生活史選択の探索:温度と基質の種類をフバエの幼虫と雌の嗜好の相互作用因子として用いる

Summary

本明細書では、フクロバエの幼虫および雌の食物源および産卵嗜好を評価するための2つのプロトコルが詳述されている。これらは、基板の種類と温度という2つの相互作用する要因を持つ4つの選択肢で構成されています。このアッセイにより、幼虫の食物源の好みと雌の産卵部位の好みを決定することができます。

Abstract

フクロバエ(双翅目:Calliphoridae)は、通常、偏性寄生、通性寄生、および完全な屍姦に分類される、幅広い幼虫のライフスタイルを示します。いくつかの寄生種は、義務性および通性の両方で、幼虫がミイアシス(生きた組織へのウジの蔓延)を引き起こす可能性があるため、衛生的および経済的に重要であると考えられています。しかし、産卵部位の選択には成虫の雌が決定的な役割を果たしており、幼虫の食性や発育状況を大きく左右していることは注目に値する。この研究では、幼虫の摂食嗜好と雌の産卵部位の嗜好をテストするために、2つのプロトコルが提案されています 肉の基質の種類と温度の2つの相互作用要因を考慮します。ここで紹介するセットアップでは、2つの温度(33±2°Cと25±2°C)と2種類の肉基質(新鮮な肉に血液と5日齢の腐った肉)の4つの選択肢アッセイで、 Lucilia cuprina の幼虫と妊娠した雌を試験することができました。幼虫または妊娠中の雌は、25°Cの腐った肉(屍食性種の状態をシミュレート)、33°Cで血液を補給した新鮮な肉(寄生種の状態をシミュレート)、および2つの対照、33°Cの腐った肉、または25°Cの血液を補給した新鮮な肉のいずれかで、それぞれ穴を掘るか産卵するかを選択できます。 選好は、各反復の各オプションに産み付けられた幼虫または卵の数をカウントすることによって評価されます。観察された結果をランダム分布と比較することで、選好の統計的有意性を推定することができました。その結果、 L. cuprina の幼虫は25°Cで腐った基質を強く好むことが示された。 逆に、雌の産卵部位の嗜好は肉の種類によってより多様であった。この方法論は、同様のサイズの他の昆虫種の好みをテストするために適応させることができます。他の質問は、代替条件を使用して調べることもできます。

Introduction

ハエ、特に萼類のムコイド(フクロバエ、イエバエ、ヒツジバエ、肉バエなど)は、寄生行動や死死仙食行動など、幅広い生活様式^{を示す1。}寄生種は通常、ウジ虫(幼虫)による生きた組織の蔓延であるミイアシスを引き起こします²。Calliphoridae科では、ウジ虫の蔓延による経済的損失と動物福祉の悪さの原因となる主要な家畜害虫です2,3,4,5,6,7。新世界と旧世界のスクリューワーム(それぞれCochliomyia hominivoraxとChrysomyia bezziana)などの偏性寄生虫は、ヒツジのフクロバエ(Lucilia cuprinaとLucilia sericata)などの通性寄生虫とともに特に問題があります4,7,8,9,102,5,6^。7.屍食性を含む非寄生種は、腐敗や壊死した有機物で発生し、不衛生な環境でよく見られます。彼らの厳密に非寄生的なライフスタイルは、ハエの幼虫を使用して壊死組織の傷をきれいにするウジ虫療法にうまく使用できます^11,12,13。フクロバエは、最近死亡した遺体を見つけてコロニーを形成した最初の生物の1つであり、発育中の幼虫が死亡時刻を推定する手段として機能するため、法医学でも使用されています¹⁴。

ブローフライのライフスタイルは、人間の利益に関連して重要であるため、さまざまな調査研究の対象となっています(例:¹⁵、16、¹⁷、¹⁸、^19、20、21)。種のライフスタイルを支配する生物学的メカニズムを理解することは、害虫種の防除を目的とした方法を改善するための貴重な洞察を提供することができます。さらに、コガネムシのライフスタイルの多様性と進化は、複雑な形質(寄生など)の起源とメカニズムを研究するための理想的な状況を提供します。生きた組織を餌とするウジ虫による寄生は、Calliphoridae科内で数回独立して進化してきた^22,23。しかし、フクロバエの食性の進化史はまだほとんど知られておらず、研究は機能アッセイの助けを借りずに系統発生に沿って習性をマッピングすることに限定されています(例:^16,19,22)。例えば、義務性寄生虫がジェネラリスト(通性寄生虫)から進化したのか、それとも屍食性種から直接進化したのかは不明である。ライフスタイルの進化的変化に伴う分子的、生理学的、行動学的プロセスもほとんどわかっていません。

