Explorando escolhas de história de vida: usando a temperatura e o tipo de substrato como fatores de interação para as preferências de larvas e fêmeas de mosca-varejeira

Summary

Neste trabalho, são detalhados dois protocolos para avaliação da fonte alimentar e preferências de oviposição em larvas e fêmeas de moscas-varejeiras. Estes compreendem quatro opções com dois fatores interagentes: tipo de substrato e temperatura. Os ensaios permitem determinar a preferência da fonte alimentar das larvas e a preferência do sítio de oviposição para as fêmeas.

Abstract

As moscas-varejeiras (Diptera: Calliphoridae) apresentam uma ampla variedade de estilos de vida larval, tipicamente classificados como parasitismo obrigatório, parasitismo facultativo e sapro-necrofagia completa. Várias espécies parasitárias, obrigatórias e facultativas, são consideradas de importância sanitária e econômica, pois suas larvas podem causar miíase (infestação de larvas em tecidos vivos). No entanto, vale ressaltar que a fêmea adulta desempenha um papel decisivo na escolha do local de oviposição e, portanto, determina em grande parte o hábito alimentar e as condições de desenvolvimento das larvas. Neste estudo, dois protocolos são propostos para testar a preferência alimentar das larvas e a preferência do local de oviposição das fêmeas, considerando dois fatores que interagem: tipo de substrato da carne e temperatura. Os dispositivos aqui apresentados permitiram testar larvas e fêmeas grávidas de Lucilia cuprina em um ensaio de quatro escolhas com duas temperaturas (33 ± 2 °C e 25 ± 2 °C) e dois tipos de substratos cárneos (carne fresca suplementada com sangue e carne podre de 5 dias de idade). Larvas ou fêmeas grávidas podem optar por escavar ou colocar seus ovos, respectivamente, em qualquer um dos seguintes: carne podre a 25 °C (simulando uma condição de espécie necrófaga), carne fresca suplementada com sangue a 33 °C (simulando uma condição de espécie parasita) e dois controles, carne podre a 33 °C ou carne fresca suplementada com sangue a 25 °C. A preferência é avaliada contando-se o número de larvas ou ovos postos em cada opção para cada repetição. A comparação dos resultados observados com uma distribuição aleatória permitiu estimar a significância estatística da preferência. Os resultados indicaram que as larvas de L. cuprina têm forte preferência pelo substrato podre a 25 °C. Por outro lado, a preferência pelo local de oviposição pelas fêmeas foi mais variada para o tipo de carne. Esta metodologia pode ser adaptada para testar a preferência de outras espécies de insetos de tamanho semelhante. Outras questões também podem ser exploradas usando condições alternativas.

Introduction

As moscas, particularmente os muscóides caliptratos (incluindo moscas-varejeiras, moscas domésticas, moscas-bot e moscas-da-carne, entre outros), exibem uma ampla gama de estilos de vida, englobando comportamentos parasitários e necrossaprófagos¹. As espécies parasitárias tipicamente causam miíase, uma infestação de tecidos vivos por larvas (larvas)². Na família Calliphoridae, tanto as espécies parasitárias obrigatórias quanto as facultativas são as principais pragas pecuárias responsáveis por perdas econômicas e precários de bem-estar animal devido às infestações de larvas 2,3,4,5,6,7. Parasitas obrigatórios, como as bicheiras do Novo Mundo e do Velho Mundo (Cochliomyia hominivorax e Chrysomyia bezziana, respectivamente), são especialmente problemáticos4,7,8,9,10 juntamente com parasitas facultativos, como as moscas-varejeiras (Lucilia cuprina e Lucilia sericata)2,5,6^{, 7º}. Espécies não parasitárias, incluindo as sapronecrófagas, desenvolvem-se em matéria orgânica em decomposição e necrótica e são comumente encontradas em ambientes insalubres. Seu estilo de vida estritamente não parasitário pode ser usado com sucesso para a terapia de larvas, que usa larvas de moscas para limpar feridas de tecidos necróticos^11,12,13. As moscas-varejeiras também são utilizadas na ciência forense, pois estão entre os primeiros organismos a localizar e colonizar corpos recentemente falecidos, sendo que as larvas em desenvolvimento servem como meio de estimar o tempo da morte¹⁴.

