Summary

מודל חולף של חסימת עורק מוחי אמצעי חולף

Published: August 11, 2023
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר את המודל של איסכמיה מוחית מוקדית חולפת בעכברים באמצעות חסימה תוך לומינלית של עורק המוח האמצעי. בנוסף, דוגמאות להערכת תוצאות מוצגות באמצעות הדמיית תהודה מגנטית ומבחני התנהגות.

Abstract

שבץ עומד כגורם עיקרי למוות או נכות כרונית ברחבי העולם. עם זאת, הטיפולים האופטימליים הקיימים מוגבלים לטיפולי רפרפוזיה בשלב החריף של שבץ איסכמי. כדי לקבל תובנות על הפיזיופתולוגיה של שבץ מוחי ולפתח גישות טיפוליות חדשניות, מודלים של מכרסמים in vivo של שבץ ממלאים תפקיד בסיסי. זמינותם של בעלי חיים מהונדסים גנטית הניעה במיוחד את השימוש בעכברים כמודלים ניסיוניים לשבץ.

בחולי שבץ, חסימה של עורק המוח האמצעי (MCA) היא תופעה שכיחה. כתוצאה מכך, המודל הניסיוני הנפוץ ביותר כולל חסימה תוך לומינלית של MCA, טכניקה זעיר פולשנית שאינה דורשת כריתת גולגולת. הליך זה כולל החדרת מונופילמנט דרך עורק התרדמה החיצוני (ECA) וקידומו דרך עורק התרדמה הפנימי (ICA) עד שהוא מגיע לנקודת ההסתעפות של MCA. לאחר חסימת עורקים של 45 דקות, המונופילמנט מוסר כדי לאפשר רפרפוזיה. לאורך כל התהליך, זרימת הדם במוח מנוטרת כדי לאשר את ההפחתה במהלך חסימה ולאחר מכן התאוששות עם זילוח. תוצאות נוירולוגיות ורקמות מוערכות באמצעות בדיקות התנהגותיות ומחקרי דימות תהודה מגנטית (MRI).

Introduction

שבץ מוחי הוא מחלה הרסנית המשפיעה על כ -15 מיליון אנשים ברחבי העולם מדי שנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. כשליש מהחולים נכנעים למצב, ושליש נוסף חווים נכות לצמיתות. שבץ מוחי הוא פתולוגיה מורכבת המערבת סוגי תאים שונים, כגון תאי חיסון עצביים והיקפיים, כלי דם ותגובות מערכתיות1. הרשת המורכבת של תגובות המופעלות על ידי שבץ ברמת המערכות אינה ניתנת כיום לשכפול באמצעות מודלים במבחנה . לפיכך, מודלים ניסיוניים של בעלי חיים חיוניים כדי להתעמק במנגנוני המחלה ולפתח ולבחון טיפולים חדשים. נכון לעכשיו, פרפוזיה מוקדמת של רקמות היא ההתערבות המאושרת היחידה, או באמצעות פקקת עם מפעיל פלסמינוגן מסוג רקמה (tPA) או טרומבקטומיה אנדווסקולרית1.

חסימות של עורק המוח האמצעי (MCA) שכיחות בחולי שבץ. כתוצאה מכך, מודלים של מכרסמים של חסימת MCA חולפת (tMCAo) פותחו בתחילה בחולדות 2,3,4. כיום, עכברים מהונדסים גנטית הם בעלי החיים הנפוצים ביותר במודלים ניסיוניים של שבץ. במחקר זה אנו מתארים מודל זעיר פולשני של tMCAo תוך לומינלי בעכברים. הגישה מתבצעת דרך עורק התרדמה בגובה הצוואר, ללא כריתת גולגולת.

משך תקופת החסימה הוא גורם קריטי הקובע את היקף הנגע האיסכמי. אפילו חסימות קצרות של 10 דקות יכולות לגרום למוות עצבי סלקטיבי ללא אוטם נראה לעין, בעוד שחסימות ארוכות יותר, הנמשכות בדרך כלל 30 עד 60 דקות, גורמות למידה מסוימת של אוטם מוחי. שלא כמו הענפים הפרוקסימליים והדיסטליים של ה-MCA המספקים את קליפת המוח ויש להם בטחונות, העורקים הלנטיקולו-סטריאטליים המספקים דם לסטריאטום חסרים בטחונות5. כתוצאה מכך, יש ירידה גדולה יותר בזרימת הדם בסטריאטום מאשר בקליפת המוח לאחר tMCAo. לפיכך, חסימות של 30 דקות או פחות משפיעות בדרך כלל על הסטריאטום אך לא על קליפת המוח, בעוד שחסימות ארוכות יותר, מ-45 דקות ואילך, יוצרות לעתים קרובות נגע איסכמי בכל טריטוריית MCA, כולל הסטריאטום וקליפת המוח הגבית-צדית.

