Summary

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

Abstract

Bacteriofagen (fagen) zijn virussen die bacteriën infecteren met soort- en stamspecificiteit en zijn de meest voorkomende biologische entiteiten in alle bekende ecosystemen. Binnen bacteriële gemeenschappen, zoals die in de darmmicrobiota, zijn fagen betrokken bij het reguleren van de populatiedynamiek van de microbiota en het stimuleren van bacteriële evolutie. Er is de afgelopen tien jaar hernieuwde belangstelling voor faagonderzoek, deels vanwege de gastheerspecifieke dodingsmogelijkheden van lytische fagen, die een veelbelovend hulpmiddel bieden om de toenemende dreiging van antimicrobieel resistente bacteriën tegen te gaan. Bovendien suggereren recente studies die aantonen dat fagen zich hechten aan darmslijm dat ze een beschermende rol kunnen spelen bij het voorkomen van bacteriële invasie in het onderliggende epitheel. Belangrijk is dat, net als bacteriële microbiomen, verstoorde fageom in verband zijn gebracht met verslechterde resultaten bij ziekten zoals inflammatoire darmaandoeningen. Eerdere studies hebben aangetoond dat fagen het microbioom van dieren en mensen kunnen moduleren door middel van fecale filtraattransplantaties, wat de gezondheid van de gastheer ten goede komt. Met deze recente golf van onderzoek komt de noodzaak om protocollen op te stellen en te standaardiseren voor het bestuderen van fagen in de context van het darmmicrobioom. Dit protocol biedt een reeks procedures om geïsoleerde T4-fagen en hun bacteriële gastheer, Escherichia coli, te bestuderen in de context van het maagdarmkanaal van muizen. De hier beschreven methoden beschrijven hoe te beginnen met een faaglysaat, het aan muizen toe te dienen en de effecten op de niveaus van bacteriële gastheer en fagen te beoordelen. Dit protocol kan worden aangepast en toegepast op andere faag-bacterieparen en biedt een startpunt voor het bestuderen van gastheer-faagdynamiek in vivo.

Introduction

Bacteriofagen, of fagen, zijn virussen die bacteriën infecteren en doden met soort- en stamspecificiteit1. Fagen spelen een belangrijke rol binnen complexe bacteriële gemeenschappen zoals de darmmicrobiota, waar ze betrokken zijn bij het reguleren van de populatiedynamiek en het stimuleren van bacteriële fitheid. Gedurende het afgelopen decennium is er hernieuwde belangstelling geweest voor faagonderzoek als gevolg van de opkomst van antimicrobieel resistente pathogenen3 en het potentieel voor faagtherapie als alternatieve behandelingsstrategie. In de afgelopen jaren zijn lytische faagcocktails met enig succes intraveneus gebruikt bij ernstige, antibioticaresistente bacteriële septische infecties bij mensen 3,4. Orale faagtherapie is ook voorgesteld als een mogelijk alternatief voor antibiotica om darminfecties en ontstekingen te behandelen. Bovendien zijn fagen betrokken bij het succes van fecale filtraattransplantaties (FFT), dit zijn fecale microbiotapreparaten die zijn gefilterd om bacteriën te verwijderen, bij de behandeling van recidiverende Clostridioides difficile-infectie (rCDI)5,6, inflammatoire darmaandoeningen (IBD)7,8 en necrotiserende enterocolitis bij te vroeg geboren varkens9. Gezien deze resultaten is het belangrijk om rekening te houden met interacties tussen zowel fagen en de darmmicrobiota, als fagen en de gastheer van zoogdieren, aangezien de toevoeging van nieuwe fagen aan een reeds bestaande gemeenschap indirecte effecten kan hebben op de gemeenschap als geheel, en niet alleen op de doelbacteriën2,10.

