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Biology

स्थानिक तराजू में माउस oocyte नाभिक के साइटोस्केलेटन आधारित आंदोलन पर कब्जा

Published: January 12, 2024 doi: 10.3791/65976
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1
1Center for Interdisciplinary Research in Biology (CIRB), Collège de France, CNRS, INSERM, Université PSL, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology, Institut Pasteur, Université de Paris Cité, CNRS, 3Centre for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology

Summary

यह प्रोटोकॉल परमाणु आकार पर साइटोस्केलेटन के भौतिक प्रभाव और माउस oocyte प्रणाली में आंतरिक झिल्ली-कम जीवों का दस्तावेजीकरण करने के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचा प्रदान करता है। ढांचे को अन्य सेल प्रकारों और संदर्भों में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

महिला बांझपन के कारणों को समझने में एक बड़ी चुनौती महिला रोगाणु कोशिकाओं के विकास को नियंत्रित करने वाले तंत्र को स्पष्ट करना है, जिसका नाम oocytes है। उनके विकास को कोशिका वृद्धि और बाद के विभाजनों द्वारा चिह्नित किया जाता है, दो महत्वपूर्ण चरण जो भ्रूणजनन शुरू करने के लिए शुक्राणु के साथ संलयन के लिए ओओसाइट तैयार करते हैं। विकास के दौरान, oocytes सेल केंद्र में नाभिक की स्थिति के लिए अपने साइटोप्लाज्म को पुनर्गठित करते हैं, चूहों और मनुष्यों में सफल oocyte विकास की भविष्यवाणी करने वाली एक घटना और इस प्रकार, उनकी भ्रूणजनित क्षमता। माउस oocytes में, इस साइटोप्लाज्मिक पुनर्गठन को साइटोस्केलेटन द्वारा संचालित दिखाया गया था, जिसकी गतिविधि यांत्रिक बलों को उत्पन्न करती है जो नाभिक को आंदोलन, पुनर्स्थापन और प्रवेश करती हैं। नतीजतन, यह साइटोप्लाज्मिक-टू-न्यूक्लियोप्लाज्मिक बल संचरण परमाणु आरएनए-प्रसंस्करण जीवों की गतिशीलता को ट्यून करता है जिसे बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट के रूप में जाना जाता है। यह प्रोटोकॉल उच्च लौकिक संकल्प के साथ, माउस oocytes में स्थानिक तराजू भर में नाभिक पर साइटोस्केलेटन के प्रभाव को दस्तावेज करने के लिए एक प्रयोगात्मक ढांचा प्रदान करता है। यह इमेजिंग और छवि विश्लेषण चरणों और उपकरणों का मूल्यांकन करने के लिए आवश्यक है i) oocyte साइटोप्लाज्म में साइटोस्केलेटल गतिविधि, ii) oocyte नाभिक के साइटोस्केलेटन-आधारित आंदोलन, और iii) oocyte न्यूक्लियोप्लाज्म में biomolecular घनीभूत गतिशीलता पर इसके प्रभाव। oocyte जीव विज्ञान से परे, यहां विस्तृत तरीकों को दैहिक कोशिकाओं में उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ताकि इसी तरह तराजू में परमाणु गतिशीलता के साइटोस्केलेटन-आधारित ट्यूनिंग को संबोधित किया जा सके।

Introduction

परमाणु स्थिति कई सेलुलर और विकासात्मक कार्यों 1,2,3,4,5 के लिए आवश्यक है. स्तनधारी मादा रोगाणु कोशिकाएं जिनका नाम ओसाइट्स है, आकार में एक असममित विभाजन से गुजरने के बावजूद कोशिका केंद्र में नाभिक की स्थिति के लिए अपने साइटोप्लाज्म को फिर से तैयार करती हैं, जो बाद के गुणसूत्र ऑफ-सेंटरिंग6 (चित्रा 1) पर निर्भर करती है। नाभिक का यह केंद्र चूहों और मनुष्यों 7,8 में सफल oocyte विकास की भविष्यवाणी करता है, और इस प्रकार, उनकी भ्रूण क्षमता (चित्रा 1)।

माउस oocytes में साइटोप्लाज्मिक रीमॉडेलिंग मुख्य रूप से एक्टोमायोसिन साइटोस्केलेटन9(चित्रा 2)द्वारा संचालित होती है। इसकी गतिविधि यांत्रिक बलों को उत्पन्न करती है जो नाभिक10 (चित्रा 2) को आंदोलन, पुनर्स्थापन और घुसना करती हैं। नतीजतन, यह साइटोप्लाज्मिक-टू-न्यूक्लियोप्लाज्मिक बल संचरण परमाणु दूत आरएनए-प्रसंस्करण जीवों की गतिशीलता को परमाणु धब्बों11 नाम देता है, जो बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट 12,13,14,15,16 (चित्रा 2)के रूप में जाना जाता नाभिक में कई झिल्ली-कम जीवों में से एक है।

लाइव इमेजिंग परमाणु आंदोलन के कार्यात्मक निहितार्थों को समझने में निर्णायक रही है। घंटे से अधिक परमाणु प्रवास की फिल्में, साथ ही एक्टिन जाल और थोक साइटोप्लाज्म की उच्च-अस्थायी संकल्प फिल्में, बड़े पैमाने पर परमाणु स्थिति के लिए एक सैद्धांतिक मॉडल के विस्तार में योगदान देती हैं, जो विभिन्न टाइमस्केल9 को जोड़ती हैं। इसके अलावा, साइटोप्लाज्म, परमाणु रूपरेखा और क्रोमैटिन और परमाणु संघनन जैसे परमाणु घटकों की उच्च अस्थायी संकल्प फिल्में, माउस oocytes में आरएनए-प्रसंस्करण और जीन अभिव्यक्ति पर नाभिक के साइटोस्केलेटन-आधारित आंदोलन की भूमिका पर प्रकाश डाला, सेल10,11 के भीतर विभिन्न स्थानिक तराजू को पाटना। कुल मिलाकर, लाइव इमेजिंग के आधार पर इस तरह के एक स्केल-क्रॉसिंग दृष्टिकोण ने नाभिक के साइटोस्केलेटल आंदोलन को oocytes की विकासात्मक सफलता से जोड़ने वाला पहला तर्क प्रदान किया।

प्रोटोकॉल इमेजिंग और छवि विश्लेषण पाइपलाइन प्रदान करता है जिसका उपयोग साइटोप्लाज्मिक बलों (मुख्य रूप से एफ-एक्टिन द्वारा और आंशिक रूप से सूक्ष्मनलिकाएं द्वारा उत्पन्न) के संचरण का अध्ययन करने के लिए नाभिक और माउस ओसाइट्स में इसके आंतरिक घटकों के लिए किया जाता है। इन प्रयोगों का परिणाम स्थानिक तराजू में बलों की निरंतरता को पकड़ने के लिए है, साइटोप्लाज्म में साइटोस्केलेटन से परमाणु इंटीरियर तक उच्च लौकिक संकल्प फिल्मों के माध्यम से जैसा कि हाल के दो अध्ययनों10,11में दिखाया गया है, जिसने साइटोप्लाज्मिक सक्रिय आंदोलनों के बीच लिंक स्थापित किया, परमाणु रूपरेखा के उतार-चढ़ाव, साथ ही एक प्रकार के परमाणु बायोमोलेक्यूलर संघनन के आंदोलन और सतह में उतार-चढ़ाव: परमाणु धब्बे। एक ही दृष्टिकोण अन्य मॉडल प्रणालियों जहां cytoplasmic बलों को बदलने की उम्मीद कर रहे हैं, इस तरह के घातक कैंसर कोशिकाओं17 के संदर्भ में के रूप में लागू किया जा सकता है.

