Dépistage de drogues basé sur la transcriptomique rentable
Summary
Ce protocole décrit un flux de travail allant des cultures cellulaires ex vivo ou in vitro au prétraitement des données transcriptomiques pour un criblage rentable de médicaments basés sur le transcriptome.
Abstract
La transcriptomique permet d’obtenir des informations complètes sur les programmes cellulaires et leurs réponses aux perturbations. Malgré une baisse significative des coûts de production et de séquençage des bibliothèques au cours de la dernière décennie, l’application de ces technologies à l’échelle nécessaire au criblage des médicaments reste prohibitive, ce qui entrave l’immense potentiel de ces méthodes. Notre étude présente un système rentable de criblage de médicaments basé sur le transcriptome, combinant des cultures de perturbation miniaturisées avec une transcriptomique mini-en vrac. Le protocole mini-bulk optimisé fournit des signaux biologiques informatifs à une profondeur de séquençage rentable, ce qui permet un criblage approfondi de médicaments connus et de nouvelles molécules. En fonction du traitement choisi et du temps d’incubation, ce protocole permettra d’obtenir des banques de séquençage dans un délai d’environ 2 jours. En raison de plusieurs points d’arrêt au sein de ce protocole, la préparation de la bibliothèque, ainsi que le séquençage, peuvent être effectués indépendamment du temps. Il est possible de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons ; La mesure de jusqu’à 384 échantillons a été testée sans perte de qualité des données. Il n’y a pas non plus de limites connues au nombre d’affections et/ou de médicaments, malgré la prise en compte de la variabilité des temps d’incubation optimaux des médicaments.
Introduction
Le développement de nouveaux médicaments est un processus complexe et chronophage qui implique l’identification de médicaments potentiels et de leurs cibles, l’optimisation et la synthèse de candidats-médicaments, et le test de leur efficacité et de leur innocuité dans le cadre d’essais précliniques et cliniques1. Les méthodes traditionnelles de criblage de médicaments, c’est-à-dire l’évaluation systématique de bibliothèques de composés candidats à des fins thérapeutiques, impliquent l’utilisation de modèles animaux ou de tests cellulaires pour tester les effets sur des cibles ou des voies spécifiques. Bien que ces méthodes aient permis d’identifier des médicaments candidats, elles n’ont souvent pas fourni suffisamment d’informations sur les mécanismes moléculaires complexes sous-jacents à l’efficacité des médicaments, ainsi que sur leur toxicité et leurs mécanismes d’effets secondaires potentiels.
L’évaluation des états transcriptionnels à l’échelle du génome présente une approche puissante pour surmonter les limites actuelles du criblage des médicaments, car elle permet des évaluations complètes de l’expression des gènes en réponse aux traitements médicamenteux2. En mesurant les transcrits d’ARN exprimés à l’échelle du génome à un moment donné, la transcriptomique vise à fournir une vue holistique des changements transcriptionnels qui se produisent en réponse aux médicaments, y compris les changements dans les modèles d’expression génique, l’épissage alternatif et l’expression de l’ARN non codant3. Ces informations peuvent être utilisées pour déterminer les cibles des médicaments, prédire l’efficacité et la toxicité des médicaments et optimiser les schémas posologiques et de traitement des médicaments.
L’un des principaux avantages de la combinaison de la transcriptomique et du criblage non biaisé des médicaments est la possibilité d’identifier de nouvelles cibles médicamenteuses qui n’ont pas été envisagées auparavant. Les approches conventionnelles de criblage de médicaments se concentrent souvent sur des molécules ou des voies cibles établies, ce qui entrave l’identification de nouvelles cibles et peut entraîner la mise en place de médicaments ayant des effets secondaires imprévus et une efficacité limitée. La transcriptomique peut surmonter ces limites en fournissant des informations sur les changements moléculaires qui se produisent en réponse au traitement médicamenteux, en découvrant des cibles ou des voies potentielles qui n’auraient peut-être pas été envisagées auparavant2.
En plus de l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses, la transcriptomique peut également être utilisée pour prédire l’efficacité et la toxicité des médicaments. En analysant les modèles d’expression génique associés aux réponses aux médicaments, il est possible de développer des biomarqueurs qui peuvent être utilisés pour prédire la réponse d’un patient à un médicament ou à un schéma thérapeutique particulier. Cela peut également aider à optimiser la posologie des médicaments et à réduire le risque d’effets secondaires indésirables4.
Malgré ses avantages potentiels, le coût de la transcriptomique reste un obstacle important à son application généralisée dans le dépistage des drogues. L’analyse transcriptomique nécessite un équipement spécialisé, une expertise technique et une analyse des données, ce qui peut rendre difficile l’utilisation de la transcriptomique pour les petites équipes de recherche ou les organisations disposant d’un financement limité dans le dépistage des médicaments. Cependant, le coût de la transcriptomique n’a cessé de diminuer, ce qui la rend plus accessible aux communautés de recherche. De plus, les progrès de la technologie et des méthodes d’analyse des données ont rendu la transcriptomique plus efficace et plus rentable, ce qui en a encore accru l’accessibilité2.