O estilo de vida da mosca-varejeira tem sido objeto de várias pesquisas (e.g.^,15,16,17,18,19,20,21) devido à sua importância em relação aos interesses humanos. A compreensão dos mecanismos biológicos que regem o estilo de vida de uma espécie pode fornecer informações valiosas para melhorar os métodos destinados ao controle de espécies-praga. Além disso, a diversidade e a evolução dos estilos de vida das moscas-varejeiras oferecem um contexto ideal para estudar as origens e os mecanismos de características complexas (por exemplo, parasitismo). O parasitismo devido às larvas que se alimentam de tecidos vivos evoluiu independentemente várias vezes dentro da família Calliphoridae^22,23. No entanto, a história evolutiva dos hábitos alimentares das moscas-varejeiras ainda é pouco conhecida, com estudos restritos ao mapeamento dos hábitos ao longo de filogenias (e.g.^,16,19,22) sem o auxílio de ensaios funcionais. Por exemplo, é incerto se os parasitas obrigatórios evoluíram de generalistas (isto é, parasitas facultativos) ou diretamente de espécies necrófagas. Os processos moleculares, fisiológicos e comportamentais que acompanham as mudanças evolutivas no estilo de vida também são amplamente desconhecidos.

Nesse contexto, parasitas facultativos, como a mosca-varejeira Lucilia cuprina, que podem se desenvolver como parasitas em um hospedeiro ou como necrófagos em cadáveres, oferecem a possibilidade de explorar os fatores e mecanismos que controlam as escolhas de estilo de vida. Lucilia cuprina é uma espécie cosmopolita conhecida por causar moscas de ovelhas, especialmente na Austrália, onde é considerada uma praga ^3,16. A miíase por L. cuprina também pode ocorrer em outros animais de criação, animais de estimação e humanos 3,24,25,26,27,28,29,30. No entanto, suas larvas também podem se desenvolver em tecidos necróticos e matéria em decomposição e esta espécie tem sido usada com sucesso em entomologia forense por ser muito rápida para localizar e colonizar cadáveres^31,32,33,34. Embora o estilo de vida parasitário versus não parasitário das moscas-varejeiras seja definido pelo estágio larval, é a fêmea adulta que seleciona o local de oviposição. Consequentemente, a fêmea adulta influencia fortemente o estilo de vida das larvas, uma vez que estas têm mobilidade limitada. No entanto, a escolha da fêmea não implica necessariamente que as larvas prefiram o mesmo substrato quando apresentadas com uma escolha³⁵. Uma hipótese é que mudanças comportamentais que levam as fêmeas a colocar seus ovos em tecidos vivos poderiam ter sido parte de uma mudança precoce para um estilo de vida parasitário. Pré-adaptações ou capacidades fisiológicas das larvas resultantes teriam sido essenciais para o seu desenvolvimento bem-sucedido no tecido vivo, levando ao surgimento do estilo de vida parasitário. Como tal, os processos afetados e selecionados podem não necessariamente se alinhar entre as duas fases da vida.

Neste contexto, dois métodos foram desenvolvidos para testar a preferência comportamental em moscas-varejeiras, em particular, para L. cuprina, em relação ao substrato alimentar larval (ensaio de preferência larval) e ao local de oviposição (ensaio de preferência de fêmeas). Esses métodos levam em conta dois fatores que interagem: temperatura e frescor da carne. A temperatura foi escolhida como fator crucial, uma vez que a maioria dos casos de miíase ocorre em animais^{homeotérmicos2}. Assim, uma temperatura de 33 °C foi selecionada como proxy para o “fator de estilo de vida parasitário”, enquanto uma temperatura de 25 °C (temperatura ambiente) representa o “fator não parasitário”. A temperatura de 25 °C foi escolhida por ser representativa da temperatura média anual registrada no Brasil (Instituto Nacional de Meteorologia, INMET). Adicionalmente, dois tipos de substratos cárneos foram considerados, ambos de origem bovina: (i) carne fresca suplementada com sangue, mimetizando o substrato para o estilo de vida parasitário, que é utilizado para criar a mosca-varejeira parasita Co. hominivorax em condições de laboratório³⁶, e (ii) carne podre de 5 dias de idade, emulando o substrato para o estilo de vida necrófago. O substrato bovino é comumente utilizado para criar L. cuprina em condições de laboratório^27,37,38,39 por oferecer diversas vantagens em termos de disponibilidade, custo-benefício e praticidade^, além de ser um substrato ecologicamente justificável. Outros estudos^40,41 comparando o efeito de substratos podres versus frescos em moscas-varejeiras utilizaram substrato podre com 7 dias de idade (em condições anaeróbias) e mostraram um efeito adverso do substrato podre sobre as taxas de desenvolvimento^, sobrevivência e crescimento. Como L. cuprina é conhecida por colonizar cadáveres frescos que geralmente são expostos ao ar, resolvemos usar carne podre de 5 dias de idade (carne moída) em vasos não herméticos (decomposição aeróbia e anaeróbia) para mimetizar um substrato necrófago.

