit teverbeteren13. Benzodiazepinen kunnen echter leiden tot neerwaartse regulatie van receptoren en afhankelijkheid na langdurig gebruik, waardoor ernstige ontwenningsverschijnselen ontstaan bij stopzetting14,15. Niet-benzodiazepinen brengen ook risico’s met zich mee, waaronder dementie 16, fracturen17 en kanker18. De veelgebruikte melatoninereceptoragonist, ramelteon, vermindert de slaaplatentie, maar verlengt de slaapduur niet en heeft problemen met de leverfunctie als gevolg van uitgebreide first-pass-eliminatie19. Agomelatine, een melatoninereceptoragonist en serotoninereceptorantagonist, verbetert depressiegerelateerde slapeloosheid, maar vormt ook een risico op leverbeschadiging20. Daarom is er dringend behoefte aan veiligere medicijnen om slaapstoornissen te behandelen of te verlichten. De huidige strategieën voor het screenen van geneesmiddelen, gebaseerd op moleculaire en cellulaire experimenten in combinatie met geautomatiseerde systemen en computeranalyse, zijn echter duur en tijdrovend21. Op structuur gebaseerde strategieën voor het ontwerpen van geneesmiddelen, die gebaseerd zijn op de structuur en eigenschappen van receptoren, vereisen een duidelijk begrip van de driedimensionale structuur van receptoren en missen voorspellende mogelijkheden voor geneesmiddeleffecten22.

In 2000 stelden onderzoekers, op basis van de slaapcriteria voorgesteld door Campbell en Tobler in 1984 23, eenvoudige diermodellen op om slaap24 te bestuderen, waaronder Drosophila melanogaster, die slaapachtige toestanden vertoonde25,26. Ondanks anatomische verschillen tussen Drosophila en mensen, zijn veel neurochemische componenten en signaalroutes die de slaap bij Drosophila reguleren bewaard gebleven in de slaap van zoogdieren, wat de studie van neurologische aandoeningen bij de mens vergemakkelijkt27,28. Drosophila wordt ook op grote schaal gebruikt in circadiane ritmestudies, ondanks verschillen in kernoscillatoren tussen vliegen en zoogdieren 29,30,31. Daarom dient Drosophila als een waardevol modelorganisme voor het bestuderen van slaapgedrag en het uitvoeren van slaapgerelateerde drugsscreening.

Deze studie stelt een kosteneffectieve en eenvoudige op fenotype gebaseerde benadering voor voor het screenen van geneesmiddelen met kleine moleculen om slaapstoornissen te behandelen met behulp van verouderde vliegen. Slaapregulatie bij Drosophila is sterk geconserveerd25, en de afname van de slaap die met de leeftijd wordt waargenomen, kan omkeerbaar zijn door toediening van medicijnen. Deze op slaapfenotype gebaseerde screeningsmethode kan dus intuïtief de werkzaamheid van geneesmiddelen weerspiegelen. We voeden de vliegen met een mengsel van het onderzochte medicijn en voedsel, monitoren en registreren het slaapgedrag met behulp van de Drosophila Activity Monitor (DAM)32 en analyseren de verkregen gegevens met behulp van het open-source SCAMP2020 datapakket in MATLAB (Figuur 1). Statistische analyse wordt uitgevoerd met behulp van statistische en grafische software (zie Tabel met materialen). Als voorbeeld demonstreren we de effectiviteit van dit protocol door experimentele gegevens te presenteren over Reserpine, een remmer van kleine moleculen van de vesiculaire monoaminetransporter waarvan wordt gemeld dat deze de slaapverhoogt33. Dit protocol biedt een waardevolle benadering om geneesmiddelen te identificeren voor de behandeling van leeftijdsgebonden slaapproblemen.

Protocol

Dit protocol maakt gebruik van de 30 dagen oude w1118 vliegen van het Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, zie Tabel met materialen). 1. Bereiding van de gerijpte fruitvliegjes VoedselbereidingBereid standaard maïszetmeelkweekmedium door 50 g/l cornflakes, 110 g/l suiker, 5 g/l agar en 25 g/l gist te mengen. Verwarm de cornflakes en gist met water om te gelatiniseren en los vervolgens alle stoffen voll…

Representative Results

Reserpine is een remmer van kleine moleculen van de vesiculaire monoaminetransporter (VMAT), die de heropname van monoaminen in presynaptische blaasjes remt, wat leidt tot een verhoogdeslaap33. De slaapbevorderende effecten van Reserpine werden onderzocht bij vliegen van 30 dagen oud, waarbij de controlegroep uitsluitend werd gevoed met het oplosmiddel dimethylsulfoxide (DMSO). In de Reserpine-groep vertoonden oudere vliegen zowel overdag als ‘s nachts een significant verhoogde slaap in vergelijki…

Discussion

De beschreven methode is geschikt voor het snel screenen van kleine en middelgrote slaapmiddelen. Momenteel zijn de meeste gangbare high-throughput methoden voor het screenen van geneesmiddelen gebaseerd op biochemisch en cellulair niveau. Zo wordt bijvoorbeeld gekeken naar de structuur en eigenschappen van de receptor om te zoeken naar specifieke liganden die zich eraan kunnen binden22. Een andere benadering omvat het analyseren van de bindingswijze en sterkte van moleculaire fragmenten van gesel…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We danken de lableden van Prof. Junhai Han voor hun discussie en commentaar. Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China 32170970 aan Y.T en het “Cyanine Blue Project” van de provincie Jiangsu aan Z.C.Z.

Materials

Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons – an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer’s disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep – a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

Keywords: High-throughput ScreeningDrug DiscoveryStructure-based DesignFragment-based DesignDrosophila MelanogasterSleep DisordersInfrared MonitoringSCAMP2020Cost-effectiveAge-related Sleep Disorders
check_url/kr/65787?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image