A continuación se presenta un protocolo para el cultivo de explantes placentarios en condiciones de flujo constante. Este enfoque mejora los sistemas tradicionales de cultivo estático de vellosidades al permitir la replicación de entornos fisiológicos dinámicos.
Los modelos de cultivo de explantes placentarios ex vivo existentes se basan principalmente en sistemas de cultivo estáticos que utilizan placas de pocillos. Sin embargo, estos modelos no reflejan adecuadamente la dinámica en el entorno uterino , donde la placenta se encuentra con un ligero estrés de cizallamiento constante debido al plasma o al flujo sanguíneo. Para hacer frente a esta limitación, se ha ideado un sistema de cultivo de flujo para acercar el cultivo de explantes placentarios ex vivo a las condiciones de flujo intrauterina experimentadas en el cuerpo materno. Dentro de este enfoque, los explantes placentarios se cultivan en una secuencia de cinco cámaras de flujo interconectadas. Este ajuste mantiene las concentraciones fisiológicas de oxígeno y un caudal constante. Los datos recopilados revelan que, en condiciones de flujo, la preservación de la morfología de los tejidos presenta una mejora notable en comparación con los métodos estáticos convencionales. Esta técnica innovadora introduce un medio sencillo de cultivo de explantes placentarios ex vivo, ofreciendo una representación más fiel del entorno dinámico in vivo . Además, este estudio introduce nuevas posibilidades para investigar la dinámica funcional de la interfase feto-materna. Al adoptar metodologías dinámicas factibles, se facilita una comprensión más profunda de la biología placentaria, subrayando su relevancia para la salud materno-fetal.
Desde la década de 1960, el cultivo de explantes placentarios en el fondo de una placa de pocillose ha utilizado para estudiar la interfase feto-materna 1,2,3. Este método está bien establecido y es sencillo, lo que permite la utilización de tejido humano para diversos estudios, además de cultivos de células individuales 2,3. A lo largo del tiempo, los diseños experimentales de cultivos de explantes placentarios se han modificado con respecto a la concentración de oxígeno4 y para evitar que el tejido se asiente en el fondo de la placa del pocillo 2,5,6. Sin embargo, este método no se ha adaptado a las condiciones in vivo dentro del útero, específicamente a la presencia de un flujo constante3.
El éxito de un embarazo depende de una adecuada y consistente perfusión del espacio intervelloso con la sangre materna, estableciendo un circuito dinámico con entrada y salida continua de sangre y sustancias transmitidas por la sangre 7,8,9,10,11,12. La placenta presenta dos sistemas distintos de irrigación sanguínea, uno para la sangre materna y otro para la sangre fetal, lo que resulta en una doble perfusión por parte de los sistemas fetal y materno13. La sangre materna comienza a perfundir el espacio intervelloso de la placenta al final del primer trimestre, fluyendo lentamente a través de las arterias espirales uterinas ensanchadas10,11,14. En consecuencia, los árboles vellosos placentarios se bañan en sangre materna, entregando nutrientes y oxígeno al feto. Esta sangre materna fluye a través del espacio intervelloso antes de regresar a la circulación materna a través de las venas uteroplacentarias. Durante su paso a través del espacio intervelloso, la difusión y la absorción activa de oxígeno y nutrientes en la sangre fetal conducen a niveles más bajos de oxígeno y nutrientes en la sangre materna12,15. Sin embargo, la sangre del espacio intervelloso es completamente reemplazada por sangre fresca y rica en oxígeno aproximadamente dos o tres veces por minuto, lo que garantiza un suministro continuo de nutrientes y gases13. Cabe destacar que el sincitiotrofoblasto, la parte más externa de la barrera placentaria, es el único componente del árbol velloso placentario directamente expuesto a la sangre materna15,16,17. En consecuencia, el sincitiotrofoblasto experimenta un leve estrés de cizallamiento constante debido al flujo de sangre materna 3,14.
Los conocimientos científicos actuales sobre el entorno del flujo placentario y los avances técnicos modernos permiten ahora un cultivo adaptado y fisiológicamente aproximado de explantes placentarios en condiciones de flujo. Además, la evidencia sugiere que las fuerzas de cizallamiento influyen en las funciones biológicas del sincitiotrofoblasto 18,19,20,21. Un enfoque bien conocido que tiene en cuenta el flujo sanguíneo es el sistema de perfusión placentaria de doble lóbulo22. Sin embargo, estos experimentos requieren una experiencia significativa, están restringidos en el tiempo (se realizan solo durante unas pocas horas) y son factibles solo con muestras de placenta del tercer trimestre 3,23. Por el contrario, hemos desarrollado una técnica sencilla y no intrusiva para el cultivo ex vivo de explantes de vellosidades placentarias en entornos de flujo constante, que se adapta a los tejidos placentarios del primer y tercer trimestre3. En esta configuración, los explantes placentarios se cultivan en cinco cámaras de flujo conectadas en serie. Los explantes vellosos se fijan al fondo de la cámara mediante elevaciones en forma de aguja sobre placas metálicas delgadas. El circuito de flujo construido se transfiere posteriormente a un biorreactor, donde se regulan tanto la concentración de oxígeno como el caudal3. Los resultados del cultivo de flujo demuestran que la integridad de los tejidos se conserva mejor en comparación con el método estático utilizado normalmente3. Además, este enfoque dinámico permite diseños experimentales novedosos y adaptados para el cultivo de explantes de tejidos, lo que permite experimentos in vitro que imitan más de cerca el entorno natural3.