Os desenhos experimentais aqui apresentados oferecem a vantagem de discernir preferências por fatores individuais, bem como seus efeitos combinados. Além disso, os fenótipos pontuados, a saber, a escolha do substrato alimentar larval e o número de ovos colocados, são diretamente relevantes para os aspectos biológicos e ecológicos das espécies de moscas-varejeiras. A adequação desses protocolos é destacada pela demonstração de sua eficácia em L. cuprina. Adicionalmente, é fornecido um roteiro de análise estatística, que pode ser utilizado para comparar os resultados observados obtidos em L. cuprina com dados aleatórios simulados, garantindo análises e interpretações estatísticas robustas.

Protocol

As amostras de moscas foram obtidas utilizando-se armadilhas e não em animais infestados. Uma licença SISBIO (67867-1) foi emitida para coletar e manter moscas da família Calliphoridae em cativeiro em condições de laboratório. Amostras de insetos são isentas de avaliação ética em pesquisas no Brasil. Carne e sangue bovinos foram obtidos comercialmente, e nenhuma autorização ética foi necessária. 1. Preferência alimentar das larvas Preparo das placas de…

Representative Results

Para demonstrar a eficácia dos métodos apresentados, os experimentos foram conduzidos utilizando uma população de laboratório de Lucilia cuprina (família: Calliphoridae), uma mosca-varejeira parasita facultativa2. Todo o conjunto de dados brutos obtidos para esta espécie pode ser encontrado no Arquivo Suplementar S3 com os resultados para os testes de preferência larval e fêmea de substrato. Para avaliar se as larvas e fêmeas apresentam preferência por algum su…

Discussion

A compreensão da evolução dos hábitos alimentares, particularmente no contexto do parasitismo em moscas-varejeiras, requer o exame das preferências de substrato ao longo de diferentes fases da vida para alimentação ou oviposição. Portanto, neste estudo, métodos robustos e diretos foram propostos para investigar preferências de substrato em larvas e fêmeas de moscas-varejeiras. Esses métodos foram testados em Lucilia cuprina, uma mosca varejeira parasita facultativa². Curiosam…

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	05038-500G	For microbiology
Black cardboards	–	–	70×50 cm
Bovine blood with anticoagulat	–	–	50% pure bovine blood with anticoagulant (3.8% sodium citrate) + 50% of filtered water
Bovine ground Meat	–	–	Around 7-8% of fat
Brush	–	–	Made with plastic
Conical tube	Falcon or Generic	–	50 mL
Cross-shaped glass containers	Handmade	NA	48×48 cm, 8 cm of height and 8 cm of width
Erlenmeyer	Vidrolabor	NA	500 mL
70% Ethanol	Synth	A1084.01.BL	70% ethyl ethanol absolute + 30% filtered water
Graduated cylinder	Nalgon or Generic	–	500 mL and 50 mL
Heating pad	Thermolux	–	30×40 cm dimensions, 40 W, 127 V
Infrared thermometer	HeTaiDa	HTD8808	Non-contact body thermometer (Sample Rate: 0.5 S, Accuracy: ±0.2 °C, Measuring: 5-15 cm)
Petri dish (Glass)	Precision	NA	150×20 mm dimensions
			(Note: the petri dishes can be plastic if used only once)
Petri dish PS	Cralplast	18130	60×15 mm dimensions
Plastic Pasteur pipette	–	–	3 mL (total volume)
Sodium citrate	Synth	C11033.01.AG	3.8% Sodium citrate (38 g diluted in 1L of filtered water)
Spoons	–	–	More than one spoon is necessary. Use one for each type of meat substrate. Preferably stainless steel.
Stainless steel spatula	Generic	–	Flat end and spoon end
Stereomicroscope	Bioptika	–	WF10X/22 lenses
Tweezer	–	–	Metal made and fine point
White led light strips	NA	NA	4.8 W, 2×0.05 mm², 320 lumens, Color temperature:6500 K (white)