Utforske livshistorievalg: Bruke temperatur og substrattype som samvirkende faktorer for blåsefluelarver og kvinnelige preferanser

Summary

Her er to protokoller for vurdering av matkilde og oviposisjonspreferanser hos larver og hunner av blåfluer detaljert. Disse består av fire valg med to samvirkende faktorer: substrattype og temperatur. Analysene gjør det mulig å bestemme larvenes matkildepreferanse og oviposisjonspreferansen for hunnene.

Abstract

Blåfluer (Diptera: Calliphoridae) presenterer et bredt spekter av larvelivsstil, vanligvis klassifisert som obligatorisk parasittisme, fakultativ parasittisme og fullstendig sapro-nekrofagi. Flere parasittiske arter, både obligatoriske og fakultative, anses å være av hygienisk og økonomisk betydning, da larvene deres kan forårsake myiasis (maggotangrep i levende vev). Det er imidlertid bemerkelsesverdig at den voksne kvinnen spiller en avgjørende rolle når hun velger oviposisjonsstedet, og derfor i stor grad bestemmer larvenes fôringsvane og utviklingsforhold. I denne studien foreslås to protokoller for å teste larvefôringspreferanse og hunnens oviposisjonspreferanse med tanke på to samvirkende faktorer: kjøttsubstrattype og temperatur. Oppsettene som presenteres her tillot å teste Lucilia cuprina larver og gravide hunner i en firevalgsanalyse med to temperaturer (33 ± 2 ° C og 25 ± 2 ° C) og to typer kjøttsubstrater (ferskt kjøtt supplert med blod og 5 dager gammelt råttent kjøtt). Larver eller drektige hunner kan velge å grave eller legge eggene sine henholdsvis i ett av følgende: råttent kjøtt ved 25 °C (simulerer en nekrofagøs artstilstand), ferskt kjøtt tilsatt blod ved 33 °C (simulerer parasittisk artstilstand) og to kontroller, råttent kjøtt ved 33 °C eller ferskt kjøtt tilsatt blod ved 25 °C. Preferansen vurderes ved å telle antall larver eller egg lagt i hvert alternativ for hver replikasjon. Sammenligning av de observerte resultatene med en tilfeldig fordeling gjorde det mulig å estimere den statistiske signifikansen av preferansen. Resultatene indikerte at L. cuprina-larver har en sterk preferanse for det råtne substratet ved 25 °C. Omvendt var oviposisjonspreferanse av kvinner mer variert for kjøtttypen. Denne metoden kan tilpasses for å teste preferansen til andre insektarter av tilsvarende størrelse. Andre spørsmål kan også utforskes ved å bruke alternative betingelser.

Introduction

Fluer, spesielt calyptrate muscoids (inkludert blowflies, house fluer, bot fluer og kjøtt fluer blant andre), utviser et bredt spekter av livsstil, som omfatter parasittiske og necro-saprophagous atferd¹. Parasittiske arter forårsaker vanligvis myiasis, et angrep av levende vev av (larver)². I familien Calliphoridae er både obligatoriske og fakultative parasittiske arter store på husdyr som er ansvarlige for økonomiske tap og dårlig dyrevelferd på grunn av maggot angrep 2,3,4,5,6,7. Obligate parasitter, som New World og Old World skrueorm (Cochliomyia hominivorax og Chrysomyia bezziana, henholdsvis), er spesielt problematiske 4,7,8,9,10 sammen med fakultative parasitter, som saueblåsefluer (Lucilia cuprina og Lucilia sericata) ^{2,5,6, 7}. Ikke-parasittiske arter, inkludert sapro-nekrofagøse, utvikler seg i forfall og nekrotisk organisk materiale og finnes ofte i uhygieniske miljøer. Deres strengt ikke-parasittiske livsstil kan med hell brukes til maggotterapi, som bruker fluelarver til å rense sår av nekrotisk vev^11,12,13. Blowflies brukes også i rettsmedisin, da de er blant de første organismer som finner og koloniserer nylig avdøde kropper, med de utviklende larver som tjener som et middel til å estimere dødstidspunktet¹⁴.

Blowfly livsstil har vært gjenstand for ulike forskningsstudier (f.eks. 15,16,17,18,19,20,21) på grunn av deres betydning i forhold til menneskelige interesser. Å forstå de biologiske mekanismene som styrer en arts livsstil kan gi verdifull innsikt i å forbedre metoder som tar sikte på å kontrollere skadedyrarter. Videre tilbyr mangfoldet og utviklingen av blowfly livsstil en ideell kontekst for å studere opprinnelsen og mekanismene til komplekse egenskaper (f.eks. Parasitisme). Parasittisme på grunn av som spiser på levende vev har utviklet seg uavhengig flere ganger i familien Calliphoridae^22,23. Imidlertid er den evolusjonære historien til fôringsvanene til blåfluer fortsatt stort sett ukjent, med studier begrenset til å kartlegge vanene langs fylogenier (f.eks. ^16,19,22) uten hjelp av funksjonelle analyser. For eksempel er det usikkert om obligatoriske parasitter utviklet seg fra generalister (dvs. fakultative parasitter) eller direkte fra nekrofagøse arter. De molekylære, fysiologiske og atferdsmessige prosessene som følger med de evolusjonære skiftene i livsstil er også stort sett ukjente.