Este estudio presenta una perspectiva única sobre una técnica de cultivo de flujo para explantes placentarios diseñada para replicar la dinámica en el ambiente uterino 3,23. Los hallazgos revelan que la morfología de los tejidos cultivados en condiciones de flujo está mejor conservada en comparación con el método tradicional de cultivo estático3. Cabe destacar que, a pesar de que ni las condiciones estáticas ni las de cultivo de flujo facilitan la perfusión de los vasos placentarios, la destrucción de los vasos sanguíneos feto-placentarios dentro del estroma velloso se observó predominantemente en el cultivo estático, mientras que la integridad de los vasos sanguíneos pareció mantenerse mejor durante un período más largo en el cultivo de flujo3.
Una posible explicación para esta observación podría estar relacionada con el crucial papel protector y endocrino del sincitiotrofoblasto, una función bien documentada en la literatura 12,24,25,26. Teniendo en cuenta esto, es concebible que la integridad general de la capa externa de las vellosidades contribuya significativamente al mantenimiento del estroma subyacente, incluidos los vasos sanguíneos. En consecuencia, la integridad celular sostenida de los vasos sanguíneos en condiciones de flujo podría atribuirse al flujo continuo del medio. Este movimiento ayuda en el movimiento pasivo de los explantes, facilitando el intercambio de gases, nutrientes y nanopartículas (como vesículas extracelulares) a través de la barrera placentaria. Esto, a su vez, podría tener un impacto positivo en la preservación de la morfología de los vasos sanguíneos. Además, el fenómeno de la mecanosensación desempeña un papel en la morfogénesis tisular en varios tejidos27,28. Los estudios han demostrado que la mecanosensibilidad influye en los procesos celulares en múltiples niveles, desencadenando una serie de respuestas bioquímicas que, en última instancia, influyen en la funcionalidad de los tejidos y órganos29. Cabe destacar que las proteínas mecanosensibles son expresadas por el sincitiotrofoblasto a lo largo de la gestación28. Además, el estudio sugiere que las microvellosidades en la superficie del tejido pueden estar implicadas en este contexto28.
Una perspectiva adicional que vale la pena considerar es el papel potencial de las mitocondrias en la respuesta celular al flujo. Por ejemplo, en las células endoteliales, las mitocondrias sirven como transductores de señales para las respuestas celulares a los estímulos ambientales30. El aumento de la acumulación de gotas lipídicas, observado en el tejido cultivado estático a través de TEM3, se ha asociado con la inducción de apoptosis debido a la disfunción mitocondrial31. Se necesitan más investigaciones para desvelar los mecanismos subyacentes y los factores clave, vinculándolos a las vías de señalización posteriores. Esta exploración podría mejorar nuestra comprensión de cómo el tejido percibe y reacciona al estrés cortante, lo que se traduce en una mejor viabilidad e integridad de los explantes vellosos en cultivo23.
Varios pasos críticos del protocolo deben reiterarse y ejecutarse con cuidado. Después de la expulsión de la placenta, el tejido debe cultivarse lo más rápido posible. Durante la preparación del explante, es crucial evitar las áreas con infartos visibles. Es importante manipular suavemente los explantes con fórceps para evitar que se aprieten. Se recomienda mantener el tejido cubierto de líquido durante todo el procedimiento y llevarlo a cabo rápidamente.
Es importante reconocer que este estudio no puede especificar el esfuerzo cortante exacto dentro del sistema de flujo presentado, lo que debe ser considerado como una limitación en futuras investigaciones 3,23. Sin embargo, es importante reconocer que la velocidad precisa del flujo y el esfuerzo cortante para una vellosidad placentaria específica in vivo están influenciados por numerosos parámetros, como las características geométricas del espacio intervelloso, la ubicación de las vellosidades dentro de este espacio y su proximidad y ángulo a las arterias espirales maternas y las venas uterinas 3,19,23,32 . También hay que tener en cuenta la complejidad de la estructura geométrica de la placenta, que varía entre los individuos23,32. Ya existen modelos matemáticos que estiman el flujo sanguíneo dentro del espacio intervelloso32 y cálculos sobre el esfuerzo cortante de la pared en el sincitiotrofoblasto 19,28. Curiosamente, un estudio predijo que el esfuerzo cortante en el sincitiotrofoblasto es menor en el tercer trimestre en comparación con el primer trimestre28, mientras que otro demostró un esfuerzo cortante de pared espacialmente heterogéneo en el sincitiotrofoblasto19. Determinar la velocidad de flujo precisa y el esfuerzo cortante para una vellosidad placentaria específica sigue siendo un desafío 3,19,23,32. Estos cálculos ofrecen una aproximación del rango de esfuerzo cortante para futuras investigaciones, pero pueden requerir ajustes anatómicos continuos y optimización23. Además, los estudios futuros pueden desarrollar nuevas y refinadas técnicas de cultivo de flujo continuo que tengan en cuenta la intrincada geometría del espacio intervelloso y estrategias para aumentar el número de especímenes por experimento3. Se prevé un progreso y desarrollo continuos del sistema de flujo, que podrían emplear cámaras de flujo alternativas (Brugger et al., datos no publicados, 2023).
En conclusión, este estudio sienta una base sólida al demostrar una técnica de cultivo de flujo ex vivo fácilmente implementable que mantiene la integridad estructural de los explantes vellosos cultivados. Subraya la importancia de las técnicas dinámicas en los estudios de biología funcional placentaria, allanando el camino para nuevos avances en los sistemas de cultivo de flujo y la generación de nuevas ideas e hipótesis 3,23.
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen el excelente apoyo técnico de Bettina Amtmann y Petra Winkler para la toma de muestras de tejidos. Esta investigación fue financiada por el Fondo Austriaco para la Ciencia FWF (DOC 31-B26) y la Universidad Médica de Graz, Austria, a través del Programa de Doctorado Trastornos Inflamatorios en el Embarazo (DP-iDP).
6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
Metal plate with needles | In-house construction | ||
Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |