Onderzoek naar keuzes in de levensgeschiedenis: temperatuur en substraattype gebruiken als op elkaar inwerkende factoren voor voorkeuren van bromvlieglarven en vrouwtjes

Summary

Hierin worden twee protocollen beschreven voor het beoordelen van voedselbron- en ovipositievoorkeuren bij larven en vrouwtjes van bromvliegen. Deze bestaan uit vier keuzes met twee factoren die op elkaar inwerken: het type substraat en de temperatuur. De testen maken het mogelijk om de voedselbronvoorkeur van de larven en de voorkeur voor de ovipositieplaats van de vrouwtjes te bepalen.

Abstract

Bromvliegen (Diptera: Calliphoridae) vertonen een breed scala aan larvale levensstijlen, meestal geclassificeerd als obligaat parasitisme, facultatief parasitisme en volledige sapro-necrofagie. Verschillende parasitaire soorten, zowel obligate als facultatieve, worden beschouwd als van sanitair en economisch belang, omdat hun larven myiasis (madenbesmetting in levend weefsel) kunnen veroorzaken. Het is echter opmerkelijk dat het volwassen vrouwtje een beslissende rol speelt bij het kiezen van de ovipositieplaats en daarom grotendeels de voedingsgewoonte en ontwikkelingsomstandigheden van de larven bepaalt. In deze studie worden twee protocollen voorgesteld om de voedingsvoorkeur van larven en de voorkeur voor de vrouwelijke ovipositieplaats te testen, rekening houdend met twee op elkaar inwerkende factoren: het type vleessubstraat en de temperatuur. De hier gepresenteerde opstellingen maakten het mogelijk om Lucilia cuprina-larven en drachtige vrouwtjes te testen in een vierkeuzetest met twee temperaturen (33 ± 2 °C en 25 ± 2 °C) en twee soorten vleessubstraten (vers vlees aangevuld met bloed en 5 dagen oud bedorven vlees). Larven of drachtige vrouwtjes kunnen ervoor kiezen om respectievelijk hun eieren in te graven of te leggen in een van de volgende situaties: bedorven vlees bij 25 °C (simulatie van een acrofaag soort), vers vlees aangevuld met bloed bij 33 °C (simulatie van een parasitaire soortconditie) en twee controles, bedorven vlees bij 33 °C of vers vlees aangevuld met bloed bij 25 °C. De voorkeur wordt beoordeeld door het aantal larven of eieren te tellen dat in elke optie voor elke replica is gelegd. Door de waargenomen resultaten te vergelijken met een willekeurige verdeling, kon de statistische significantie van de voorkeur worden ingeschat. De resultaten gaven aan dat larven van L. cuprina een sterke voorkeur hebben voor het rotte substraat bij 25 °C. Omgekeerd was de voorkeur van vrouwtjes voor de ovipositieplaats meer gevarieerd voor het vleestype. Deze methodologie kan worden aangepast om de voorkeur van andere insectensoorten van vergelijkbare grootte te testen. Andere vragen kunnen ook worden onderzocht door gebruik te maken van alternatieve voorwaarden.

Introduction

Vliegen, met name kelkvormige muskoïden (waaronder bromvliegen, huisvliegen, botvliegen en vleesvliegen), vertonen een breed scala aan levensstijlen, waaronder parasitair en necro-saprofage gedrag. Parasitaire soorten veroorzaken meestal myiasis, een aantasting van levende weefsels door maden (larven)². In de familie Calliphoridae zijn zowel obligate als facultatieve parasitaire soorten belangrijke veeplagen die verantwoordelijk zijn voor economische verliezen en slecht dierenwelzijn als gevolg van madenplagen 2,3,4,5,6,7. Obligate parasieten, zoals de schroefwormen van de Nieuwe Wereld en de Oude Wereld (respectievelijk Cochliomyia hominivorax en Chrysomyia bezziana), zijn bijzonder problematisch 4,7,8,9,10 samen met facultatieve parasieten, zoals de schapenbromvliegen (Lucilia cuprina en Lucilia sericata)^{2,5,6, 7}. okt. Niet-parasitaire soorten, waaronder sapro-necrofaag, ontwikkelen zich in rottend en necrotisch organisch materiaal en worden vaak aangetroffen in onhygiënische omgevingen. Hun strikt niet-parasitaire levensstijl kan met succes worden gebruikt voor madentherapie, waarbij vliegenlarven worden gebruikt om wonden van necrotische weefsels schoon te maken^11,12,13. Bromvliegen worden ook gebruikt in de forensische wetenschap, omdat ze tot de eerste organismen behoren die recent overleden lichamen lokaliseren en koloniseren, waarbij de zich ontwikkelende larven dienen als een middel om het tijdstip van overlijden te schatten¹⁴.