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों यूरोपीय समुदाय के दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया था और कृषि के फ्रांसीसी मंत्रालय द्वारा अनुमोदित किया गया (प्राधिकरण संख्या 75-1170) और दिशा Générale de la Recherche et de l'Innovation (DGRI; जीएमओ समझौता संख्या DUO-5291)। चूहे एक 12 घंटे प्रकाश / अंधेरे चक्र पर पशु सुविधा में रखे गए थे, 22-24 डिग्री सेल्सियस के परिवेश के तापमान और 40% -50% की आर्द्रता के साथ. यहां उपयोग किए जाने वाले चूहे में मादा OF1 (ऑन्किन्स फ्रांस 1, 8 से 12 सप्ताह पुराना) और मादा C57BL/6 (10 से 14 सप्ताह पुराना) शामिल हैं।

1. Oocyte संग्रह और तैयारी

  1. 18 और 19 में वर्णित के रूप में 8 से 14 सप्ताह पुराने चूहों से oocytes लीजिए.
    1. संक्षेप में, पहले चूहों से अंडाशय निकालें जैसेकि 18 में प्री-वार्म्ड (37 डिग्री सेल्सियस) एम 2 + बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) माध्यम 1 माइक्रोनमिल्रिनोन 19 के साथ पूरक है, जो ओसाइट्स में अर्धसूत्रीविभाजन को फिर से शुरू करने से रोकता है।
    2. एंट्रल फॉलिकल्स से बढ़ते oocytes को छोड़ने के लिए सर्जिकल सुइयों के साथ पंचर डिम्बग्रंथि के रोम (oocyte विकास20 का अंत)।
    3. खनिजों के तेल के तहत ताजा माध्यम के साथ व्यंजनों में धोने और जाने से पहले, oocyte संग्रह के लिए विशेष माइक्रोपिपेट के साथ प्रयोगों (बढ़ते और / या पूरी तरह से विकसित oocytes) के लिए आवश्यक आकार के oocytes इकट्ठा करें।
  2. यंत्रवत् ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा एंट्रल कूपिक कोशिकाओं से oocytes को अलग करें और बाद के प्रयोगात्मक चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 1 घंटे के लिए स्थिर करने के लिए छोड़ दें।
    नोट: सभी प्रयोगात्मक चरणों के दौरान oocytes 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, सबसे बड़े oocytes, जो पूरी तरह से विकसित होते हैं, एकत्र किए गए थे।

2. Oocyte microinjection

नोट: साइटोप्लाज्म में साइटोस्केलेटन-आधारित गतिविधि को पकड़ने के लिए, ब्राइटफील्ड लाइव-इमेजिंग का उपयोग किया जाता है। फ्लोरोसेंट मार्करों का माइक्रोइंजेक्शन इसलिए आवश्यक नहीं है, और प्रोटोकॉल को चरण 3 पर फिर से शुरू किया जा सकता है। परमाणु रूपरेखा की छवि के लिए, रंगो, इसके एन-टर्मिनस पर वाईएफपी टैग प्रदर्शित करने वाली एक जांच और इसके सी-टर्मिनस 21,22 पर एक सीएफपी टैग का उपयोग किया गया था। जब 488 एनएम पर oocytes में imaged, यह पूरे नाभिक लेबल, न्यूक्लियोलस23 को छोड़कर, और एक बहुत तेज परमाणु रूपरेखा प्रदर्शित करता है. परमाणु धब्बों की कल्पना करने के लिए, SRSF2-GFP (NM_011358), परमाणु धब्बों11 का एक मार्कर का उपयोग किया गया था। एक ही माध्यम का उपयोग oocyte संग्रह, माइक्रोइंजेक्शन, पूरक आरएनए अनुवाद और लाइव सेल इमेजिंग के लिए किया जाता है।

  1. AgeI प्रतिबंध एंजाइमों के साथ SfiI या SRSF2-GFP प्लाज्मिड के साथ रंगो प्लाज्मिड को रैखिक करें।
  2. प्रमोटर (रंगो के लिए T3 और SRSF2-GFP के लिए T7) के अनुसार इन विट्रो प्रतिलेखन किट में उपयुक्त के साथ छाया हुआ मानार्थ RNAs (सीआरएनए) संश्लेषित करें और उन्हें एक स्तंभ शुद्धि किट का उपयोग करके शुद्ध करें, जैसा कि पहले24 वर्णित है।
    नोट: पॉलीएडेनाइलेट एसआरएसएफ 2-जीएफपी आरएनए सीआरएनए स्थिरता बढ़ाने के लिए पॉलीएडेनाइलेशन किट का उपयोग करना। प्लास्मिड रीढ़ की हड्डी में अंतर के कारण दो अलग-अलग प्रमोटरों का उपयोग किया जाता है।
  3. एक microvolume स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर सीआरएनए सांद्रता को मापें.
  4. डीएच2ओ में रंगो सीआरएनए को 1000 एनजी/जेडएल और एसआरएसएफ2-जीएफपी सीआरएनए को 600 एनजी/जेडएल तक पतला करें।
  5. माइक्रोइंजेक्शन से पहले 25,000 x ग्राम पर कम से कम 60 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र सीआरएनए विभाज्य।
  6. YFP-रंगो या SRSF2-GFP के लिए cRNAs कोडिंग इंजेक्ट करें जैसा कि11,25 में वर्णित है, एक माइक्रोइंजेक्टर का उपयोग करके 37 डिग्री सेल्सियस एम 2 + बीएसए + मिल्रिनोन माध्यम में oocytes के साइटोप्लाज्म में।
  7. सीआरएनए अनुवाद के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति माध्यम में कम से कम 2 घंटे के लिए oocytes सेते हैं।
  8. खनिज तेल के साथ कवर ग्लास तल के साथ एक 35 मिमी टिशू कल्चर डिश पर छोटे (5 माइक्रोन) संस्कृति मध्यम बूंदों में oocytes जमा. पड़ोसी oocytes के photobleaching से बचने के लिए छोटी बूंद प्रति एक oocyte रखें.

3. लाइव सेल इमेजिंग

नोट: लाइव माउस oocytes एक एक औंधा confocal एक योजना के साथ सुसज्जित के साथ जांच की गई- एपीओ 40x / 1.25 एनए तेल विसर्जन उद्देश्य, एक मोटर चालित स्कैनिंग डेक, एक इनक्यूबेशन कक्ष (37 डिग्री सेल्सियस), एक सीसीडी कैमरा एक फिल्टर व्हील के लिए युग्मित, और एक कताई डिस्क. उच्च लौकिक संकल्प छवियों धारा अधिग्रहण मोड में Metamorph (इसके बाद इमेजिंग सॉफ्टवेयर के रूप में संदर्भित) का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं.

