Udforskning af livshistorievalg: Brug af temperatur og substrattype som interaktive faktorer for blowfly larve og kvindelige præferencer

Summary

Heri beskrives to protokoller til vurdering af fødekilde og ovipositionspræferencer hos larver og hunner af blæsefluer. Disse omfatter fire valg med to interagerende faktorer: substrattype og temperatur. Analyserne gør det muligt at bestemme larvernes fødekildepræference og hunnernes præference for æglægningssted.

Abstract

Blæsefluer (Diptera: Calliphoridae) præsenterer en bred vifte af larvelivsstil, typisk klassificeret som obligatorisk parasitisme, fakultativ parasitisme og fuldstændig sapro-nekrofagi. Flere parasitære arter, både obligatoriske og fakultative, anses for at være af sundhedsmæssig og økonomisk betydning, da deres larver kan forårsage myiasis (maddikeangreb i levende væv). Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at den voksne kvinde spiller en afgørende rolle, da hun vælger ovipositionsstedet og derfor i vid udstrækning bestemmer larvernes fodringsvaner og udviklingsbetingelser. I denne undersøgelse foreslås to protokoller for at teste larvefodringspræference og kvindelig ovipositionsstedpræference under hensyntagen til to interagerende faktorer: kødsubstrattype og temperatur. De opsætninger, der præsenteres her, tillod at teste Lucilia cuprina larver og gravide hunner i et firevalgsassay med to temperaturer (33 ± 2 ° C og 25 ± 2 ° C) og to typer kødsubstrater (fersk kød suppleret med blod og 5 dage gammelt råddent kød). Larver eller drægtige hunner kan vælge at grave eller lægge deres æg i et af følgende: råddent kød ved 25 °C (der simulerer en ådselædende artstilstand), fersk kød suppleret med blod ved 33 °C (der simulerer en parasitisk artstilstand) og to kontroller, råddent kød ved 33 °C eller fersk kød suppleret med blod ved 25 °C. Præferencen vurderes ved at tælle antallet af larver eller æg, der er lagt i hver mulighed for hver replikat. Sammenligning af de observerede resultater med en tilfældig fordeling tillod estimering af den statistiske signifikans af præferencen. Resultaterne viste, at L. cuprina larver har en stærk præference for det rådne substrat ved 25 °C. Omvendt var hunnernes præference for oviposition-site mere varieret for kødtypen. Denne metode kan tilpasses for at teste præferencen for andre insektarter af samme størrelse. Andre spørgsmål kan også udforskes ved hjælp af alternative betingelser.

Introduction

Fluer, især calyptrate muscoider (herunder blowflies, house fluer, bot fluer og kød fluer blandt andre), udviser en bred vifte af livsstil, der omfatter parasitære og nekro-saprophagous adfærd¹. Parasitiske arter forårsager typisk myiasis, et angreb af levende væv af maddiker (larver)². I Calliphoridae-familien er både obligatoriske og fakultative parasitære arter store husdyrskadedyr, der er ansvarlige for økonomiske tab og dårlig dyrevelfærd på grund af maddikeangreb 2,3,4,5,6,7. Obligatoriske parasitter, såsom skrueorm i den nye verden og den gamle verden (henholdsvis Cochliomyia hominivorax og Chrysomyia bezziana), er særligt problematiske 4,7,8,9,10 sammen med fakultative parasitter, såsom fåreblæsefluer (Lucilia cuprina og Lucilia sericata)2,5,6^{, 7}. Ikke-parasitære arter, herunder sapro-nekrofagiske, udvikler sig i rådnende og nekrotisk organisk materiale og findes almindeligvis i uhygiejniske miljøer. Deres strengt ikke-parasitære livsstil kan med succes anvendes til maddiketerapi, der bruger fluelarver til at rense sår af nekrotisk væv^11,12,13. Blæsefluer bruges også i retsmedicinsk videnskab, da de er blandt de første organismer til at lokalisere og kolonisere nyligt afdøde kroppe, hvor de udviklende larver tjener som et middel til at estimere dødstidspunktet¹⁴.

Blowfly livsstil har været genstand for forskellige forskningsundersøgelser (f.eks. 15,16,17,18,19,20,21) på grund af deres betydning i forhold til menneskelige interesser. Forståelse af de biologiske mekanismer, der styrer en arts livsstil, kan give værdifuld indsigt i forbedring af metoder til bekæmpelse af skadedyrsarter. Desuden tilbyder mangfoldigheden og udviklingen af blowfly livsstil en ideel kontekst til at studere oprindelsen og mekanismerne af komplekse træk (fx parasitisme). Parasitisme på grund af maddiker, der fodrer med levende væv, har udviklet sig uafhængigt flere gange inden for Calliphoridae-familien^22,23. Imidlertid er den evolutionære historie om blæsefluers fodringsvaner stadig stort set ukendt, med undersøgelser begrænset til at kortlægge vanerne langs fylogenier (f.eks. ^16,19,22) uden hjælp af funktionelle assays. For eksempel er det usikkert, om obligatoriske parasitter udviklede sig fra generalister (dvs. fakultative parasitter) eller direkte fra ådselædende arter. De molekylære, fysiologiske og adfærdsmæssige processer, der ledsager de evolutionære skift i livsstil, er også stort set ukendte.

