这是在恒定流动条件下培养胎盘外植体的方案。这种方法通过复制动态生理环境来增强传统的静态绒毛培养系统。
现有的离体胎盘外植 体 培养模型主要基于使用孔板的静态培养系统。然而,这些模型不能充分反映 子宫内 的动态,胎盘由于血浆或血流而遇到持续的轻微剪切应力。为了解决这一限制,设计了一种流动培养系统,使离体胎盘外植 体 培养更接近母体内经历的 子宫内 流动条件。在这种方法中,胎盘外植体在五个相互连接的流动室中培养。此设置可保持生理氧浓度和一致的流速。收集的数据表明,在流动条件下,与传统的静态方法相比,组织形态的保存表现出显着的增强。这项创新技术引入了一种直接的离体胎盘外植 体 培养方法,提供了更忠实的 体内 动态环境。此外,本研究为研究胎儿-母体界面的功能动力学提供了新的可能性。通过采用可行的动态方法,有助于更深入地理解胎盘生物学,强调其与母胎健康的相关性。
自 1960 年代以来,在孔板底部培养胎盘外植体已被用于研究胎儿-母体界面 1,2,3。这种方法是成熟且直接的,除了单细胞培养外,还可以将人体组织用于各种研究 2,3。随着时间的流逝,胎盘外植体培养物的实验设计在氧浓度方面进行了修改4 并防止组织沉降在孔板的底部 2,5,6。然而,这种方法尚未适应子宫内的体内条件,特别是恒定流量的存在3。
怀孕的成功取决于用母体血液充分和一致地灌注绒毛间隙,建立血液和血源性物质连续流入和流出的动态回路7,8,9,10,11,12。胎盘具有两种不同的血液供应系统,一种用于母体血液,一种用于胎儿血液,导致胎儿和母体系统双重灌注13。母体血液在孕早期结束时开始灌注胎盘的绒毛间隙,缓慢流过扩大的子宫螺旋动脉10,11,14。因此,胎盘绒毛树沐浴在母体血液中,为胎儿输送营养和氧气。这种母体血液流经绒毛间隙,然后通过子宫胎盘静脉返回母体循环。在通过绒毛间隙的过程中,氧气和营养物质扩散和主动吸收到胎儿血液中会导致母体血液中的氧气和营养水平降低12,15。然而,绒毛间隙的血液完全被新鲜的、富氧的血液所取代,大约每分钟两到三次,确保营养物质和气体的持续供应13。值得注意的是,胎盘屏障的最外层合体滋养层是直接暴露于母体血液的胎盘绒毛树的唯一成分15,16,17。因此,合体滋养层会受到来自流动的母体血液的持续温和剪切应力 3,14。
目前关于胎盘流动环境的科学知识和现代技术进步现在允许在流动条件下对胎盘外植体进行适应和生理近似的培养。此外,有证据表明剪切力会影响合体滋养层18,19,20,21 的生物学功能。解释血流的一种众所周知的方法是胎盘双叶灌注系统22。然而,这些实验需要大量的专业知识,有时间限制(仅进行几个小时),并且仅适用于妊娠晚期胎盘样本3,23。相比之下,我们开发了一种简单且非侵入性的技术,用于在恒定流量设置下进行离体胎盘绒毛外植体培养,以适应孕早期和孕晚期胎盘组织3。在这种设置中,胎盘外植体在五个串联的流动室中培养。绒毛状外植体使用薄金属板上的针状立面固定在腔室的底部。随后将构建的流路转移到生物反应器中,在生物反应器中调节氧气浓度和流速3.流式培养结果表明,与通常使用的静态方法3 相比,组织完整性得到更好的保留。此外,这种动态方法为组织外植体培养提供了新颖和适应性的实验设计,允许更密切地模拟自然环境的体外实验3.
本研究为胎盘外植体的流动培养技术引入了独特的视角,该技术旨在复制子宫内环境的动态3,23。研究结果表明,与传统的静态培养方法相比,在流动条件下培养的组织形态保存得更好3.值得注意的是,尽管静态和流动培养条件都不利于胎盘血管的灌注,但在静态培养中主要观察到绒毛基质内胎盘血管的破坏,而在流动培养中,血管的完整性似乎在较长时间内得到更好的维持3。
对这一观察结果的一种可能的解释可能与合体滋养层的关键保护和内分泌作用有关,这一功能在文献 12,24,25,26 中得到了充分的记录。鉴于此,可以想象绒毛外层的整体完整性对维持下面的基质(包括血管)有显着贡献。因此,血管在流动条件下的持续细胞完整性可能归因于介质的连续流动。这种运动有助于外植体的被动运动,促进气体、营养物质和纳米颗粒(如细胞外囊泡)穿过胎盘屏障的交换。反过来,这可能会对血管形态的保存产生积极影响。此外,机械感觉现象在各种组织的组织形态发生中起作用27,28。研究表明,机械敏感性在多个层面上影响细胞过程,触发一系列最终影响组织和器官功能的生化反应29。值得注意的是,机械敏感蛋白在整个妊娠过程中由合体滋养层表达28。此外,该研究表明,组织表面的微绒毛可能与这种情况有关28。
另一个值得考虑的观点是线粒体在细胞对流动的反应中的潜在作用。例如,在内皮细胞中,线粒体作为细胞对环境刺激的反应的信号转导器30。通过 TEM3 在静态培养组织中观察到脂滴积累增加,与线粒体功能障碍引起的细胞凋亡诱导有关31。有必要进一步研究以揭示潜在的机制和关键因素,将它们与下游信号通路联系起来。这种探索可以增强我们对组织如何感知和反应剪切应力的理解,从而转化为培养中绒毛外植体的活力和完整性的提高23。
必须重申并谨慎执行几个关键的协议步骤。胎盘娩出后,应尽快培养组织。在外植体准备过程中,避开有可见梗死的区域至关重要。用镊子轻轻处理外植体以防止挤压很重要。建议在整个手术过程中保持组织被液体覆盖并快速进行。
重要的是要承认,本研究无法指定所呈现的流动系统内的确切剪切应力,这应该被视为未来研究的局限性 3,23。然而,重要的是要认识到,体内特定胎盘绒毛的精确流速和剪切应力受到许多参数的影响,例如绒毛间空间的几何特征、绒毛在该空间中的位置以及它与母体螺旋动脉和子宫静脉的接近度和角度 3,19,23,32 .胎盘几何结构的复杂性因人而异,也必须考虑在内23,32。估计绒毛间隙内血流的数学模型32和合体滋养层19,28的壁剪切应力计算已经存在。有趣的是,一项研究预测,与妊娠早期相比,妊娠晚期合体滋养层的剪切应力较低28,而另一项研究则表明合胞滋养层19 在空间上存在异质壁剪切应力。确定特定胎盘绒毛的精确流速和剪切应力仍然是一个挑战 3,19,23,32。这种计算为未来的研究提供了剪切应力范围的近似值,但它们可能需要持续的解剖调整和优化23。此外,未来的研究可能会开发新的和改进的流通培养技术,以解释绒毛间空间的复杂几何形状和增加每个实验标本数量的策略3。预计流动系统将持续取得进展和发展,可能会采用替代流动室(Brugger 等人,未发表的数据,2023 年)。
总之,本研究通过展示一种易于实施的离体流培养技术奠定了坚实的基础,该技术维护了培养绒毛外植体的结构完整性。它强调了动态技术在胎盘功能生物学研究中的重要性,为流动培养系统的进一步发展以及新想法和假设的产生铺平了道路3,23。
The authors have nothing to disclose.
作者非常感谢 Bettina Amtmann 和 Petra Winkler 对组织取样的出色技术支持。这项研究由奥地利科学基金FWF(DOC 31-B26)和奥地利格拉茨医科大学通过妊娠期炎症性疾病博士项目(DP-iDP)资助。
6-well plates | NUNC, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 140675 | |
Alexa Fluor 555 goat-anti-mouse | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A21422 | Diluted in PBS, 1:200 |
antibody diluent | Dako, Santa Clara, CA, USA | S3022 | |