  1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर की एक्वायर विंडो खोलें।
  2. एक्सपोज़र समय को 500 एमएस पर सेट करें, फुल चिप पर कैमरा क्षेत्र और 1 पर बिनिंग करें।
  3. प्राप्त करें टैब में, आवश्यक चैनल के लिए रोशनी सेट करें। साइटोप्लाज्मिक गतिविधि की छवि के लिए, प्रेषित प्रकाश के साथ oocytes को रोशन करें। YFP-रंगो या SRSF2-GFP के साथ लेबल नाभिक छवि के लिए, 491 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ oocytes रोशन.
  4. साइटोप्लाज्मिक सरगर्मी या वाईएफपी-रंगो प्रयोगों के लिए, ओओसाइट न्यूक्लियोलस पर ध्यान केंद्रित करें जिसे आसानी से प्रेषित प्रकाश(चित्रा 3ए)के साथ देखा जा सकता है। एक एकल विमान का अधिग्रहण किया जाएगा। परमाणु धब्बेदार प्रयोगों के लिए, एसआरएसएफ2-जीएफपी बूंदों(चित्रा 3सी)पर ध्यान केंद्रित करें।
  5. विशेष टैब में, नीचे के रूप में अधिग्रहण की गति को अनुकूलित करने के लिए पैरामीटर सेट करें।
    कैमरा शटर: एक्सपोज़र के लिए खुला
    स्पष्ट मोड: स्पष्ट अनुक्रम
  6. इमेजिंग सॉफ्टवेयर की स्ट्रीम अधिग्रहण विंडो खोलें। प्रयोग के अनुसार स्ट्रीमिंग पैरामीटर सेट करें। दोनों अध्ययनों10,11 के लिए, नीचे वर्णित मापदंडों का उपयोग करें.
    1. प्राप्त करें टैब में, निम्न पैरामीटर सेट करें.
      अधिग्रहण मोड: रैम के लिए स्ट्रीम
      फ्रेम की संख्या: 480 (इमेजिंग समय को कम करने के लिए 240 फ्रेम तक घटाया जा सकता है)
      कैमरा पैरामीटर: फ्रेम दर पर चित्र प्राप्त करें
      छोड़ने के लिए फ़्रेम की संख्या (Nb): 0
    2. डिजिटल कैमरा नियंत्रक पैरामीटर टैब में, निम्न पैरामीटर सेट करें।
      कैमरा स्थिति: HALT
      शटर मोड: कभी नहीं खुला
      स्पष्ट मोड: स्पष्ट अनुक्रम
      औसत से फ़्रेम का Nb: 1
      नोट 1: स्ट्रीम मोड में, एक बार एक्सपोज़र समय सेट हो जाने के बाद, मूवी की अवधि फ़्रेम की संख्या से निर्धारित होती है। उदाहरण के लिए, 500 एमएस एक्सपोजर समय और 480 फ्रेम 4 मिनट की फिल्म उत्पन्न करते हैं। छवि अधिग्रहण के दौरान एक पूर्वावलोकन प्रदर्शित किया जा सकता है।
  7. ऑब्जेक्ट के चारों ओर रुचि का क्षेत्र (ROI) समायोजित करें। आरओआई के क्षेत्र को कम करने से अधिग्रहण का समय कम हो जाता है।
  8. मूवी लॉन्च करने के लिए स्ट्रीम एक्विजिशन विंडो में एक्वायर पर क्लिक करें।
  9. अधिग्रहण के अंत में चलचित्र को .tif फ़ाइल के रूप में सहेजें.
    नोट: उच्च अस्थायी संकल्प फिल्मों के दौरान परमाणु संरचनाओं का पालन करने के लिए, परमाणु जांच (वाईएफपी-रंगो और एसआरएसएफ 2-जीएफपी) में छवि विश्लेषण के आगे के चरणों के दौरान वस्तुओं के विभाजन की सुविधा के लिए एक उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात होना चाहिए। बहिर्जात एसआरएसएफ2-जीएफपी अभिव्यक्ति प्रोफाइल अंतर्जात परमाणु धब्बेदार इम्यूनोस्टेनिंग(चित्रा 3सी-डी)के बराबर होना चाहिए। अंतर्जात धुंधला के सापेक्ष एसआरएसएफ 2-जीएफपी अभिव्यक्ति प्रोफाइल में परिवर्तन सीआरएनए इंजेक्शन और अनुवाद26(चित्रा 3सी-डी)की उच्च खुराक को प्रतिबिंबित कर सकता है।

4. छवि विश्लेषण: साइटोप्लाज्मिक सरगर्मी

नोट: साइटोप्लाज्मिक सरगर्मी जो oocytes में एक्टिन-आधारित साइटोस्केलेटल गतिविधि की तीव्रता को दर्शाती है, प्रयोगशाला9 के पिछले प्रकाशन से एक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि सहसंबंध विश्लेषण द्वारा निर्धारित की जाती है और27 पर उपलब्ध है। सॉफ्टवेयर मापता है कि लगातार छवियों के बीच कितनी पिक्सेल तीव्रता संरक्षित है। आउटपुट समय में छवियों के बीच सहसंबंध का नुकसान है, 1 से शुरू होता है और समय के साथ तेजी से घटता है, जैसा कि9 में है।

  1. कच्चे समय चूक छवियों संरेखित (Δt = 0.5 एस) फिजी StackReg प्लगइन का उपयोग (प्लगइन्स>StackReg). प्लगइन StackReg28 स्थापित करने के लिए, प्लगइन तक पहुंच प्राप्त करने के लिए BIG-EPFL अपडेट साइट29 को सक्षम करें।
  2. नीचे दिए गए चरणों का पालन करते हुए ~ 300 माइक्रोन2 के 3 से 4 साइटोप्लाज्मिक क्षेत्रों में उज्ज्वल-क्षेत्र छवि सहसंबंधों की गणना करें।
    1. क्षेत्रों काट-छाँट और उन्हें अलग चलचित्र फ़ाइलों के रूप में सहेजें. टर्मिनल विंडो खोलें।
    2. oocyte टाइप करें, स्पेस बार दबाएं और फिर एंटर दबाएं। सिग्नल और स्लॉट नामक एक विंडो दिखाई देती है। क्रॉप की गई मूवी फ़ाइलें चुनें जिनका विश्लेषण किया जाएगा।
      नोट: एक ही समय में कई फिल्मों का चयन किया जा सकता है।
  3. एप्लिकेशन फ़ाइलों को फिल्मों के समान फ़ोल्डर में लौटाता है। .csv, .eps और .xls एक्सटेंशन वाली तीन अलग-अलग फाइलें उत्पन्न होती हैं। .xls फ़ाइल में एक क्षेत्र के लिए सहसंबंध प्लॉट आकर्षित करने के लिए डेटा होता है। एक सेल के भीतर विभिन्न क्षेत्रों से औसत सहसंबंध मान।
  4. दृश्य स्पष्टता उद्देश्यों के लिए, 11 के रूप में एक उल्टे घातीय जैसे वक्र प्राप्त करने के लिए 1 से प्रत्येक टाइमपॉइंट के मूल्य को घटाकर अंतिम सहसंबंध मूल्यों को बदलें।

5. छवि विश्लेषण: साइटोप्लाज्मिक वेक्टर मानचित्र

नोट: माउस oocyte cytoplasmic वेक्टर नक्शे Spatiotemporal छवि सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (STICS) प्लगइन30 पहले फिजी 32 पर माउस oocytes31 में cytoplasmic प्रवाह का पता लगाने के लिए लागू और 33 पर उपलब्ध द्वारा उत्पन्न किए गए थे. नक्शे साइटोप्लाज्मिक प्रवाह वेग परिमाण और दिशा दिखाते हैं, जैसा कि9 और11 में है।

  1. ब्राइट-फील्ड टाइम-लैप्स इमेज (Δt = 0.5 s) को 32-बिट फॉर्मेट में बदलें।
  2. StackReg > Plugins में फिजी StackReg प्लगइन के साथ छवियों को पुन: संरेखित करें और कठोर शरीर परिवर्तन चुनें।
  3. प्लगइन स्टैक घटाव मूविंग एवरेज jru v2 (STICS प्लगइन्स सूट के Detrend टूल्स में) के साथ, फिल्म की समय-औसत छवि को घटाकर फिल्म में स्थिर संरचनाओं से छुटकारा पाएं। चेक बॉक्स स्टेटिक एवरेज और आउटपुट सब स्टैक घटाएं, स्थानिक औसत बनाए रखें और 5 पर अवधि निर्धारित करें।
  4. प्लगइन के सीमा प्रभाव से बचने के लिए प्रांतस्था को छोड़कर, oocyte के चारों ओर एक ROI ड्रा करें।
  5. 32 पिक्सल के उपक्षेत्र आकार, 16 पिक्सल के चरण आकार, 3 के एसटीआईसीएस अस्थायी शिफ्ट, 0 के एक्स और वाई ऑफसेट, 8 के वेग गुणक, परिमाण थ्रेसहोल्ड के साथ एसटीआईसीएस मानचित्र जूनियर वी 2 प्लगइन (आईसीएस टूल में) लॉन्च करें और वेक्टर लंबाई, केंद्र वैक्टर, आउटपुट वेग को सामान्य करने और मूवी मास्क का उपयोग करने के चेक बॉक्स के साथ।
    नोट: प्लगइन .tif प्रारूप में oocyte का एक नक्शा उत्पन्न करता है, प्रवाह आयाम का संकेत देने वाले रंगों के साथ वैक्टर के रूप में साइटोप्लाज्मिक प्रवाह प्रदर्शित करता है, जैसा कि9 और11 में है, और मापा प्रवाह वेग के साथ एक एक्सेल फ़ाइल।

6. छवि विश्लेषण: परमाणु रूपरेखा में उतार-चढ़ाव

नोट: परमाणु रूपरेखा में उतार-चढ़ाव जो परमाणु झिल्ली आंदोलन को प्रतिबिंबित करता है, वाईएफपी-रंगो (चित्रा 4 ए, सी) के साथ लेबल किए गए नाभिक की फिल्मों से निर्धारित किया जा सकता है। परमाणु रूपरेखा में उतार-चढ़ाव के लिए छवि विश्लेषण के लिए फिजी और प्लगइन्स स्टैकरेग की स्थापना की आवश्यकता होती है (स्टैकरेग प्लगइन तक पहुंच प्राप्त करने के लिए बीआईजी-ईपीएफएल अपडेट साइट29 को सक्षम करें), प्योरडेनोइस34 और Ovocyte_nucleus। StackReg प्लगइन संभव वैश्विक गति के लिए सही करने के लिए छवियों पंजीकरण करता है. PureDenoise प्लगइन मिश्रित पॉइसन-गाऊसी शोर द्वारा दूषित बहुआयामी छवियों के शोर को हटा देता है और परमाणु रूपरेखा को सुचारू करता है। Ovocyte_nucleus प्लगइन सिग्नल को थ्रेशोल्ड करता है और बाइनरी न्यूक्लियस मास्क बनाने के लिए न्यूक्लियोलस के अनुरूप छेद को भरता है, इसे स्टैकरेग के साथ पुन: संरेखित करता है और नाभिक मास्क के केन्द्रक से दूरी r की गणना सभी θ कोणों के लिए मास्क की परिधि तक करता है (θ° 0° से 360° 1° वेतन वृद्धि), जैसा कि चित्र 4 में है। इन प्लगइन्स के लिए सभी कोड 35 पर पाए जा सकते हैं।

  1. फिजी पर, CIRB > Verlhac मेनू > प्लगइन्स में, Ovocyte न्यूक्लियस शेप चुनें।
  2. संवाद बॉक्स में, निम्न चयन करें।
    1. विश्लेषण करने के लिए फिल्मों वाले फ़ोल्डर का चयन करें।
    2. θ कोण का चयन करें (1° से 360° तक का मान चुना जा सकता है और इष्टतम रूपरेखा संकल्प के लिए 1° का मान उपयोग किया गया था), क्रॉपिंग के लिए मार्जिन (पूरे नाभिक को बनाए रखने के लिए 5 माइक्रोन की सिफारिश की जाती है)।
    3. XY अंशांकन और समय अंतराल का चयन करें। ओके पर क्लिक करें।
      नोट: परिणाम मूल चलचित्र वाले फ़ोल्डर में एक आउट फ़ोल्डर में .xls फ़ाइलों के रूप में प्रदान किए जाते हैं। यह फाइल प्रत्येक बार t और प्रत्येक कोण θ के लिए सभी मापी गई त्रिज्या r प्रदर्शित करती है। आउटपुट फ़ाइल का एक उदाहरण पूरक तालिका 1 में प्रदान किया गया है। आउट फोल्डर में न्यूक्लियस मास्क की एक फिल्म भी होती है।
  3. एक स्प्रेडशीट का उपयोग करके, प्रत्येक परिभाषित θ कोण के लिए सभी समय बिंदुओं t पर माध्य त्रिज्या R की गणना करें। यह समय के साथ मतलब आकार साजिश करने के लिए अनुमति देता है(चित्रा 4बी). अनुपूरक तालिका 2 में उदाहरण देखें।
  4. प्रत्येक ज तथा θ के लिए समय के साथ माध्य त्रिज्या त् को त्रिज्या त से घटाइए। विचरण (r-R)2 परमाणु लिफाफे में उतार-चढ़ाव का एक उपाय है।
  5. एक शर्त से सभी समय बिंदुओं ज तथा प्रत्येक नाभिक के लिए सभी कोणों θ तथा अंततः सभी नाभिकों के लिए उतार-चढ़ाव के माध्य की गणना कीजिए।
    नोट: जब नाभिक के आकार में काफी बदलाव किया जाता है जैसे कि बाधित साइटोस्केलेटन के मामले में, वाईएफपी-रंगो के साथ लेबल किए गए नाभिक को फिजी पर घुमाया जाता है ताकि चिकनी भाग को ऊपर और आक्रमण को नीचे किया जा सके, परमाणु रूपरेखा उतार-चढ़ाव के विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने से पहले,जैसा कि 10 में है।

7. छवि विश्लेषण: परमाणु धब्बेदार आंदोलनों (विसारक गतिशीलता)

नोट: परमाणु धब्बेदार आंदोलन विश्लेषण उनके ट्रैक से उन जीवों की गतिशीलता (संचालित, विसारक, या सीमित) के प्रकार को कम करने की अनुमति देता है।