De levensstijl van bromvliegen is het onderwerp geweest van verschillende onderzoeken (bijv. 15,16,17,18,19,20,21) vanwege hun betekenis in relatie tot menselijke belangen. Inzicht in de biologische mechanismen die de levensstijl van een soort bepalen, kan waardevolle inzichten opleveren in het verbeteren van methoden die gericht zijn op het bestrijden van plaagsoorten. Bovendien bieden de diversiteit en evolutie van de levensstijl van bromvliegen een ideale context om de oorsprong en mechanismen van complexe eigenschappen (bijv. parasitisme) te bestuderen. Parasitisme als gevolg van maden die zich voeden met levend weefsel is verschillende keren onafhankelijk geëvolueerd binnen de familie Calliphoridae^22,23. De evolutionaire geschiedenis van de voedingsgewoonten van bromvliegen is echter nog grotendeels onbekend, met studies die beperkt zijn tot het in kaart brengen van de gewoonten langs fylogenieën (bijv. ^16,19,22) zonder de hulp van functionele assays. Het is bijvoorbeeld onzeker of obligate parasieten zijn geëvolueerd uit generalisten (d.w.z. facultatieve parasieten) of rechtstreeks uit necrofaag soorten. De moleculaire, fysiologische en gedragsprocessen die gepaard gaan met de evolutionaire verschuivingen in levensstijl zijn ook grotendeels onbekend.

In deze context bieden facultatieve parasieten, zoals de schaapskogelvlieg Lucilia cuprina, die zich kunnen ontwikkelen als parasieten op een gastheer of als necrofagen op kadavers, de mogelijkheid om de factoren en mechanismen te onderzoeken die levensstijlkeuzes bepalen. Lucilia cuprina is een kosmopolitische soort die bekend staat om het veroorzaken van schapenvliegen, vooral in Australië, waar het als een plaag wordt beschouwd ^3,16. Myiasis als gevolg van L. cuprina kan ook voorkomen bij andere veedieren, huisdieren en mensen 3,24,25,26,27,28,29,30. De larven kunnen zich echter ook ontwikkelen in necrotische weefsels en rottend materiaal en deze soort is met succes gebruikt in de forensische entomologie omdat het zeer snel is om lijken te lokaliseren en te koloniseren^31,32,33,34. Hoewel de parasitaire versus niet-parasitaire levensstijl van bromvliegen wordt bepaald door het larvale stadium, is het het volwassen vrouwtje dat de ovipositieplaats selecteert. Bijgevolg heeft het volwassen vrouwtje een grote invloed op de levensstijl van de larven, omdat deze laatste een beperkte mobiliteit hebben. De keuze van het vrouwtje betekent echter niet noodzakelijkerwijs dat de larven de voorkeur geven aan hetzelfde substraat wanneer ze een keuze krijgen³⁵. Een hypothese is dat gedragsveranderingen die ertoe leiden dat vrouwtjes hun eieren op levend weefsel leggen, deel kunnen hebben uitgemaakt van een vroege omschakeling naar een parasitaire levensstijl. Pre-adaptaties of fysiologische vermogens van de resulterende larven zouden essentieel zijn geweest voor hun succesvolle ontwikkeling op het levende weefsel, wat leidde tot het ontstaan van de parasitaire levensstijl. Als zodanig hoeven de beïnvloede en geselecteerde processen niet noodzakelijkerwijs op één lijn te liggen tussen beide levensfasen.