De studie van faaginteracties met hun doelbacteriën in vitro is nuttig gebleken voor het begrijpen van de mechanismen en effecten van faag- en bacterie-interacties in de darm. In deze setting is aangetoond dat Escherichia coli-specifieke T4-fagen van de orde Caudovirales immunoglobuline (Ig)-achtige domeinen nodig hebben die zich bevinden in zeer antigene buitenste capside (Hoc)-eiwitten op het virionoppervlak om zich te hechten aan darmslijm11. Bovendien hebben transwell-tests aangetoond dat T4-fagen in staat zijn om te interageren met epitheelcelculturen en door cellagen te transloceren door macropinocytose12,13. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat fagen kunnen interageren met hun metazoaire gastheer, ook al zijn ze niet in staat om eukaryote cellen te infecteren. Deze modellen, hoewel nuttig, missen het volledige scala aan complexe interacties die plaatsvinden in een darmecosysteem die nodig zijn voor een uitgebreide verkenning van de tripartiete interactie tussen fagen, bacteriën en de metazoaire gastheer.

Muismodellen zijn een belangrijk hulpmiddel voor het onderzoeken van fagen binnen complexe omgevingen. Een wenselijke toepassing van faagtoediening is als een alternatieve strategie voor de behandeling van antimicrobieel resistente infecties of pathobionten geassocieerd met chronische ontstekingsziekten, waaronder IBD. Opkomende literatuur suggereert echter dat faaggedrag in vitro niet volledig representatief is voor in vivo functies. Buttimer et al.14 toonden aan dat een faagcocktail in staat was om de beoogde bacteriën in vitro uit te putten in een vereenvoudigd consortium voor menselijke microbiota, maar niet in vivo kon worden gerepliceerd in gnotobiotische muizen die waren gekoloniseerd met hetzelfde bacterie-faagconsortium. Bovendien leidde de T7-faag in een conventioneel microbioom van muizen tot selectieve uitputting van de beoogde darmbacteriën, hoewel geleidelijk herstel in de loop van de tijd werd waargenomen, wat wijst op geëvolueerde resistentie15. Andere studies hebben het naast elkaar bestaan aangetoond van oraal toegediende fagen en hun doelbacteriestammen in vivo 2,16. Naast het naast elkaar bestaan van fagen en bacteriën, leidde de toediening van fagen inderdaad tot wijdverbreide veranderingen in de algehele samenstelling en functie van de microbiotagemeenschap 2,16. Dit is relevant in ziekteomgevingen, aangezien verschillende onderzoeken associaties hebben gevonden tussen een verhoogde relatieve abundantie van Caudovirales en IBD 7,8,17 die onafhankelijk waren van veranderingen in bacteriële abundantie7. Het blijft onbekend of dit een aanjager of gevolg is van de pathogenese van de ziekte.

De historische focus van faagonderzoek lag op de relatie tussen een faag en zijn doelbacterie. Het is echter ook belangrijk om rekening te houden met mogelijke interacties tussen faag en het slijmvlies, het epitheel en het immuunsysteem van de metazoaire gastheer. Deze interacties spelen allemaal een belangrijke rol in de algehele respons op een darmfaaginfectie. Om dit aan te tonen, zijn fagen bestudeerd met behulp van kiemvrije (GF) muizen om hun impact op het immuunsysteem op te helderen zonder interferentie door de microbiota8. In dit systeem werden faagnucleïnezuren gedetecteerd door Toll-like receptoren (TLR’s) die zich in endosomen van fagocytische immuuncellen (macrofagen en dendritische cellen) bevinden. Dit activeerde stroomafwaartse signalering en stimuleerde T-celafhankelijke productie van interferon (IFN)-γ8 of type I IFN’s18. Bovendien impliceerden Flückiger et al.19 geheugen CD8+ T-cellen bij de herkenning van faag-gecodeerde (profag) antigenen, wat resulteerde in kruisreactiviteit van T-cellen met tumorantigenen, wat resulteerde in verminderde tumorbelasting. Ten slotte is de productie van faagspecifieke antilichamen gedocumenteerd in muizenstudies waarbij fagen op een continue manier aan diermodellen werden toegediend via drinkwater 8,20, of door herhaalde orale maagsonde gedurende meerdere maanden20, wat het vermogen van faageiwitten aantoont om humorale immuunresponsen te bevorderen. Hoewel deze manieren van faaginoculatie een optimale en voortdurende priming van het immuunsysteem mogelijk maken, vertegenwoordigen ze mogelijk niet de natuurlijk voorkomende interacties tussen fagen en het darmmilieu, noch de kinetiek van oraal toegediende faagtherapie. Tot nu toe heeft een beperkt aantal studies de interacties van fagen met een enkele bacteriesoort onderzocht in monocolonized muismodellen21. Muizen met monokolonisatie bleken echter van cruciaal belang bij het ontcijferen van microbe-specifieke effecten van individuele soorten op het maagdarmkanaal (GI) en de ontwikkeling van het immuunsysteem22,23,24, en ze kunnen nog nuttig blijken te zijn bij het begrijpen van tripartiete interacties tussen fagen, hun doelbacteriën en de metazoaire gastheer.