  1. एसआरएसएफ 2-जीएफपी बूंदों को व्यक्त करने वाले oocytes की स्ट्रीम-मोड छवियों का चयन करें जो मुख्य रूप से X-Y अक्ष में चलती हैं।
  2. फिजी में हिस्टोग्राम मिलान विधि का उपयोग करके SRSF2- GFP व्यक्त करने वाले oocytes की समय-चूक छवियों के विरंजन के लिए सही (छवि > > ब्लीच सुधार समायोजित करें)।
  3. फिजी स्टैकरेग प्लगइन के साथ छवियों को पुन: संरेखित करें.
  4. फिजी मैनुअल ट्रैकिंग प्लगइन (ट्रैकिंग > मैनुअल ट्रैकिंग > प्लगइन्स) का उपयोग करके SRSF2-GFP छोटी बूंद केंद्रों को ट्रैक करें। ट्रैकिंग शुरू करने के लिए ट्रैक जोड़ें दबाएं और समाप्त होने पर एंड ट्रैक दबाएं। केंद्रित सुधार सक्रिय न करें।
  5. 11 में के रूप में अस्थायी मतलब वर्ग विस्थापन (एमएसडी) गणना के साथ आगे बढ़ने के लिए एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए कॉपी पटरियों, और प्रत्येक 20 एस छोटी बूंद प्रक्षेपवक्र से लौकिक एमएसडी की गणना.
  6. प्रसार घातांक अल्फा (α) का अनुमान लगाने के लिए R सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके नेल्डर-मीड विधि के साथ फ़िट घटता (msd(t) = बीटा x tα)।
  7. विभिन्न स्थितियों की तुलना करने में सक्षम होने के लिए प्रभावी प्रसार गुणांक को मापें क्योंकि प्रसार विषम होने की उम्मीद है (α< 1)।
  8. लौकिक एमएसडी वक्र के 40 पहले बिंदुओं (20 एस) पर एक रैखिक फिट (अल्फा = 1) से प्रभावी प्रसार गुणांक डीईफ की गणना करें और छोटी बूंद आकार (माइक्रोनमें डी ईएफएफ 2/एस एक्स 3/2 π आर में माइक्रोन) द्वारा सामान्यीकृत करें।

8. छवि विश्लेषण: परमाणु धब्बेदार सतह में उतार-चढ़ाव

नोट: समय में परमाणु धब्बेदार समोच्च विकास, इन जीवों पर सक्रिय बल संचरण का एक रीड-आउट, फिजी में उपयोग के लिए एक कस्टम-निर्मित प्लगइन रेडियोक36 के साथ मापा गया था और37 पर उपलब्ध था। प्लगइन चयन केंद्र के चारों ओर सभी कोणों के लिए दिए गए चयन के त्रिज्या के मूल्यों को निकालता है। समय के साथ आकार भिन्नता को प्रत्येक कोण के लिए इसके औसत मूल्य के सापेक्ष त्रिज्या के मूल्य की तुलना करके मापा गया था। प्लगइन आकार में उतार-चढ़ाव की मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है और इन गतिशीलता की कल्पना करने का विकल्प प्रदान करता है। इसे स्थापित करने के लिए, Radioak_.jar फ़ाइल डाउनलोड करें और इसे फिजी के प्लगइन्स फ़ोल्डर में रखें। फिजी को पुनरारंभ करें। यह प्लगइन प्लगइन का एक अद्यतन संस्करण है जिसका उपयोग ऊपर परमाणु रूपरेखा के उतार-चढ़ाव का विश्लेषण करने और तुलनीय पाइपलाइन को लागू करने के लिए किया जाता है।

  1. एसआरएसएफ 2-जीएफपी बूंदों की स्ट्रीम फिल्मों में, तुलनीय आकार (त्रिज्या ~ 2.5 माइक्रोन) की बड़ी बूंदों का चयन करें।
    नोट: यदि बूंदें बहुत छोटी हैं, तो अपर्याप्त रिज़ॉल्यूशन से सतह में उतार-चढ़ाव माप होगा।
  2. छोटी बूंद के चारों ओर एक आयत खींचकर 15 एस (Δt = 0.5 एस) फैले बूंदों की फसल समय चूक छवियों और फसल (चित्रा 5) > छवि का चयन करें।
  3. StackReg > Plugins में फिजी StackReg प्लगइन के साथ छवियों को पुन: संरेखित करें और कठोर शरीर परिवर्तन चुनें।
  4. प्रक्रिया के तहत फिजी स्मूथन विकल्प का उपयोग करके छोटी बूंद के आसपास शोर को दूर करने के लिए छवि को चिकना करें।
  5. प्रक्रिया > बाइनरी के तहत फिजी में कन्वर्ट टू मास्क विकल्प का उपयोग करके छोटी बूंद का बाइनरी मास्क बनाएं। पृष्ठभूमि के लिए डिफ़ॉल्ट विधि और अंधेरे का उपयोग करें (चित्र 5)।
  6. विश्लेषण के तहत फिजी में कणों का विश्लेषण करें विकल्प का उपयोग करके उत्पन्न बाइनरी ड्रॉपलेट मास्क का विश्लेषण करें, स्पष्ट परिणाम चुनें और प्रबंधक विकल्पों में जोड़ें और RoiManager (अधिक > सहेजें) में रुचियों के क्षेत्र (ROIs) को ज़िप प्रारूप में सहेजें Radioak द्वारा पढ़ा जाना चाहिए। ROI को फिल्मों के एक ही फ़ोल्डर में contours नामक फ़ोल्डर में सहेजा जाना चाहिए, imagename नामक फ़ाइलों में_UnetCortex.zip प्रत्येक फिल्म को Radioak द्वारा पाया जाना चाहिए।
  7. CIRB > Radioak मेनू > फिजी प्लगइन्स में, या तो केवल एक मूवी को संसाधित करने के लिए रेडी प्राप्त करें या एक ही फ़ोल्डर की सभी फिल्मों का विश्लेषण करने के लिए एक फ़ोल्डर करें।
    नोट: कोण संख्या और पैमाने का चयन करने के लिए एक विंडो पॉप अप होती है। Radioak को 0° से 360° (360 के इनपुट) तक 1° कोण वृद्धि के साथ लॉन्च किया गया था और त्रिज्या मान निकाले गए थे।
  8. विश्लेषण करने के लिए चलचित्र या चलचित्र वाले फ़ोल्डर का चयन करें. परिणाम मूल फिल्मों वाले फ़ोल्डर में एक radioakres निर्देशिका में .xls फ़ाइलों (प्रत्येक फिल्म के लिए एक) के रूप में प्रदान किए जाते हैं। प्रत्येक फ़ाइल सभी मापा त्रिज्या आर प्रदर्शित करता है (माइक्रोन में अगर पैमाने पैरामीटर भरा गया था) प्रत्येक बार टी (स्लाइस में) और प्रत्येक कोण (रेडियन में; चित्रा 5; पूरक तालिका 3 में .xls आउटपुट का उदाहरण देखें)।
  9. स्प्रेडशीट में, प्रत्येक परिभाषित कोण के लिए सभी समय बिंदुओं टी पर माध्य त्रिज्या आर की गणना करें ( पूरक तालिका 4 में उदाहरण देखें)। यह समय के साथ माध्य आकार को प्लॉट करने की अनुमति देता है।
  10. माइक्रोन2 में विचरण (आर-आर)2 को प्लॉट करें जो छोटी बूंद सतह के उतार-चढ़ाव के माप से मेल खाती है।