Dans ce protocole, nous décrivons un système exploratoire de grande dimension pour le criblage de médicaments basé sur le transcriptome, combinant des cultures de perturbation miniaturisées avec une analyse transcriptomique en mini-vrac 5,6. Avec ce protocole, il est possible de réduire le coût par échantillon à 1/6ème du coût actuel des solutions commerciales pour le séquençage de l’ARNm pleine longueur. Le protocole ne nécessite que des équipements de laboratoire standard, la seule exception étant l’utilisation de technologies de séquençage à lecture courte, qui peuvent être externalisées si les instruments de séquençage ne sont pas disponibles en interne. Le protocole mini-bulk optimisé fournit des signaux biologiques riches en informations à une profondeur de séquençage rentable, ce qui permet un criblage approfondi de médicaments connus et de nouvelles molécules.
L’objectif de l’expérience est de dépister l’activité des médicaments sur les PBMC dans différents contextes biologiques. Ce protocole peut être appliqué à n’importe quelle question biologique où plusieurs médicaments doivent être testés avec une lecture transcriptomique, donnant une vue à l’échelle du transcriptome de l’effet cellulaire du traitement.
Protocol
Representative Results
Discussion
La découverte et le développement de médicaments peuvent grandement bénéficier de la vision holistique des processus cellulaires que la transcriptomique de masse peut fournir. Néanmoins, cette approche est souvent limitée par le coût élevé de l’expérience avec le protocole standard de séquençage de l’ARN en vrac, ce qui interdit son application dans les milieux académiques ainsi que son potentiel d’évolutivité industrielle.
Les étapes les plus critiques du protocole sont…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.L.S. est soutenu par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne (EXC2151-390873048), ainsi que dans le cadre de la SCHU 950/8-1 ; GRK 2168, TP11 ; CRC SFB 1454 Metaflammation, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, le projet d’excellence Diet-Body-Brain (DietBB) financé par le BMBF ; et le projet européen SYSCID sous le numéro de subvention 733100. M.B. est soutenu par DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. est soutenu par la DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 – numéro de projet 513977171) et la stratégie d’excellence de l’Allemagne (EXC2151-390873048). Images créées avec BioRender.com.
Materials
| 50 mL conical tube | fisher scientific | 10203001 | |
| Adhesive PCR Plate Seals | Thermo Fisher Scientific | AB0558 | |
| Amplicon Tagment Mix (ATM) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A 63881 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 61962 | |
| Cell culture grade 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | 260860 | |
| Cell culture vacuum pump (VACUSAFE) | Integra Bioscience | 158300 | |
| Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs) mix 10 mM each | Fermentas | R0192 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| DTT (100 mM) | Invitrogen | 18064-014 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 798681 | for adherent cells |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 51976 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| Filter tips (10 µL) | Gilson | F171203 | |
| Filter tips (100 µL) | Gilson | F171403 | |
| Filter tips (20 µL) | Gilson | F171303 | |
| Filter tips (200 µL) | Gilson | F171503 | |
| Guanidine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | G3272 | |
| ISPCR primer (10 µM) | Biomers.net GmbH | SP10006 | 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3′ |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Magnetic stand 96 | Ambion | AM10027 | |
| Neutralize Tagment (NT) Buffer | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples), alternatively 0.2 % SDS |
| Nextera-compatible indexing primer | Illumina | ||
| Nuclease-free water | Invitrogen | 10977049 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| PCR 96-well plates | Thermo Fisher Scientific | AB0600 | |
| PCR plate sealer | Thermo Fisher Scientific | HSF0031 | |
| Penicillin / Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Qubit 4 fluorometer | Invitrogen | 15723679 | |
| Recombinant RNase inhibitor (40 U/ul) | TAKARA | 2313A | |
| RPMI-1640 cell culture medium | Gibco | 61870036 | If not working with PBMCs, adjust to cell type |
| SMART dT30VN primer | Sigma-Aldrich | 5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3 |
|
| Standard lab equipment | various | various | e.g. centrifuge, ice machine, ice bucket, distilled water, water bath |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase (SSRT II) buffer (5x) | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | |
| Tagment DNA Buffer (TD) | Illumina | FC-131-1096 | Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 samples) |
| TapeStation system 4200 | Agilent | G2991BA | |
| Thermocycler (S1000) | Bio-Rad | 1852148 | |
| TSO-LNA (100 uM) | Eurogentec | 5' Biotin AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G |
|
| Vortex-Genie 2 Mixer | Sigma-Aldrich | Z258415 |
References
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