Opwindend is dat er nog veel te leren valt over de interacties tussen darmfaag en darmcommensale bacteriën, evenals de interacties die optreden tussen de metazoaire gastheer en de fagen die erin verblijven. Dit protocol biedt een reeks procedures om geïsoleerde T4-faag en zijn bacteriële tegenhanger, E. coli (K-12, BW25113), te bestuderen met behulp van een gnotobiotisch muismodel. Deze gestandaardiseerde procedures bieden ook een basis voor het optimaliseren van andere faag/bacterie-dyades door de groeiparameters aan te passen aan de paren van belang. De hier beschreven methoden beschrijven: (1) Bereiding van T4-faag en vehiculumlysaten voor orale sonde van muizen; (2) Orale toediening van T4-faag aan gnotobiotische muizen met E. coli monokolonisatie; (3) Monitoring van T4-faagniveaus in uitwerpselen en weefsels van muizen in de loop van de tijd.

Voor de representatieve resultaten die hier worden gepresenteerd, werden gezuiverde T4-faaglysaten vermeerderd uit faagbankvoorraden die worden bijgehouden door het Rohwer Lab. De faag-op-tap-methode voor de vermeerdering van T4-fagen is aangepast25, zoals vermeld in dit protocol. De methode levert binnen drie dagen endotoxine-lage faagvoorraden met een hoge titer op. Met behulp van deze aanpak werden routinematig 10 ml ≥ 1010 plaquevormende eenheden (pfu)/ml T4-faag met < 0,5 endotoxine-eenheden (EU)/ml verzameld. De aanbevolen endotoxineniveaus voor orale of intraveneuze toediening aan muizen zijn respectievelijk ≤ 20 EU/ml en ≤ 5 EU/kg/u (of 0,1 EU toegediend gedurende 1 uur voor een muis van 20 g), waardoor dit een geschikte methode is voor de bereiding van fagen voor in-vivo-inoculatie . Alle faagvoorraden werden bij 4 °C opgeslagen in een faagbuffer van zout magnesium (SM) (recept in stap 1.1.5.1). E. coli werd gekweekt in LB-media. Voor verschillende faag-bacterieparen kunnen diverse kweekmedia en groeiomstandigheden worden aangepast aan dit protocol. Fagen kunnen ook afkomstig zijn uit de omgeving, zoals afvalwater, zeewater, bodem en darminhoud en kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd volgens Sambrook en Russell26 voorafgaand aan de bereiding met behulp van de juiste groei- en voortplantingsomstandigheden voor elk faag-gastheerpaar van belang25. Als alternatief kunnen fagen worden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel) of uit faagbanken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn opgesteld door de UBC Animal Care Committee en de door de Biosafety Committee goedgekeurde protocollen (A23-0113, B19-0038). Muizen werden gehuisvest aan de Universiteit van British Columbia onder pathogeenvrije omstandigheden in het Center for Disease Modelling. C57BL/6-muizen werden binnen de faciliteit gefokt in een steriele flexibele filmisolator, voorzien van steriel muizendieet, water, strooisel en nestmateriaal. De muizen werden geh…

Representative Results

Om de interacties tussen de T4-faag/E. coli-dyade in de darm van muizen te onderzoeken, werden T4-faag en vehiculumlysaten bereid, gereinigd en gezuiverd (Figuur 1A). T4-faaglysaten werden getitereerd door middel van plaquetest en verdund tot 2 x 107 pfu/ml (2 x 106 pfu/muis) in SM-buffer. Voertuiglysaten werden ook getiterd om te bevestigen dat er geen levensvatbare faagaanwezigheid was en verdund in hetzelfde volume SM-buffer als het T4-faaglysaat. Endotoxine…

Discussion

De studie van fagen in het microbioom vormt een aanzienlijke uitdaging in vergelijking met hun bacteriële tegenhangers. In het bijzonder bevatten fagen geen geconserveerde fylogenetische marker die alle fagen gemeen hebben en die verwant is aan de 16S- en 18S-ribosomale subeenheden die het gemakkelijker maken om respectievelijk prokaryote en eukaryote soorten te sequencen en te identificeren42. Echter, met de vooruitgang in de volgende generatie sequencing-benaderingen, waaronder toenemende leesl…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen dat het land waarop ze dit onderzoek hebben uitgevoerd het traditionele, voorouderlijke en niet-afgestane grondgebied is van de xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Nation. Het land waarop het zich bevindt, is altijd een leerplaats geweest voor het Musqueam-volk, dat al millennia lang hun cultuur, geschiedenis en tradities van de ene generatie op de andere op deze site heeft doorgegeven. We moedigen anderen aan om meer te weten te komen over de geboortelanden waarin ze wonen en werken in https://native-land.ca. De auteurs erkennen de steun van de Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Canadian Graduate Scholarships – Master’s (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, naar MH), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants Program (RGPIN-2019-04591 naar CT, RGPIN-2016-04282 naar LCO), Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, naar C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, naar C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 naar LCO) en de Canadian Foundation for Innovation (34673 naar LCO en 38277 naar CT). We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van het UBC Centre for Disease Modelling en ubcFLOW, dat wordt ondersteund door het UBC GREx Biological Resilience Initiative, en van leden van de Osborne- en Trolini-laboratoria voor kritische discussies en evaluatie van het manuscript. Figuur 1A en Figuur 2A zijn gemaakt met behulp van Biorender.com.

Materials

1-octanol (99%) Thermofisher CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units Millipore Sigma  SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) Fisher BioReagents  BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 Millipore Sigma UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST BD Medical 365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)  Techiplast 1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BioRad 1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) Fisher BioReagents BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk Andwin Scientific  16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) Fisher C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm) Crosman Corporation 0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Thermo Scientific  69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific  K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O Sigma Aldrich E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™  Fisher Bioreagents BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox  Fisher Bioreagents BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific  SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns QuantaBio 95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED Techiplast UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher BioReagents BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker Thermo Scientific  8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) – Lennox Fisher BioReagents BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml Fisher 14-666-315
Parafilm sealing film Bemis PM-996
Phage stocks Carolina Biological Supply  n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT LabDiet 5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific  A39552S
RNase A (17,500 U) Qiagen 19101
RNase-free DNase Set Qiagen  79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Chemical BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Chemical S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) Fisher scentific  n/a
Sterile flexible film isolator  Class Biologically Clean  n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102
T100 Thermal Cycler  BioRad 1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) IDT n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) IDT n/a
TissueLyser II  Qiagen  85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure Thermo Scientific  AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free) Fisher BioReagents BP2484100

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
  3. Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
  4. Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  5. Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
  6. Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
  7. Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
  8. Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
  9. Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
  10. Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
  11. Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
  12. Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
  13. Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287 (2021).
  14. Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083 (2022).
  15. Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324 (2022).
  16. Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
  17. Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
  18. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
  19. Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
  20. Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607 (2019).
  21. Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
  22. Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
  23. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  24. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  25. Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261 (2016).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, (2001).
  27. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
  28. Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  30. Louten, J. Chapter 7 – Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
  31. Richter, &. #. 3. 2. 1. ;., et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387 (2021).
  32. . Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices Available from: https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit (2018)
  33. Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
  34. Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27 (2018).
  35. Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536 (2021).
  36. Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323 (2023).
  37. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
  38. Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699 (2022).
  39. Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
  40. Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
  41. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222 (2013).
  42. Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
  43. Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
  44. Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
  45. Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656 (2022).
  46. Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem’s influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
  47. Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth’s Most Diverse Inhabitants. Wholon. , (2014).
  48. Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490 (2022).
  49. Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
  50. Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292 (2015).
  51. Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402 (2012).
  52. Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
  53. Kutter, E., Sulakvelidze, A. . Bacteriophages: Biology and Applications. , (2004).
  54. Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020 (2022).

Play Video

Cite This Article
Pett, N., Hunter, M., Carranza García, N. A., Seo, J. H., Collins, S. R., Rohwer, F., Osborne, L. C., Tropini, C. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (203), e65906, doi:10.3791/65906 (2024).

View Video