Summary
ここでは、凍結保存された全血サンプルでの細胞質分裂ブロック小核アッセイに最適化されたプロトコルを紹介します。小核分析のために全血を凍結保存するこの最適化された方法は、大規模なサンプリングおよび多施設研究のための信頼できる技術であり、他の血液関連アッセイにも使用できます。
Abstract
in vitro細胞質分裂ブロック小核(CBMN)アッセイは、放射線生物学研究、生物学的線量測定、遺伝毒性試験、およびin vitro放射線感受性試験で広く使用されている技術です。この細胞遺伝学的方法は、細胞分裂中に遅れた染色体断片に起因する二核細胞の小核の検出に基づいています。新鮮な全血サンプルは、CBMNアッセイに最も好まれるサンプルタイプです。しかし、新鮮な血液サンプルを扱うことの欠点は、採血後すぐに処理できることと、追加の採血なしで実行できる繰り返し分析の数が限られていることです。
新鮮な血液サンプルの必要性はロジスティック的に困難な場合があるため、凍結保存された全血サンプルのCBMNアッセイは、特に大規模な患者研究において大きな利点となります。この論文では、全血サンプルを凍結し、これらの凍結血液サンプルに対してCBMNアッセイを実行するプロトコルについて説明します。健康なボランティアからの血液サンプルは、さまざまな時点で凍結および融解され、その後、修正された小核アッセイプロトコルにかけられます。この結果は、この最適化された手順により、凍結血液サンプルに対するCBMNアッセイの実施が可能になることを示しています。記載された凍結保存プロトコルは、他の細胞遺伝学的アッセイおよび増殖リンパ球を必要とする種々の機能的アッセイにも非常に有用であり得る。
Introduction
電離放射線(IR)は、その発見以来、生物への悪影響から研究者の間で議論されてきました。有害な影響は通常、二本鎖切断(DSB)などのDNA損傷によって現れ、これらのDSBの修復に失敗すると、がんの重要な特徴である染色体異常や突然変異につながります1,2。このような染色体異常は、細胞質分裂ブロック小核(CBMN)アッセイなどの細胞原性アッセイによって調べることができる。小核は、娘核に取り込むことができない遅行染色体断片であるため、有糸分裂中に取り残されます。
CBMNは、in vivoまたはin vitro電離放射線に曝露された個人の染色体損傷を評価するために一般的に使用される信頼性の高い細胞遺伝学的手法です。新鮮な全血または単離された末梢血単核細胞(PBMC)のいずれかをCBMNアッセイに使用できます。PBMCの単離と処理には時間がかかり、細胞の生存と増殖の支持媒体として機能する血清血漿の損失を伴うため、新鮮な全血が主に選択される生物学的材料です。良好な二核細胞収量を達成するには、採取後すぐに新鮮な全血を処理する必要があります。ただし、即時処理の必要性は、時間的制約の下でロジスティック的に困難な場合があります。さらに、多くのサンプルを長期間にわたって取得したり、処理センターから離れた場所で収集したりすることが想定される場合、新鮮な血液サンプルの保管が制限要因になる可能性があります3,4。
さらに、同じ個人/患者でMN分析を繰り返すことができるようにするには、血液サンプルの凍結が有益です。CBMNアッセイを後で使用するためにリンパ球を保存する方法の1つは、単離されたPBMCを凍結することです5,6。ただし、この手法では、PBMC を凍結する前にいくつかの処理手順が必要です。したがって、全血の凍結保存は、単離されたPBMCの凍結保存に代わるシンプルで時間効率の高い代替手段となります。 細胞遺伝学的アッセイまたはリンパ球の増殖を必要とするアッセイのための凍結全血の使用に関する情報はほとんどありません。凍結保存された全血を中期解析に用いたことを報告している論文は1編のみである7。
全血の凍結保存は、バイオモニタリング、生体線量測定、放射線感受性評価の分野で多くの利点をもたらすため、私たちのグループは、CBMNアッセイの適用を可能にする全血の凍結保存プロトコルを最適化しました8。凍結保存された全血培養に存在するリンパ球は、ゲノムの完全性と増殖能力を少なくとも1年間保持することを実証しました。この方法論文では、Beylsらによって最適化された凍結保存手順とCBMNアッセイプロトコルについて詳細に説明し8、30人の健康な個人の凍結血液サンプルについて得られた結果を報告します。CBMNアッセイでは、凍結保存された全血サンプルのリンパ球におけるMN応答を評価するために、血液培養物に0.5、1、および2Gyの線量をin vitro で照射しました。
Protocol
この研究では、17歳から65歳までの30人の健康なドナーから静脈穿刺によって血液サンプルが採取されました。20人のドナーからのMNデータは、Beylsらの論文から再利用されました8血液 サンプルの収集は、ベルギーのゲント大学病院の倫理委員会(登録番号:2019/1565)のガイドラインに従っています。すべての参加者から書面によるインフォームドコンセントが得られました。このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬に関連する詳細については、 材料表 を参照してください。
1.血液サンプルの採取
- 開始する前に、参加者の書面によるインフォームドコンセントが利用可能であり、倫理ガイドラインが適切に守られていることを確認してください。
- 血液をLi-ヘパリンチューブに採取し、凍結保存用の処理の準備が整うまで室温で保存します。
2.全血の凍結保存
注:細胞回収までのすべてのステップは、滅菌層流中で無菌的に行われます。
- 1 mLの血液を凍結保存するには、800 μLのウシ胎児血清(FCS)と200 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を混合して、1 mLの凍結培地を作ります。
注:凍結培地は、凍結する必要がある血液サンプルに等しい量で調製されます。 - 全血の凍結保存には、血液サンプルをヘパリン処理チューブから15mLまたは50mLの遠心分離チューブに移します
注意: チューブの容量は血液の量によって異なります。 - 同量の凍結培地を連続的ではあるが 滴下して 、低速で血液を渦巻きさせます。
- 2 mL の血液凍結混合物をクライオバイアル (2 mL) に移し、各アリコートに 1 mL の血液サンプルと 1 mL の凍結混合物を混合します。
- 段階的な段階的凍結
- クライオバイアルをイソプロパノールの入ったクライオボックスに移し、冷凍庫(-80°C)で一晩置きます。
- クライオバイアルを液体窒素に移し、長期間使用してください。
3. 凍結保存血液の融解
注:解凍プロセスの合計時間を制限するには、一度に最大8つのクライオバイアル(各2 mL)を処理する必要があります。
- 準備
- 血液を解凍する前に、200 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を37°Cに予温します。
- 無菌条件下で必要な培地の作業溶液を調製します。培養あたりの培地には、ペニシリン/ストレプトマイシン(0.5%)、0.2 mL の FCS、20 μL のピルビン酸ナトリウム、2 μL の β-メルカプトエタノールを添加した Rosewell Park Memorial Institute(RPMI)培地)が 1.6 mL の完全培地が含まれていることを確認します。
注:解凍中にかなりの数の血球が失われる可能性があるため、融解した血液は、総容量2 mLの24ウェルプレートなどの小さなウェルで培養されます。1回の投与につき1枚のマルチウェルプレートを使用します。 - 各培養ウェルについて、以下に提案されているように、ドナーコードとA/Bを日付と用量とともに蓋に示します(図1)。
図1:小核アッセイのために全血を培養するための24ウェルプレートの推奨レイアウト。 ウェルに印を付け、蓋の適切な場所にドナーコードを示します。各患者サンプルについて、重複するウェルは互いに隣接している必要があります。これは 10 x 10 コリメータの推奨レイアウトであり、コリメータまたはサンプルのサイズに応じて変更できることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
- 全血の解凍と培養の手順
- ウォーターバスを37°Cに温めます。
- 液体窒素から必要なクライオバイアルを取り出します(数は投与回数などの要件によって異なります)。
注:1つのクライオバイアルには、1 mLの血液と1 mLの凍結培地が含まれています。したがって、1つのクライオバイアルからの血液で2つの培養をセットアップできます。 - 温水浴でクライオバイアルを部分的に解凍します(小さな氷の結晶が見られるまで)。
- 水浴からバイアルを取り出し、バイアルの外側を滅菌ティッシュペーパーで洗浄します。
- 滅菌層流フードでは、チューブ内に形成された気泡がこぼれないように、バイアルを非常にゆっくりと開きます。
- 各バイアルの内容物を再懸濁し、個別に15 mLのコニカル遠心チューブ(バイアルあたり1チューブ)に移します。
- それぞれのチューブに、チューブを静かに旋回させながら、1 mLの温かい(37°C)PBSを滴下します。P1000ピペットで再懸濁します。
- 希釈して均一に洗浄するには、予熱したPBS(37°C)を7 mL滴下し、P1000ピペットで再懸濁します。
- 室温で180 × g ( 加速度1、ブレーキ1で設定)で8分間血液を遠心分離します。
- この待機ステップでは、空のウェル(細胞を培養するウェル以外)に500 μLのPBSを充填します。
- ウェルプレートをインキュベーターに戻し、予熱します。
- 遠心分離が完了したら、細胞ペレットを乱さないように約1 mLを残して上清を慎重に除去します。
- 残りの上清にペレットをP1000ピペットで再懸濁します。
- 8 mLの温かいPBS(37°C)を各チューブに滴下し、チューブを静かに旋回させます。その後、P1000ピペットで再懸濁します。
- 再懸濁した血液を180 × g で8分間遠心分離します( 加速度9、ブレーキ9で設定)。
- この待機ステップ中に、200 μLの培地をマークされた各ウェルに移します。
- プレートをインキュベーターに戻し、37°Cのままにします。
- 遠心分離後、上清を連続的に除去しますが(緩い細胞ペレットを乱さないようにするため)、約80 μLの上清を残します。
- ペレットに280μLのFCS(室温)を加え、再懸濁します(総量360μLになる)。
- 180 μLの細胞懸濁液を各ウェルに移し、再懸濁します(=0.5 mLの「血液」/培養液)。各ウェルの総容量は 380 μL になり、2 mm の中層になります。
- 照射前に、37°CのCO2 インキュベーターで少なくとも10分間プレートをインキュベートします。
4. G0 MNアッセイ
- インキュベーターからプレートを取り出し、室温で0.5、1、2GyのX線(220kV、13mA、0.15mmCu)などの必要線量を細胞培養物に照射します。偽照射サンプルをコントロールとして使用して、自発的な MN 収量を同定します。
- 照射後すぐに、各ウェルに培地(37°C)1.62mLを添加します。
- Tリンパ球の細胞分裂を刺激するには、各ウェルに40 μLのフィトヘマグルチニン(PHA)を添加し、完全に再懸濁します。
- これらのプレートをインキュベーター(5%CO2、37°C)に戻します。
注:これはアッセイ の開始時間 になります。 - ウェルあたり8 μLのサイトカラシンB(6 μg/mL)を添加して、刺激の23時間後に細胞質分裂をブロックし、適切に再懸濁します。
- 刺激/培養時間の70時間後に細胞培養を回収します。細胞を再懸濁し、15 mLチューブに移します。各ウェルを 2 mL の PBS で洗浄し、この PBS をそれぞれの 15 mL チューブに加えます。
- チューブを室温で180 × gで8分間遠心分離します。
- 上清を捨てますが、ペレットの上に約500μLを残します。
- ペレットを(フルスピードで)ボルテックスし、ボルテックスしながら、2 mLの冷たい塩化カリウム(KCl、4°C)をゆっくりと滴下します。
- 直ちに細胞を180 × g で8分間遠心分離します。
- 上澄み液を廃棄し、約500μLの上清を残します。
- ペレットを(フルスピードで)ボルテックスし、ボルテックスしながら、2 mLの低温 固定液1 (メタノール/酢酸/リンゲル溶液を4:1:5の比率で)ゆっくりと滴下します。
- サンプルチューブを4°Cで一晩放置します(最小12時間、最大96時間)。
- 180 × gで8分間遠心分離します。
- 上澄みを捨てます。
- ペレットを(フルスピードで)ボルテックスし、ボルテックスしながら、2 mLの低温 固定液2 (メタノール/酢酸を4:1の比率で)をゆっくりと滴下します。
- 180 × gで8分間遠心分離します。
- 上澄みを捨てます。
- ペレットを(フルスピードで)ボルテックスし、ボルテックスしながら、2 mLの低温 固定液2 をペレットにゆっくりと(滴下して)加えます。
- サンプルチューブは4°C(最小12時間、最大96時間)に置いておきます。
- スライドをイソプロパノールで洗浄し、適切にラベル付けします。
注意: マーカーインクは処理中に簡単に拭き取ることができるため、印刷されたステッカーを使用してラベルを付けます。 - サンプルチューブを180 × gで8分間遠心分離します。
- 上清を別のチューブに移し、ペレットのサイズに合わせて細胞を濃縮します。
- ペレットをボルテックスします。
- 固定細胞40 μLを乾いた清潔なスライドに滴下します。
- スライドを室温で乾燥させます。スライドは箱に保管するか、すぐに染色して観察してください。
5. アクリジンオレンジ(AO)染色
- スライドをAO染色液に1分間浸し、続いて蒸留水で素早く洗浄し、次にスライドをリン酸緩衝液(pH 6.8)に1分間入れます。
- 緩衝液からスライドを取り出し、清潔なティッシュペーパーでスライドの裏側を乾かし、清潔なティッシュペーパーの上にスライドを置きます。
- 20 μLのリン酸緩衝液をスライドの上に落とし、気泡を避けながら清潔なカバーガラスでそっと覆います。
- これらのスライドをシリコーンセメントで密封します。
注:AOは感光性があり、時間の経過とともに退色するため、良好なコントラストと蛍光のために、染色後5日以内にスライドのスコアリングを行うことをお勧めします。スライドを検査しないときは、必ず冷蔵室(4°C)に保管してください。
6. 染色されたスライドの採点
- スライドを蛍光顕微鏡の下に置き、1,000個の二核細胞(BN)を調べます。毒性の6つのバイオマーカーの1つであるMNを手動でカウントします。そのためには、2人の独立したスコアラーに、同じ倍率で500個のBN細胞/スライドを調べてもらいます。
注:以下は、染色されたスライド9を採点するためにFenechが推奨する採点基準のいくつかのハイライトです- ほぼ同じサイズ、規則的な形状、染色パターンの2つのよく区別された核を持つ、無傷の細胞質を持つきれいに丸みを帯びた細胞を探して、BN細胞を選択します。BN細胞の細胞質が隣接する細胞の細胞質と区別できることを確認してください。
- MNをスコアリングし、形態学的に主核と同じであるが、主核よりも小さいことに注意します。最大のMNでさえ、主核の直径の1/3を超えることはできません。MNは、主核に触れていないか、少なくとも微小核の境界が主核の境界と区別できる場合にのみスコアリングします。