In deze context werden twee methoden ontwikkeld om gedragsvoorkeur bij bromvliegen te testen, in het bijzonder voor L. cuprina, met betrekking tot het voedingssubstraat van de larven (larvale voorkeurstest) en de ovipositieplaats (vrouwelijke voorkeurstest). Deze methoden houden rekening met twee op elkaar inwerkende factoren: temperatuur en versheid van het vlees. Temperatuur werd gekozen als een cruciale factor, aangezien de meeste gevallen van myiasis voorkomen bij homeotherme dieren². Daarom werd een temperatuur van 33 °C gekozen als proxy voor de “parasitaire levensstijlfactor”, terwijl een temperatuur van 25 °C (kamertemperatuur) de “niet-parasitaire factor” vertegenwoordigt. Er is gekozen voor een temperatuur van 25 °C omdat deze representatief is voor de gemiddelde jaartemperatuur die in Brazilië is geregistreerd (Nationaal Instituut voor Meteorologie, INMET). Daarnaast werden twee soorten vleessubstraten overwogen, beide afkomstig van runderen: (i) vers vlees aangevuld met bloed, dat het substraat nabootst voor de parasitaire levensstijl, dat wordt gebruikt om de parasitaire bromvlieg Co. hominivorax in laboratoriumomstandigheden te kweken³⁶, en (ii) 5 dagen oud rot vlees, dat het substraat nabootst voor de necrofaag levensstijl. Het rundersubstraat wordt vaak gebruikt om L. cuprina te kweken in laboratoriumomstandigheden 27,37,38,39 omdat het verschillende voordelen biedt op het gebied van beschikbaarheid, kosteneffectiviteit en bruikbaarheid^, terwijl het een ecologisch verantwoord substraat is. Andere studies^40,41 waarin het effect van rotte versus verse substraten bij bromvliegen werd vergeleken, hebben 7 dagen oud rot substraat gebruikt (in anaërobe omstandigheden) en toonden een nadelig effect van het rotte substraat op ontwikkelingssnelheden, overleving en groei. Omdat bekend is dat L. cuprina verse kadavers koloniseert die meestal aan lucht worden blootgesteld, hebben we besloten om 5 dagen oud rot vlees (rundergehakt) te gebruiken in niet-hermetische potten (aërobe en anaërobe afbraak) om een necrofaag substraat na te bootsen.

De hier gepresenteerde experimentele ontwerpen bieden het voordeel van het onderscheiden van voorkeuren voor individuele factoren en hun gecombineerde effecten. Bovendien zijn de gescoorde fenotypen, namelijk de keuze van het voedingssubstraat voor de larven en het aantal gelegde eieren, direct relevant voor de biologische en ecologische aspecten van bromvliegsoorten. De geschiktheid van deze protocollen wordt benadrukt door hun effectiviteit in L. cuprina aan te tonen. Daarnaast wordt een script voor statistische analyse verstrekt, dat kan worden gebruikt om de waargenomen resultaten verkregen in L. cuprina te vergelijken met gesimuleerde willekeurige gegevens, waardoor robuuste statistische analyse en interpretaties worden gegarandeerd.

Protocol

Vliegenmonsters werden verkregen met behulp van vallen en niet op besmette dieren. Er werd een SISBIO-vergunning (67867-1) afgegeven om vliegen van de familie Calliphoridae in gevangenschap te verzamelen en te houden in laboratoriumomstandigheden. Insectenmonsters zijn vrijgesteld van ethische evaluatie in onderzoek in Brazilië. Rundvlees en -bloed werden commercieel verkregen en er was geen ethische goedkeuring vereist. 1. Voedingsvoorkeur voor larven Bereiding van…

Representative Results

Om de effectiviteit van de gepresenteerde methoden aan te tonen, werden de experimenten uitgevoerd met behulp van een laboratoriumpopulatie van Lucilia cuprina (familie: Calliphoridae), een facultatieve parasitaire bromvlieg2. De volledige ruwe dataset die voor deze soort is verkregen, is te vinden in aanvullend bestand S3 met de resultaten voor de larvale en vrouwelijke substraatvoorkeurstests. Om te beoordelen of de larven en vrouwtjes een voorkeur hebben voor een subst…

Discussion

Om de evolutie van voedingsgewoonten te begrijpen, met name in de context van parasitisme bij bromvliegen, is het nodig om de voorkeuren van het substraat te onderzoeken in de verschillende levensfasen voor voeding of ovipositie. Daarom werden in deze studie robuuste en eenvoudige methoden voorgesteld voor het onderzoeken van substraatvoorkeuren bij larven en vrouwtjes van bromvliegen. Deze methoden werden getest in Lucilia cuprina, een facultatieve parasitaire bromvlieg². Interessant is …

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)