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Representative Results

चित्रा 3 में छवि पैनल एक ठेठ पूरी तरह से विकसित oocyte (चित्रा 3A) के उदाहरण दिखाते हैं, वाईएफपी-रंगो (चित्रा 3 बी) को व्यक्त करने वाले पूरी तरह से विकसित oocyte में न्यूक्लियोप्लाज्म, एक पूरी तरह से विकसित oocyte में न्यूक्लियोप्लाज्म एक सही (बाएं पैनल; चित्र 3C) या एक अत्यधिक (दायां पैनल; चित्र 3C) एसआरएसएफ 2-जीएफपी सीआरएनए की खुराक, और एससी 35 एंटीबॉडी (चित्रा 3 डी) का उपयोग करके पूरी तरह से विकसित ओओसाइट में परमाणु धब्बों का एक इम्यूनोस्टेनिंग। माइक्रोइंजेक्शन के लिए एसआरएसएफ 2-जीएफपी सीआरएनए की सही खुराक को परमाणु धब्बों के अंतर्जात प्रोफाइल के साथ एसआरएसएफ 2-जीएफपी की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के बीच दृश्य तुलना के आधार पर परिभाषित किया गया था।

ओसाइट्स में साइटोप्लाज्मिक सरगर्मी बलों, जैसा कि एसटीआईसीएस वेक्टर मैप्स और छवि सहसंबंध विश्लेषण (9 और11 देखें) का उपयोग करके प्रयोगशाला से पिछले काम द्वारा दिखाया गया है, साइटोस्केलेटल गड़बड़ी से कम किया जा सकता है, दोनों आनुवंशिक (जैसे, एफएमएन 2-उत्परिवर्ती माउस) और रासायनिक (जैसे, साइटोकैलासिन डी)। नियंत्रण oocytes के STICS मानचित्र कई वैक्टर प्रदर्शित करते हैं, जिसमें रंग उच्च प्रवाह वेग का संकेत देते हैं, जबकि बाधित साइटोस्केलेटल बलों वाले oocytes के नक्शे कम वैक्टर प्रदर्शित करते हैं, जिसमें रंग कम प्रवाह वेग का संकेत देते हैं। इसी तरह, बाधित साइटोस्केलेटल बलों के साथ oocytes की तुलना में नियंत्रण oocytes में छवि सहसंबंध बहुत तेजी से खो जाता है। यह सहसंबंध घटता पर अवलोकन योग्य है, बाधित साइटोस्केलेटल बलों9 या वक्र11 के साथ उल्टा होने पर oocytes की तुलना में नियंत्रण oocytes के लिए वक्र की तेजी से कमी के साथ।

साइटोस्केलेटल बलों नाभिक और उसके आंतरिक अंगों, विशेष रूप से परमाणु धब्बों10,11 की तरह परमाणु घनीभूत आंदोलन. चित्रा 4 ए में, नियंत्रण oocytes के नाभिक को महत्वपूर्ण परिधीय उतार-चढ़ाव के अधीन किया जाता है, जो परमाणु जांच YFP-Rango का उपयोग करके दिखाई देता है। बाधित साइटोस्केलेटल बलों के साथ oocytes में नाभिक आकार समय (चित्रा 4C) के दौरान स्थिर है। परमाणु रूपरेखा के उतार-चढ़ाव का विश्लेषण आंदोलन को सटीक रूप से मापने के लिए महत्वपूर्ण है। नाभिक केन्द्रक से इसकी परिधि तक की दूरी के विचरण का निर्धारण करके, (आर-आर)2(चित्रा 4बी), उतार-चढ़ाव की मात्रा निर्धारित की जा सकती है, यह दर्शाता है कि परमाणु आंदोलन बाधित साइटोस्केलेटल बलों10के साथ oocytes की तुलना में नियंत्रण oocytes में 6 गुना अधिक है। चित्रा 5ए-बी में, परमाणु धब्बों (एसआरएसएफ2-जीएफपी + बूंदों) को उच्च अस्थायी संकल्प पर साइटोप्लाज्मिक बलों के नियंत्रण और बाधित संदर्भों में दिखाया गया है। नियंत्रण में, छोटी बूंद की सतह बाधित साइटोप्लाज्मिक बलों के साथ oocytes में छोटी बूंद सतहों की तुलना में काफी अधिक उतार-चढ़ाव करती है, जिसे Radioak32 प्लगइन का उपयोग करके कल्पना और मात्रा निर्धारित की जा सकती है। नेत्रहीन, हरे और लाल रंग (चित्रा 5A-B के नीचे छवियों पर देखा Radioak आउटपुट) कोण जहां प्लगइन लगातार छवियों और सफेद के बीच सतह परिवर्तन का पता चला सतह परिवर्तन की कमी इंगित करता है इंगित करते हैं.