Representative Results
プロトコルの再現性を検証するために、17歳から65歳までの30人の健康なボランティアの凍結保存血液サンプルでMNアッセイを実施しました。グループの平均年齢は35歳です。凍結保存期間は1週間から154週間であった。培養した全血細胞を異なる放射線量(0.5、1、2Gy)に曝露した後、1,000個のBN細胞の小核収量を顕微鏡で調べました。きれいに丸みを帯びた二核細胞( 図2に見られるように)は、凍結保存された全血サンプルから健康な生細胞の回収に成功したことを示しています。注目すべきは、リンパ球の放射線応答が、超低温(液体窒素)での長期保存後も安定していたことです。この観察結果は、新鮮な血液サンプルから予想される反応と一致しています。
図2:1年前に凍結保存した凍結全血サンプルから回収した二核細胞で観察された小核。 (A)倍率200倍、(B)倍率400倍;MNを指す矢印。 スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
放射線量の増加(0.5、1、2Gy)により、小核収量の線形二次増加が観察された(表1 および 図3)。偽照射対照試料(0 Gy)のMN収量は、主に染色体の遅れの結果であるバックグラウンドMN収量を表しています。
| 線量(Gy) | 0 | 0.5 | 1 | 2 |
| 平均 | 18 | 107 | 247 | 601 |
| SDの | 10.8 | 23.9 | 53.3 | 101.1 |
| CV(%) | 59.9 | 22.3 | 21.6 | 16.8 |
| 範囲 | 5-41 | 62-140 | 139-324 | 395-755 |
表1:30人の健康なドナーの凍結保存された全血サンプルで観察された、個人間の変動性を示す、変動の範囲と係数、および平均MN収量。 略語:CV =変動係数。SD = 標準偏差。
図3:30人のドナーのコントロールおよび照射凍結保存された全血サンプルで観察された小核収量。 凍結保存期間は1週間から154週間であった。散布図は個々の値を示します。クラスター内の線は、グループの平均±標準偏差を表します。略語:MN =小核;BN = 二核。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
人のMN収量の個人間変動を調査するために、変動係数(CV)を計算しました( 表1を参照)。放射線誘発MNでは、すべての線量(0.5、1、2Gy)で25%
Discussion
CBMNアッセイを適用するための修正されたプロトコルは、血液サンプルを大量に保存するための比較的簡単で便利な方法です。この手順では、凍結保存とCBMNアッセイ中に注意する必要があるすべての詳細を概説します。他のラボプロトコルでは通常、凍結混合物に10%のDMSOを使用しますが、当社の凍結混合物には20%のDMSOと80%のFCS7が含まれています。この凍結混合物を全血サンプルに等量添加すると、最終濃度も10%DMSOになります。細胞の生存率を向上させ、細胞分裂を刺激するために、1%ピルビン酸ナトリウムと0.1%β-メルカプトエタノールを完全培養培地(cRPMI)に添加します。これは、私たちの研究グループ6,8によって確立された細胞培養プロトコルに従っています。
このプロトコルでは、融解中の細胞凝集の問題を完全に解決することはできませんでしたが、細胞分離は他の従来のプロトコルよりも優れていました。融解後の細胞を回収するために培地を一貫して急激に添加する代わりに、予熱したPBS(37°C)を洗浄ステップ中に滴下すると、より良い結果が得られました。この改善は、細胞ストレスの軽減に役立ち、細胞の高い回収率で凝集を最小限に抑えます。さらに、PBSをRPMI上で使用した場合、細胞生存率に明確な差は観察されませんでした。凍結保存期間の長さ(最大1年)は、照射されたサンプルと照射されていないサンプルの両方で、MN収量に影響を与えないことがグループによって検証されています6,8。研究によると、低温(液体窒素)で徐々に凍結し、その後、融解しながら予熱した培地を徐々に添加することで、良好な細胞生存率とPBMCの増殖を達成できることが示唆されています10,11。研究者らは、融解した全血中のTリンパ球の亜集団が、融解したPBMCで観察されたものに匹敵することを示しました12。さらに、凍結保存された全血サンプルから回収された細胞サブタイプは、新鮮な全血サンプルで観察されたものと類似していることが証明されています13,14。
報告書で得られた指標となる結果を調べると、線量による線形二次増加(図3)は、線形エネルギー移動(LET)による小核に関する他の文献報告と一致していることがわかります15,16。凍結保存された全血サンプル(表1)で観察されたMN収量の変動は、新鮮な全血培養で報告されたものとの範囲内です8,17,18。ここで詳細に説明されているプロトコルは、20人の健康なボランティアの新鮮で凍結保存された全血で検証されました8。その報告書8で観察された細胞増殖の重要なパラメータである核分裂指数(NDI)は、新鮮な全血について示唆されているものと一致していました19,20。まとめると、全血の凍結保存と修正小核アッセイのこの最適化されたプロトコルは、より良い細胞収量を提供するため、このプロトコルの適応は放射線感受性評価に推奨されます。プロトコルの再現性はすでに検証されているため8、大規模および多施設研究への適用性が示唆されています。
Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
著者らは、技術サポートをしてくれた L. Pieters、T. Thiron、G. De Smet に感謝します。この研究のために献血してくださったボランティアの皆さんに感謝します。この研究は、グラント(T000118N)の下でフランダース研究財団(FWO)によって財政的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Greiner | 188271 | |
| 24-well cell suspension plate | VWR | 734-2779 | |
| 96% alcohol | ChemLab | CL00.1807.2500 | |
| Acetic acid | Merck life science | 8,18,75,52,500 | |
| Acridine orange | Merck life science | 235474-5g | |
| CaCl2 | Merck life science | C5670-100g | |
| cover slips | VWR | 631-1365 | 22 x 50 |
| Cryobox (Mr.Frosty) | Nalgene, Sigma Aldrich | ||
| Cryovials 2ml | Novolab | A04573 | |
| Cytochalsin B | Merck life science | C6762-10 | 10 mg |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Merck life science | D4540-500ml | |
| Fetal calf serum (FCS) | Thermo Fischer scientific | 10270-106 | |
| Fixative 1 | Methanol/acetic acid/ringer in a ratio of 4:1:5 | ||
| Fixative 2 | Methanol/acetic acid in a ratio of 4:1 | ||
| GURR buffer | Thermo Fischer scientific | 10582013 | phosphate buffer (pH 6.8) |
| KCl | Merck life science | 1,04,93,60,250 | 75 mM |
| KH2PO4 | Merck life science | 1,04,87,30,250 | |
| Li-heparin tubes | BD Life sciences | 367526-LH170 I.U. | BD Vacutainer |
| Methanol | fisher scinetific | M/4000/17 | |
| Na2HPO2 | Merck life science | 10,65,80,500 | |
| NaCl | Merck life science | S7653-1kg | |
| Object slides | VWR | MENZAA00000112E04 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fischer scientific | 15140-122 | 10,000 U/mL + 10,000 µg/mL |
| Phytohemagglutinin (PHA-M) | Thermo Fischer scientific | 10576-015 | |
| Ringer solution | contains NaCl, KCl, CaCl2 dissolved in distilled water | ||
| RPMI-1640 | Thermo Fischer scientific | 52400041 | |
| Silicon rubber adhesive sealent | collall | CF-100 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fischer scientific | 11360039 | |
| Sterile warm PBS (37 °C) | contains NaCl, Na2HPO2, KH2PO4 dissolved in distilled water | ||
| β-mercaptoethanol | Thermo Fischer scientific | 31350-010 |
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