anti-β-actin (AC-15) | Abcam, Cambridge, UK | ab6276 | Stock concentration: 2.1 mg/mL, diluted in antibody diluent, 1:10,000 |
Bioreactor TEB500 | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Serial Number: TEB505 / 1000EW/ 117 | |
CD34 Class II (QBEnd-10) | Dako, Santa Clara, CA, USA | M7165 | Stock concentration: 12 mg/l, diluted in antibody diluent, 1:500 |
CPD 030 critically point dryer | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein) | Critically point dryer | |
DAPI | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | D21490 | Diluted in PBS, 1:1000 |
Ebers TEB505 Series Software | TEB500, EBERS Medical Technology SL, Zaragoza, Spain | Series Software 1.4 | |
Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell PC-C-22120, Heidelberg, Germany; | C-22120 | Used without EGCS/h and FCS, any other medium suitable for the tissue can be used |
Excelsior AS Tissue Processor | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Exosome-depleted fetal bovine serum | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | A2720803 | |
Histolab Clear | Histolab, Askim, Sweden | 14250-TY | |
Hydrogen Peroxide Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125H202Q | |
Kaiser’s Glycerin Gelatine | Merck, Darmstadt, Germany | 1092420100 | |
Leica DM 6000 B microscope | Leica, Wetzlar, Germany | Equipped with an Olympus DP 72 Camera | |
Leica UC7 ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna, Austria) | ||
Metal plate with needles | In-house construction | ||
Microtome | Microtome Microm HM 355 S, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
Microwave oven | Miele, Guetersloh, Germany | ||
Olympus microscope (BX63) | Olympus, Hamburg, Germany | Serial Number: 1A52421 | |
PBS | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 10010015 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco by Life Technologies, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | 2585627 | |
Primary antibody enhancer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-PB | |
ProLong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | P36934 | |
Pumping tube | Tygon, Bartelt, Graz, Austria | 6.078 175 | 1.02 mm diameter |
QV500 Flow chambers | Kirkstall Ltd., Quasi Vivo, North Yorkshire, UK | QV500 | Other chambers would work as well |
SCD 500, sputter coater | Bal-Tec, Balzers, Liechtenstein | Sputter coater | |
Substrate amino-ethyl carbazole, AEC substrate kit | Abcam, Cambridge, UK | ab64252 | |
Superfrost Plus slides | Menzel-Glaeser, Braunschweig, Germany | J1800AMNZ | |
Syringe Filter | Corning Incorporated, NY, USA | 431219 | 0.2 µm Pore SFCA Membrane, air filter for the reservoir bottle |
TAAB epoxy resin | Agar Scientific, Stansted, Essex, UK | T001 | |
UltraVision LP-Detection System HRP-Polymer | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TL-125-HL | |
UltraVision Protein Block | ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA | TA125BPQ | |
Zeiss EM 900 transmission electron microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | ||
Zeiss Sigma 500 field emission scanning electron microscope | Zeiss, Cambridge, UK | Used with a back-scattered electron detector at 5 kV acceleration voltage |