Figure 1
चित्रा 1: देर से माउस oogenesis और प्रारंभिक भ्रूणजनन का चित्रण. नाभिक केंद्रीकरण का चित्रण जो देर से ओओसाइट विकास में होता है, गुणसूत्र बंद केंद्र जो ओओसाइट विभाजन के दौरान होता है, और भ्रूणजनन के शुरुआती चरण (1-कोशिका और 2-कोशिका चरण)। मादा जीनोम (oocyte नाभिक और महिला pronucleus) गुलाबी रंग में हैं, पुरुष pronucleus नीले रंग में है। भ्रूण नाभिक (पैतृक जीनोम के संलयन के बाद) बैंगनी हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: बढ़ते माउस oocytes में तराजू भर में साइटोप्लाज्मिक और परमाणु रीमॉडेलिंग का चित्रण। यह आंकड़ा 9,10,11 से प्रमुख निष्कर्षों को सारांशित करता है। "साइटोप्लाज्म के एक्टोमायोसिन-आधारित रीमॉडेलिंग, परमाणु आंदोलन, और स्थानिक टेम्पोरल तराजू में कार्यात्मक परमाणु बायोमोलेक्यूलर कंडेनसेट रीमॉडेलिंग का चित्रण"। परमाणु धब्बों का स्केल-क्रॉसिंग रीमॉडेलिंग उनके कार्य से जुड़े जैव-आणविक प्रतिक्रियाओं को बढ़ाता है (यानी, प्री-एमआरएनए का विभाजन)। ध्यान दें कि यह प्रोटोकॉल केवल स्थानिक तराजू में परमाणु आंदोलन के आकलन की अनुमति देता है, लेकिन लौकिक लोगों को नहीं, क्योंकि सभी इमेजिंग छवि फ्रेम के बीच 0.5 एस के समान अस्थायी संकल्प के साथ किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: पूरी तरह से विकसित oocyte और न्यूक्लियोप्लाज्म की नमूना छवियों. (ए) क्रोमैटिन दिखा एक पूरी तरह से विकसित oocyte की उज्ज्वल क्षेत्र छवि (सियान) कि न्यूक्लियोलस घेर. एक बिंदीदार सफेद वृत्त नाभिक को रेखांकित करता है। (बी) वाईएफपी-रंगो व्यक्त करने वाले लाइव ओओसाइट नाभिक; न्यूक्लियोलस में प्रतिदीप्ति की अनुपस्थिति पर ध्यान दें। (सी) सीआरएनए (बाएं पैनल) की सही खुराक या सीआरएनए (दाएं पैनल) की उच्च खुराक के माइक्रोइंजेक्शन के बाद एसआरएसएफ 2-जीएफपी व्यक्त करने वाले लाइव ओओसाइट नाभिक का उदाहरण; बाईं ओर संघनित (बूंद) और भंग चरणों और दाईं ओर की स्थिति में उनकी अनुपस्थिति पर ध्यान दें। (डी) एक निश्चित oocyte में परमाणु धब्बेदार immunostaining; अंतर्जात अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल पर ध्यान दें जो सी (बाएं पैनल) में एक के बराबर है। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: नियंत्रण के प्लगइन आउटपुट और बाधित परमाणु रूपरेखा उतार-चढ़ाव। (ए) वाईएफपी-रंगो (शीर्ष) और Ovocyte_nucleus प्लगइन (नीचे) द्वारा उत्पन्न इसके संबंधित बाइनरी मास्क को व्यक्त करने वाले नियंत्रण ओओसाइट नाभिक का समय-चूक। (बी) परमाणु रूपरेखा उतार-चढ़ाव का सिद्धांत समय के साथ और किसी दिए गए दिशा में माप। दिशाओं को 0° से 360° तक 1° की वृद्धि के परिक्रामी कोण θ द्वारा परिभाषित किया जाता है। टी = 0 एस (पीला) और टी = 135 एस (बैंगनी) पर दो प्रतिनिधि आकृतियों का प्रतिनिधित्व किया जाता है। नीला आकार समय के साथ औसत आकार से मेल खाता है। (सी) एफ-एक्टिन (एफएमएन 2-उत्परिवर्ती माउस) और सूक्ष्मनलिकाएं (नोकोडाजोल उपचार;10 के रूप में) दोनों के विघटन के कारण साइटोस्केलेटल बलों में कमी के साथ एक ओओसाइट में एक नाभिक के उतार-चढ़ाव की परमाणु रूपरेखा। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: नियंत्रण और बाधित छोटी बूंद सतह के उतार-चढ़ाव के प्लगइन आउटपुट। (ए) एक नियंत्रण एसआरएसएफ 2-जीएफपी परमाणु छोटी बूंद की फसल प्रति फ्रेम 500 एमएस पर चित्रित की गई और आइस लुक अप टेबल (एलयूटी) (शीर्ष) में दिखाया गया; फिजी (केंद्र) द्वारा उत्पन्न एक ही छोटी बूंद का द्विआधारी मुखौटा; और रेडियोक प्लगइन छोटी बूंद (नीचे) की सतह में उतार-चढ़ाव के विश्लेषण के बाद आउटपुट, हरे और लाल रंग के साथ कोण को इंगित करता है जहां प्लगइन ने लगातार छवियों और सफेद के बीच सतह परिवर्तन का पता लगाया जो सतह परिवर्तनों की कमी का संकेत देता है। (बी) एफ-एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं (11 के रूप में) दोनों के विघटन के कारण कम साइटोस्केलेटल बलों के साथ oocytes में एक परमाणु छोटी बूंद की सतह में उतार-चढ़ाव। स्केल सलाखों = 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 1: Ovocyte_nucleus प्लगइन विश्लेषण आउटपुट का उदाहरण। चित्रा 4 ए में दिखाए गए एक के रूप में एक ही नाभिक का विश्लेषण किया गया। थीटा (θ) डिग्री में कोण है और t1 से t600 फ्रेम संख्या के अनुरूप है, जिसे समय में परिवर्तित किया जा सकता है। त्रिज्या माइक्रोन में हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 2: परमाणु रूपरेखा उतार-चढ़ाव की गणना करने के लिए उपयोग की जाने वाली नमूना स्प्रेडशीट। चित्रा 4 ए में दिखाए गए एक के रूप में एक ही नाभिक का विश्लेषण किया गया। थीटा (θ) डिग्री में कोण है और t1 से t600 फ्रेम संख्या के अनुरूप है, जिसे समय में परिवर्तित किया जा सकता है। टैब रॉ और औसत: त्रिज्या माइक्रोन में हैं। टैब आर-आर: आर-आर दूरी माइक्रोन में है। तालिका (आर-आर) 2: उतार-चढ़ाव मान माइक्रोन2 में हैं। टैब x और y रॉ और औसत टैब से त्रिज्या के कार्टेशियन निर्देशांक के अनुरूप हैं। वे माध्य आकार टैब में समय के साथ नाभिक के माध्य आकार को आकर्षित करने की अनुमति देते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 3: रेडियोक प्लगइन विश्लेषण आउटपुट का उदाहरण। चित्रा 5 ए में दिखाए गए एक के रूप में एक ही बूंद का विश्लेषण किया गया। अलग-अलग समय बिंदुओं और कोणों पर मापी गई त्रिज्या दिखाई जाती है। त्रिज्या माइक्रोन में हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुपूरक तालिका 4: नमूना स्प्रेडशीट परमाणु छोटी बूंद सतह में उतार-चढ़ाव की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया. चित्रा 5 ए में दिखाए गए एक के रूप में एक ही बूंद का विश्लेषण किया गया। थीटा (θ) डिग्री में कोण है और t1 से t600 फ्रेम संख्या के अनुरूप है, जिसे समय में परिवर्तित किया जा सकता है। टैब रॉ और औसत: त्रिज्या माइक्रोन में हैं। टैब आर-आर: आर-आर दूरी माइक्रोन में है। तालिका (आर-आर) 2: उतार-चढ़ाव मान माइक्रोन2 में हैं। टैब x और y रॉ और औसत टैब से त्रिज्या के कार्टेशियन निर्देशांक के अनुरूप हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम उनके अस्तित्व या सामान्य समारोह 9,10,11 को प्रभावित किए बिना oocytes के उचित microinjection शामिल, साथ ही परमाणु धब्बों की तरह प्रासंगिक संरचनाओं, के सही दृश्य की अनुमति होगी कि सीआरएनए की पूर्वनिर्धारित मात्रा microinjecting.