これに関連して、ヒツジのフクロバエLucilia cuprinaなどの通性寄生虫は、宿主の寄生虫として、または死体の屍姦虫として発生する可能性があり、ライフスタイルの選択を制御する要因とメカニズムを調査する可能性を提供します。Lucilia cuprinaは、特に害虫と見なされているオーストラリアで、羊のハエの攻撃を引き起こすことで知られるコスモポリタン種です^3,16。L. cuprinaによるミヤ症は、他の家畜、ペット、および人間にも発生する可能性があります3,24,25,26,27,28,29,30。しかし、その幼虫は壊死組織や腐敗物質でも発生する可能性があり、この種は死体を見つけてコロニーを形成するのが非常に速いため、法医昆虫学で成功裏に使用されています31,32,33,34。フクロバエの寄生性と非寄生性のライフスタイルは幼虫期によって定義されますが、産卵部位を選択するのは成虫の雌です。その結果、成虫の雌は幼虫の行動が制限されているため、幼虫のライフスタイルに大きな影響を与えます。しかし、雌の選択は、幼虫が選択肢を提示されたときに同じ基質を好むことを必ずしも意味するものではない³⁵。1つの仮説は、雌が生きた組織に卵を産むことにつながる行動の変化は、寄生的な生活様式への初期の切り替えの一部であった可能性があるというものです。得られた幼虫の事前適応または生理学的能力は、生きた組織上での発達の成功に不可欠であり、寄生生活様式の出現につながった。そのため、影響を受けるプロセスと選択されるプロセスは、必ずしも両方のライフステージ間で一致するとは限りません。

これに関連して、フクロバエ、特にL. cuprinaの幼虫の摂食基質(幼虫選好アッセイ)と産卵部位(雌の選好アッセイ)に関する行動嗜好をテストするために、2つの方法が開発されました。これらの方法では、温度と肉の鮮度という2つの相互作用する要因が考慮されます。筋虫症のほとんどの症例は恒^温動物で発生するため、温度が重要な要素として選択されました2。したがって、33°Cの温度が「寄生生活因子」の代理として選択され、25°C(室温)の温度が「非寄生因子」を表します。25°Cは、ブラジルで記録された年間平均気温を表すため、選択されました(国立気象研究所、INMET)。さらに、2種類の肉基質が検討されたが、いずれもウシ由来である:(i)寄生性生活様式の基質を模倣した血液を添加した生肉(寄生性フクロバエ社ヒトボラックスを実験室条件³⁶で飼育するために使用される)、および(ii)屍食生活様式の基質を模倣した5日齢の腐肉。ウシ基質は、生態学的に正当化可能な基質であると同時に、入手可能性、費用対効果、および実用性の点でいくつかの利点を提供するため、実験室条件27,37,38,39でL.cuprinaを飼育するために一般的に使用されます。フクロバエの腐った基質と新鮮な基質の影響を比較した他の研究^40,41では、7日齢の腐った基質(嫌気性条件)を使用し、腐った基質が発生速度、生存率、および成長に悪影響を与えることを示しました。 L. cuprinaは、通常空気にさらされる新鮮な死体にコロニーを形成することが知られているため、私たちは、5日齢の腐った肉(牛ひき肉)を非密閉性の鍋(好気性および嫌気性分解)で使用し、屍食性の基質を模倣することにしました。

ここで紹介する実験計画は、個々の因子とその複合効果に対する選好を見分けるという利点があります。さらに、スコアリングされた表現型、すなわち幼虫の摂食基質の選択と産卵数は、フクロバエ種の生物学的および生態学的側面に直接関連しています。これらのプロトコルの適合性は、 L. cuprinaにおける有効性を実証することによって強調されています。さらに、 L. cuprina で得られた観察結果をシミュレートされたランダムデータと比較するために使用できる統計分析用のスクリプトが提供されており、堅牢な統計分析と解釈を保証します。

Protocol

ハエのサンプルは、感染した動物ではなく、トラップを使用して取得しました。SISBIOライセンス(67867-1)が発行され、Calliphoridae科のハエを収集し、実験室条件で飼育しました。昆虫のサンプルは、ブラジルでの研究における倫理的評価を免除されています。ウシの肉と血液は商業的に入手され、倫理的クリアランスは必要ありませんでした。 1.幼虫の摂食の好み</strong…

Representative Results

提示された方法の有効性を実証するために、実験は、通性寄生性フガンバエであるLucilia cuprina(科:Calliphoridae)の実験室集団を用いて行われました2。本種について得られた生データセット全体は、幼虫および雌の基質選好性試験の結果とともに補足ファイルS3にあります。幼虫と雌が何らかの基質を好むかどうかを評価するために、観察されたデータを、そ?…

Discussion

特にフクロバエの寄生の文脈における食性の進化を理解するには、摂食や産卵のさまざまなライフステージにわたる基質の好みを調べる必要があります。そこで、本研究では、フクロバエの幼虫や雌の基質選好性を調べるための頑健で簡便な手法を提案した。これらの方法は、通性寄生性フ^{ガンガンである}Lucilia cuprinaでテストされました2。興味深いことに、この実験…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)