כדי להבטיח את רווחתם של העכברים, אנו מנהלים משככי כאבים לפני ההליך ומשתמשים בהרדמה במהלך הניתוח. עם זאת, הרדמה יכולה להציג שינויים מלאכותיים בפיזיולוגיה של העכבר ולהשפיע על כמה מדדי תוצאה6. ההתערבות הכירורגית, כאשר היא מבוצעת על ידי צוות מנוסה, נמשכת בדרך כלל כ -15 דקות להשראת MCAo. לאחר מכן, הזמן הכולל תחת הרדמה תלוי בתקופת החסימה. בניסויים בהם יש חשיבות מכרעת למזעור ההרדמה, שלב חלופי בהליך כרוך בהפסקת ההרדמה במהלך תקופת החסימה והגבלתה רק לשלבים הכירורגיים להחדרה והוצאה של חוט הלהט המסתיר את ה-MCA. גישה זו מפחיתה את משך ההרדמה וממזערת את ההשפעות המלאכותיות האפשריות שלה על מודל הניסוי 7,8. לכן, השיטה של גרימת איסכמיה מוקדית חולפת מוצגת על ידי חסימה intraluminal של MCA עם שתי גרסאות: עם העכבר מורדם במהלך כל תקופת חסימה או עם העכבר ער בתקופה זו. בכל מקרה, יש לבצע ניתוח דמה במקביל להתערבות המתבצעת בעכברים האיסכמיים. בנוסף, נתונים על הערכת תוצאות מסופקים כפי שנמדדו על ידי מבחנים התנהגותיים ו- MRI בנקודות זמן שונות לאחר רפרפוזיה. לבסוף, נדונים הגורמים העיקריים שיש לקחת בחשבון בעת יישום הליך הניסוי.

Protocol

עבודת בעלי חיים נעשתה בעקבות החוקים הקטלאניים והספרדיים (Real Decreto 53/2013) והדירקטיבות האירופיות, באישור הוועדה האתית (Comité Ètic d’Experimentació Animal, CEEA) של אוניברסיטת ברצלונה, וגופי הרגולציה המקומיים של Generalitat de Catalunya. מחקרים מדווחים בהתאם להנחיות ARRIVE . הליך זה מיועד לביצוע בעכברים בוגרים, החל מגיל 8 שבו…

Representative Results

ישנן גישות שונות להערכת התוצאה של הליך tMCAo. שיטות דימות מוחי In vivo (MRI) ובדיקות התנהגותיות משמשות כאן. עכברים מפתחים נגעים איסכמיים במוח, המשפיעים בעיקר על השטח המסופק על ידי MCA ipsilateral לחסימה, כגון הסטריאטום וקליפת המוח הגבית. קיימות מספר שיטות לקביעת היקף הנגע, כולל צביעת ?…

Discussion

הליך tMCAo intraluminal הוא המודל הנפוץ ביותר של איסכמיה מוחית מוקדית עם רפרפוזיה במחקר בסיסי. כיום, עכברים הם המודל המועדף על בעלי חיים בשל זמינותם של זנים מהונדסים גנטית. עם זאת, חיוני להכיר בכך שעכברים מהונדסים גנטית והרקע הגנטי שלהם יכולים להשפיע על כלי הדם במוח. נוכחות של זרימת בטחונות ואנסטומ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי מענק PID2020-113202RB-I00 במימון Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 ו-“European Regional Development Fund (ERDF). דרך לעשות את אירופה”. NCC ו- MAR קיבלו מלגות קדם-דוקטורט (PRE2021-099481 ו- PRE2018-085737, בהתאמה) שמומנו על ידי MCIN/AEI / 10.13039/501100011033 ועל ידי “הקרן החברתית האירופית (ESF) משקיעה בעתיד שלך”. אנו מודים לפרנסיסקה רואיז-חאן וללאונרדו מארקס-קיסינוסקי על תמיכתם הטכנית. אנו מכירים בתמיכת מתקן הדמיית MRI של Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). תוכנית Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) של Generalitat de Catalunya תומכת ב- IDIBAPS.

Materials

6/0 suture  Arago Vascular ligatures
6/0 suture with curved needle Arago Skin sutures
9 mg/mL Saline Fresenius Kabi CN616003 EC For hydration
Anaesthesia system SurgiVet
Blunt retractors, 1 mm wide Fine Science Tools 18200-09
Buprenorfine Buprex For pain relief
Clamp applying forceps Fine Science Tools S&T CAF4
Dumont mini forceps Fine Science Tools M3S 11200-10
Forceps Fine Science Tools 91106-12
Glue Loctite To stick LDF probe to the skull
Grip Strength Meter IITC Life Science Inc. #2200
Isoflurane B-Braun CN571105.8
LDF Perimed Perimed Periflux System 5000
LDF Probe Holders Perimed PH 07-4
Medical tape
MRI magnet Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany BioSpec 70/30 horizontal animal scanner 
Needle Holder with Suture Cutter Fine Science Tools 12002-14
Nylon filament Doccol 701912PK5Re
Recovery cage with heating pad
Sirgical scissors Fine Science Tools 91401-12
Small vessel cauterizer kit Fine Science Tools 18000-00
Stereomicroscope and cold light Leica M60
Suture tying forceps Fine Science Tools 18025-10
Thermostat, rectal probe and mouse pad Letica Science Instruments LE 13206
Vannas spring scissors (4mm cutting edge) Fine Science Tools 15019-10
Vascular clamps Fine Science Tools 00396-01

References

  1. Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
  2. Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
  3. Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
  4. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  5. Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
  6. Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
  7. Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
  8. Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
  9. Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
  10. Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
  11. Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
  12. Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
  13. Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
  14. Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
  15. Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
  16. Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
  17. Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).

Play Video

Cite This Article
Chaparro-Cabanillas, N., Arbaizar-Rovirosa, M., Salas-Perdomo, A., Gallizioli, M., Planas, A. M., Justicia, C. Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Stroke. J. Vis. Exp. (198), e65857, doi:10.3791/65857 (2023).

View Video