I denne sammenheng gir fakultative parasitter, som saueblåseren Lucilia cuprina, som kan utvikle seg som parasitter på en vert eller som nekrofager på, muligheten til å utforske faktorene og mekanismene som styrer livsstilsvalg. Lucilia cuprina er en kosmopolitisk art kjent for å forårsake saueflueangrep, spesielt i Australia hvor den regnes som et ^3,16. Myiasis forårsaket av L. cuprina kan også forekomme hos andre husdyr, kjæledyr og mennesker 3,24,25,26,27,28,29,30. Imidlertid kan larvene også utvikle seg i nekrotisk vev og råtnende materiale, og denne arten har blitt vellykket brukt i rettsmedisinsk entomologi, da det er veldig raskt å lokalisere og kolonisere lik^31,32,33,34. Selv om den parasittiske versus ikke-parasittiske livsstilen til blowflies er definert av larvalstadiet, er det den voksne kvinnen som velger oviposisjonsstedet. Følgelig påvirker den voksne hunnen larvenes livsstil sterkt, da sistnevnte har begrenset mobilitet. Hunnens valg betyr imidlertid ikke nødvendigvis at larvene foretrekker det samme substratet når de presenteres for et valg³⁵. En hypotese er at atferdsendringer som fører til at kvinner legger eggene sine på levende vev, kan ha vært en del av en tidlig overgang til en parasittisk livsstil. Pre-tilpasninger eller fysiologiske evner av de resulterende larver ville ha vært avgjørende for deres vellykkede utvikling på levende vev, noe som førte til fremveksten av den parasittiske livsstilen. Som sådan kan prosessene som påvirkes og velges, ikke nødvendigvis samsvare mellom begge livsstadiene.

I denne sammenheng ble det utviklet to metoder for å teste atferdspreferanse hos blowflies, spesielt for L. cuprina, angående larvefôringssubstrat (larvepreferanseanalyse) og oviposisjonssted (kvinnelig preferanseanalyse). Disse metodene tar hensyn til to samvirkende faktorer: temperatur og kjøttfriskhet. Temperatur ble valgt som en avgjørende faktor siden de fleste tilfeller av myiasis forekommer hos homeoterme dyr². Derfor ble en temperatur på 33 °C valgt som proxy for den “parasittiske livsstilsfaktoren”, mens en temperatur på 25 °C (romtemperatur) representerer den “ikke-parasittiske faktoren”. En temperatur på 25 °C ble valgt fordi den er representativ for den gjennomsnittlige årlige temperaturen registrert i Brasil (National Institute of Meteorology, INMET). I tillegg ble to typer kjøttsubstrater vurdert, begge fra storfekilder: (i) ferskt kjøtt supplert med blod, som etterligner substratet for den parasittiske livsstilen, som brukes til å oppdra den parasittiske blåsefluen Co. hominivorax i laboratorieforhold³⁶, og (ii) 5 dager gammelt råttent kjøtt, som etterligner substratet for nekrofagøs livsstil. Storfesubstratet brukes ofte til å heve L. cuprina under laboratorieforhold 27,37,38,39, da det gir flere fordeler når det gjelder tilgjengelighet, kostnadseffektivitet og praktisk^, samtidig som det er et økologisk forsvarlig substrat. Andre studier^40,41 som sammenligner effekten av råtne versus friske substrater i blåfluer har brukt 7 dager gammelt råttent substrat (under anaerobe forhold) og viste en negativ effekt av det råtne substratet på utviklingsrater, overlevelse og vekst. Siden L. cuprina er kjent for å kolonisere ferske som vanligvis utsettes for luft, bestemte vi oss for å bruke 5 dager gammelt råttent kjøtt (kjøttdeig) i ikke-hermetiske gryter (aerob og anaerob nedbrytning) for å etterligne et nekrofagøst substrat.

De eksperimentelle designene som presenteres her, gir fordelen av kresne preferanser for individuelle faktorer, så vel som deres kombinerte effekter. Videre er fenotypene som er scoret, nemlig valg av larvefôringssubstrat og antall egg lagt, direkte relevante for de biologiske og økologiske aspektene ved blåsefluearter. Egnetheten til disse protokollene er fremhevet ved å demonstrere deres effektivitet i L. cuprina. I tillegg er det gitt et skript for statistisk analyse, som kan brukes til å sammenligne de observerte resultatene oppnådd i L. cuprina med simulerte tilfeldige data, noe som sikrer robust statistisk analyse og tolkninger.

Protocol

Flueprøver ble tatt ved hjelp av feller og ikke på infiserte dyr. En SISBIO-lisens (67867-1) ble utstedt for å samle inn og holde fluer av Calliphoridae-familien i fangenskap under laboratorieforhold. Insektprøver er unntatt fra etisk evaluering i forskning i Brasil. Storfekjøtt og blod ble oppnådd kommersielt, og ingen etisk klarering var nødvendig. 1. Larvefôringspreferanse Tilberedning av petriskålene som inneholder 2% agarForbered fire petriskål…

Representative Results

For å demonstrere effektiviteten av de presenterte metodene ble forsøkene utført ved hjelp av en laboratoriepopulasjon av Lucilia cuprina (familie: Calliphoridae), en fakultativ parasittisk blowfly2. Hele rådatasettet som er oppnådd for denne arten, finnes i tilleggsfil S3 med resultatene for larve- og hunnsubstratpreferansetestene. For å vurdere om larver og hunner viser en preferanse for noe substrat, ble de observerte dataene sammenlignet med 1000 simulerte datas…

Discussion

Å forstå utviklingen av fôringsvaner, spesielt i sammenheng med parasittisme hos blåfluer, krever undersøkelse av substratpreferanser gjennom ulike livsstadier for fôring eller oviposisjon. Derfor ble det i denne studien foreslått robuste og enkle metoder for å undersøke substratpreferanser hos larver og hunner av blåfluer. Disse metodene ble testet i Lucilia cuprina, en fakultativ parasittisk blowfly². Interessant nok avslørte eksperimentene en tydelig tilbøyelighet til rått…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)