साइटोप्लाज्मिक और (इंट्रा) -न्यूक्लियर डायनेमिक्स के बीच लिंक स्थापित करना आवश्यक है जब अध्ययन किया जाता है कि साइटोस्केलेटन नाभिक या उसके इंटीरियर को कैसे उत्तेजित करता है। यह प्रोटोकॉल, मामूली संशोधनों के साथ, अनुमति देता है कि परमाणु YFP-रंगो या SRSF2-GFP छोटी बूंद गतिशीलता (11 के रूप में) के लिए साइटोप्लाज्मिक सरगर्मी तीव्रता को सहसंबंधित करके। आगे बढ़ने के लिए, oocytes पहले साइटोप्लाज्मिक सरगर्मी पर कब्जा करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र मोड में 120 एस के लिए फिल्माया जाना चाहिए, तुरंत परमाणु रूपरेखा या छोटी बूंद गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए एक 491 एनएम लेजर के साथ 120 एस के लिए फिल्माया जा रहा से पहले. परमाणु एसआरएसएफ 2-जीएफपी बूंदों के मामले में, सहसंबंध का आकलन केवल उनके प्रभावी प्रसार गुणांक (इस प्रोटोकॉल में चरण 7 देखें) की तुलना छवि सहसंबंध विश्लेषण का उपयोग करके प्राप्त साइटोप्लाज्मिक सरगर्मी के उल्टे अधिकतम तीव्रता मूल्यों से किया जा सकता है (इस प्रोटोकॉल में चरण 4 देखें)। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु छोटी बूंद सतह के उतार-चढ़ाव के विश्लेषण के लिए चुने गए कंडेनसेट का आकार है। पूर्वाग्रह को रोकने के लिए तुलनात्मक विश्लेषण के लिए एक समान व्यास की बूंदों का चयन किया जाना चाहिए, क्योंकि आकार सतह के उतार-चढ़ाव की तीव्रता को नियंत्रित करता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ सीमाएँ हैं। परमाणु रूपरेखा में उतार-चढ़ाव का विश्लेषण पूर्ण अंतर-परमाणु धुंधला पर निर्भर करता है, जैसे कि वाईएफपी-रंगो या एनएलएस-जीएफपी। परमाणु धब्बों पर विश्लेषण के लिए, एसआरएसएफ2-जीएफपी सीआरएनए की अत्यधिक मात्रा के माइक्रोइंजेक्शन से इस घनीभूत मार्कर (चित्रा 3सी) के चरण पृथक्करण गुणों में स्पष्ट परिवर्तन हो सकता है, जैसा कि पहले अन्य26 द्वारा समीक्षा की गई थी। यह सत्यापित करना कि बहिर्जात प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल अंतर्जात लोगों के बराबर हैं, इसलिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, अपेक्षाकृत छोटी बूंदों (<2 माइक्रोन त्रिज्या) को यहां परिभाषित उपकरणों के साथ स्थानिक संकल्प की सीमाओं के कारण सतह में उतार-चढ़ाव विश्लेषण पाइपलाइनों से बाहर रखा जाना चाहिए। इस संकल्प मुद्दे को आमतौर पर अधिक दृढ़ सूक्ष्मदर्शी के उपयोग से हल किया जा सकता है, जो उदाहरण के लिए, oocyte नाभिक में या दैहिक कोशिकाओं के काफी छोटे नाभिक में छोटे घनीभूत की सतह के उतार-चढ़ाव की जांच करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल तराजू में माउस oocyte नाभिक के एक्टिन और सूक्ष्मनलिका साइटोस्केलेटन-आधारित आंदोलन को पकड़ने की अनुमति देता है। विशेष रूप से, यह साइटोप्लाज्म के साइटोस्केलेटन-आधारित जुटाने, परमाणु रूपरेखा में उतार-चढ़ाव, तरल जैसे परमाणु धब्बेदार विस्थापन और सतह के उतार-चढ़ाव के साथ प्रलेखन की अनुमति देता है। हालांकि अन्य सेल प्रकारों में कुछ अध्ययन व्यक्तिगत स्थानिक तराजू पर अलग-अलग जटिलता के अलग-अलग प्रोटोकॉल के माध्यम से इनमें से कुछ मामलों को 38,39,40 को संबोधित करते हैं, यह सरल प्रोटोकॉल पहली बार एक ही कार्य पाइपलाइन में कई पैमानों पर उल्लिखित सेलुलर गतिशीलता को संबोधित करने के लिए आवश्यक उपकरण प्रदान करता है। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण से उत्पन्न डेटा, जब10,11 में के रूप में बायोफिजिकल मॉडलिंग के साथ पूरक, के एक न्यूनतम इनवेसिव मूल्यांकन सक्षम: मैं) परमाणु यांत्रिकी10 में परिवर्तन; ii) नाभिक11 में घनीभूत करने के लिए साइटोप्लाज्म में साइटोस्केलेटन आधारित सक्रिय बलों का संचरण; और iii) विभिन्न सेलुलर डिब्बों10,11 भर में इस सक्रिय ऊर्जा के अपव्यय. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल बहुमुखी है, के रूप में यह न्यूक्लियोलस23 की तरह अन्य परमाणु घनीभूत करने के लिए न केवल अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन यह भी कैंसर कोशिकाओं की तरह अन्य सेल प्रकार, जहां दोनों cytoskeletal और परमाणु घनीभूत व्यवहार में परिवर्तन 17,41प्रलेखित किए गए थे.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी हितों की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

ए.ए.जे. और एमए ने पांडुलिपि का सह-लेखन किया और सभी सह-लेखकों ने पांडुलिपि पर टिप्पणी की। एमए CNRS और "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322) द्वारा समर्थित है.A.A.J. Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel, और Fondation du Collège de France द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma  A3311
CSU-X1-M1 spinning disk Yokogawa
DMI6000B microscope  Leica
Femtojet microinjector Eppendorf
Fiji
Filter wheel Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish World Precision Instruments FD35-100
Metamorph software  Universal Imaging,  version 7.7.9.0
Mineral oil Sigma Aldrich M8410-1L
NanoDrop 2000  Thermo Scientific
OF1 and C57BL/6 mice  Charles River Laboratories
Poly(A) Tailing kit  Thermo Fisher AM1350
Retiga 3 CCD camera  QImaging
RNAeasy kit  Qiagen 74104
SC35 antibody Abcam ab11826 Nuclear speckle antibody; mouse IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmid   OriGene Technologies MG202528 NM_011358
Stripper Micropipette  XLAB Solutions specialized for oocyte collection
T3 mMessage mMachine Thermo Fisher AM1384 
T7 mMessage mMachine  Thermo Fisher AM13344
Thermostatic chamber Life Imaging Service
Windows Excel Windows

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References

  1. Quinlan, M. E. Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte. Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).
  2. Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. A physical perspective on cytoplasmic streaming. Interface Focus. 5 (4), 20150030 (2015).
  3. Gundersen, G. G., Worman, H. J. Nuclear positioning. Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).
  4. Metzger, T. MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function. Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).
  5. Roman, W. Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction. Science. 374 (6565), 355-359 (2021).
  6. Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. Control of nucleus positioning in mouse oocytes. Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).
  7. Brunet, S., Maro, B. Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte. Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).
  8. Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes. Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).
  9. Almonacid, M., et al. Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).
  10. Almonacid, M., et al. Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes. Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).
  11. Al Jord, A., et al. Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes. Nat Commun. 13 (1), 5070 (2022).
  12. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), eaaf4382 (2017).
  13. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).
  14. Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).
  15. Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision. Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).
  16. Barutcu, A. R. Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns. Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).
  17. Guo, M. Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy. Cell. 158 (4), 822-832 (2014).
  18. Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes. Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).
  19. Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division. Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).
  20. El-Hayek, S., Clarke, H. J. Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche. Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).
  21. Dumont, J. A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes. J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).
  22. Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells. Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).
  23. Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. The nucleolus as a multiphase liquid condensate. Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).
  24. Terret, M. E., et al. DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes. Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).
  25. Dumont, J., Verlhac, M. H. Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes. Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).
  26. McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences. Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).
  27. OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).
  28. Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  29. ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).
  30. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).
  31. Yi, K., et al. Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes. Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
  33. Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).
  34. Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images. Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).
  35. Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).
  36. Letort, G. gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).
  37. ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).
  38. Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).
  39. Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus. Phys Rev Lett. 121 (14), 148101 (2018).
  40. Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase. Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).
  41. Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. Biomolecular condensates and cancer. Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).

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इस महीने जोव में अंक 203
स्थानिक तराजू में माउस oocyte नाभिक के साइटोस्केलेटन आधारित आंदोलन पर कब्जा
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Letort, G., Mailly, P., Al Jord, A., … More

Letort, G., Mailly, P., Al Jord, A., Almonacid, M. Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales. J. Vis. Exp. (203), e65976, doi:10.3791/65976 (2024).

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