I denne sammenhæng giver fakultative parasitter, såsom fåreblæseren Lucilia cuprina, der kan udvikle sig som parasitter på en vært eller som nekrofager på kadavere, mulighed for at udforske de faktorer og mekanismer, der styrer livsstilsvalg. Lucilia cuprina er en kosmopolitisk art kendt for at forårsage fårefluestrejke, især i Australien, hvor den betragtes som et skadedyr ^3,16. Myiasis på grund af L. cuprina kan også forekomme hos andre husdyr, kæledyr og mennesker 3,24,25,26,27,28,29,30. Imidlertid kan dens larver også udvikle sig i nekrotisk væv og rådnende materiale, og denne art er med succes blevet brugt i retsmedicinsk entomologi, da det er meget hurtigt at lokalisere og kolonisere lig^31,32,33,34. Selvom blowflies parasitære versus ikke-parasitære livsstil er defineret af larvestadiet, er det den voksne kvinde, der vælger ovipositionsstedet. Derfor har den voksne hun stor indflydelse på larvernes livsstil, da sidstnævnte har begrænset mobilitet. Hunnens valg betyder dog ikke nødvendigvis, at larverne foretrækker det samme substrat, når de præsenteres for et valg³⁵. En hypotese er, at adfærdsændringer, der fører til, at kvinder lægger deres æg på levende væv, kunne have været en del af et tidligt skift mod en parasitisk livsstil. Fortilpasninger eller fysiologiske evner hos de resulterende larver ville have været afgørende for deres vellykkede udvikling på det levende væv, hvilket førte til fremkomsten af den parasitære livsstil. Som sådan kan de berørte og udvalgte processer ikke nødvendigvis tilpasse sig mellem begge livsfaser.

I denne sammenhæng blev der udviklet to metoder til at teste adfærdsmæssig præference hos blæsefluer, især for L. cuprina, vedrørende larvefodringssubstrat (larvepræferenceassay) og ovipositionssted (kvindelig præferenceanalyse). Disse metoder tager højde for to interaktive faktorer: temperatur og kødfriskhed. Temperatur blev valgt som en afgørende faktor, da de fleste tilfælde af myiasis forekommer hos homøtermiske dyr². Derfor blev en temperatur på 33 °C valgt som erstatning for den “parasitære livsstilsfaktor”, mens en temperatur på 25 °C (stuetemperatur) repræsenterer den “ikke-parasitære faktor”. En temperatur på 25 °C blev valgt, da den er repræsentativ for den gennemsnitlige årlige temperatur, der er registreret i Brasilien (National Institute of Meteorology, INMET). Derudover blev to typer kødsubstrater overvejet, begge fra kvægkilder: (i) fersk kød suppleret med blod, der efterligner substratet for den parasitiske livsstil, som bruges til at opdrætte den parasitiske blowfly Co. hominivorax under laboratoriebetingelser³⁶, og (ii) 5 dage gammelt råddent kød, der efterligner substratet for den nekrolædende livsstil. Bovin substrat er almindeligt anvendt til opdræt L. cuprina i laboratorieforhold 27,37,38,39, da det giver flere fordele med hensyn til tilgængelighed, omkostningseffektivitet, og praktisk^, samtidig med at det er et økologisk forsvarligt substrat. Andre undersøgelser^40,41, der sammenligner effekten af rådne versus friske substrater i blæsefluer, har brugt 7 dage gammelt råddent substrat (under anaerobe forhold) og viste en negativ effekt af det rådne substrat på udviklingshastigheder, overlevelse og vækst. Da L. cuprina er kendt for at kolonisere friske kadavere, som normalt udsættes for luft, besluttede vi at bruge 5 dage gammelt råddent kød (hakket oksekød) i ikke-hermetiske gryder (aerob og anaerob nedbrydning) for at efterligne et nekrofagisk substrat.

De eksperimentelle designs, der præsenteres her, tilbyder fordelen ved at skelne præferencer for individuelle faktorer såvel som deres kombinerede virkninger. Desuden er de scorede fænotyper, nemlig valget af larvefodersubstrat og antallet af æg, der lægges, direkte relevante for de biologiske og økologiske aspekter af blowflyarter. Egnetheden af disse protokoller fremhæves ved at demonstrere deres effektivitet i L. cuprina. Derudover leveres et script til statistisk analyse, som kan bruges til at sammenligne de observerede resultater opnået i L. cuprina med simulerede tilfældige data, hvilket sikrer robust statistisk analyse og fortolkninger.

Protocol

Flueprøver blev opnået ved hjælp af fælder og ikke på angrebne dyr. En SISBIO-licens (67867-1) blev udstedt til at indsamle og holde fluer af Calliphoridae-familien i fangenskab under laboratorieforhold. Insektprøver er undtaget fra etisk evaluering i forskning i Brasilien. Oksekød og blod blev opnået kommercielt, og der var ikke behov for nogen etisk godkendelse. 1. Larve fodring præference Tilberedning af petriskåle indeholdende 2% agarTilbered fi…

Representative Results

For at demonstrere effektiviteten af de præsenterede metoder blev eksperimenterne udført under anvendelse af en laboratoriepopulation af Lucilia cuprina (familie: Calliphoridae), en fakultativ parasitisk blowfly2. Hele det rå datasæt, der er opnået for denne art, findes i supplerende fil S3 med resultaterne for larve- og hunsubstratpræferencetestene. For at vurdere, om larverne og hunnerne foretrækker et hvilket som helst substrat, blev de observerede data sammenli…

Discussion

Forståelse af udviklingen af fodringsvaner, især i forbindelse med parasitisme hos blæsefluer, kræver undersøgelse af substratpræferencer gennem forskellige livsstadier for fodring eller oviposition. Derfor blev der i denne undersøgelse foreslået robuste og ligetil metoder til at undersøge substratpræferencer hos larver og hunner af blæsefluer. Disse metoder blev testet i Lucilia cuprina, en fakultativ parasitisk blowfly². Interessant nok afslørede eksperimenterne en tydelig t…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)