Мультиплексная визуализация живых клеток для реакции на лекарственные препараты в органоидных моделях рака, полученных от пациентов

Summary

Органоиды опухолей, полученные от пациентов, представляют собой сложную модельную систему для фундаментальных и трансляционных исследований. В данной методе подробно описано использование мультиплексной флуоресцентной визуализации живых клеток для одновременной кинетической оценки различных органоидных фенотипов.

Abstract

Органоидные модели рака, полученные от пациента (PDO), представляют собой многофункциональную исследовательскую систему, которая лучше повторяет заболевание человека по сравнению с линиями раковых клеток. Модели PDO могут быть созданы путем культивирования опухолевых клеток пациента в экстрактах внеклеточной базальной мембраны (BME) и покрытия их в виде трехмерных куполов. Однако коммерчески доступные реагенты, оптимизированные для фенотипического анализа в монослойных культурах, часто несовместимы с БМЭ. В этой статье мы опишем метод планшетирования моделей PDO и оценки эффектов лекарств с помощью автоматизированной системы визуализации живых клеток. Кроме того, мы применяем флуоресцентные красители, совместимые с кинетическими измерениями, для количественной оценки здоровья клеток и апоптоза одновременно. Захват изображений можно настроить так, чтобы он происходил через регулярные промежутки времени в течение нескольких дней. Пользователи могут анализировать действие лекарств на отдельных изображениях в Z-плоскости или Z-проекции последовательных изображений из нескольких фокальных плоскостей. С помощью маскировки вычисляются конкретные интересующие параметры, такие как число PDO, площадь и интенсивность флуоресценции. Мы предоставляем экспериментальные данные, демонстрирующие влияние цитотоксических агентов на здоровье, апоптоз и жизнеспособность клеток. Эта автоматизированная платформа кинетической визуализации может быть расширена для других фенотипических считываний для понимания различных терапевтических эффектов в моделях рака PDO.

Introduction

Органоиды опухолей, полученные от пациентов (PDO), быстро становятся надежной модельной системой для изучения развития рака и терапевтических реакций. PDO представляют собой трехмерные (3D) системы культивирования клеток, которые повторяют сложный геномный профиль и архитектуру первичной опухоли ^1,2. В отличие от традиционных двумерных (2D) культур иммортализированных раковых клеточных линий, PDO захватывают и поддерживают внутриопухолевую гетерогенность ^3,4, что делает их ценным инструментом как для механистических, так и для трансляционных исследований. Несмотря на то, что PDO становятся все более популярными модельными системами, коммерчески доступные реагенты и методы анализа клеточных эффектов, совместимые с культурами PDO, ограничены.

Отсутствие надежных методов анализа тонких изменений в ответе на лечение затрудняет клиническую трансляцию. Золотой стандарт реагента для здоровья клеток в 3D-культурах, CellTiter-Glo 3D, использует уровень АТФ в качестве детерминанты жизнеспособности клеток ^5,6. Несмотря на то, что этот реагент полезен для анализа конечных точек, есть несколько предостережений, в первую очередь невозможность использования образцов для других целей после завершения анализа.

Визуализация живых клеток — это сложная форма кинетической микроскопии, которая в сочетании с флуоресцентными реагентами способна количественно оценить различные показатели здоровья клеток в моделях PDO, включая апоптоз^{7, 8, 9} и цитотоксичность¹⁰. Действительно, визуализация живых клеток является неотъемлемой частью высокопроизводительного скрининга соединений на ^{2D-платформах 11,12}. Такие системы, как Incucyte, сделали технологию доступной и, следовательно, доступной для исследовательских групп в различных условиях. Тем не менее, применение этих систем для анализа 3D-культур все еще находится в зачаточном состоянии.

В данной работе мы описываем метод оценки лекарственного ответа в моделях рака PDO с использованием мультиплексной визуализации живых клеток (рис. 1). С помощью анализа изображений яркого поля можно кинетически отслеживать изменения размера и морфологии PDO. Кроме того, клеточные процессы могут быть одновременно количественно определены с течением времени с помощью флуоресцентных реагентов, таких как красный краситель Annexin V для апоптоза и зеленый краситель Cytotox для цитотоксичности. Представленные методы оптимизированы для системы визуализации живых клеток Cytation 5, но этот протокол может быть адаптирован для различных платформ визуализации живых клеток.

Protocol

Исследования с использованием образцов опухолей человека были рассмотрены и одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Айовы (IRB), протокол #201809807, и проведены в соответствии с этическими стандартами, изложенными в Хельсинкской декларации 1964 года и более поздних поправках к ней. Информированное согласие было получено от всех испытуемых, участвовавших в исследовании. Критерии включения включают диагноз рака и наличие образцов опухоли.

1. Нанесение неповрежденных PDO в 96-луночный планшет

1. Подготовьте реактивы.
   1. Разогрейте 96-луночные планшеты до 37 °C в течение ночи и разморозьте BME в течение ночи при 4 °C.
   2. Подготовьте полную органоидную питательную среду, оптимизированную для культивирования интересующего типа рака. Конкретные питательные среды, используемые для экспериментов, показанных в настоящем документе, приведены в Дополнительной таблице 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, потребуется модифицировать компоненты среды для различных типов опухолей. Например, органоидная питательная среда дополнена эстрадиолом 100 нМ при гинекологических опухолях¹³. Приготовленная среда стабильна при 4 °C в течение 1 месяца. Для длительного хранения наполните среду в пробирки объемом 50 мл и храните при температуре -20 °C.
2. Готовят две отдельные аликвоты органоидных питательных сред при температуре 4 °C и 37 °C. Например, если 60 лунок покрываются в 96-луночном планшете, используйте 6 мл теплой органоидной питательной среды и 150 мкл ледяной органоидной питательной среды.
3. Подготовьте буфер для промывки органоидов: добавьте 1x PBS с 10 мМ HEPES, 1 Glutamax, 5 мМ ЭДТА и 10 мкМ Y-27632. Хранить при температуре 4 °C
4. Собирайте PDO, культивируемые в 24-луночном планшете. Выполняйте все действия на льду или при температуре 4 °C, если не указано иное.
   1. Отсасывайте среду из каждой скважины с помощью системы вакуумных линий.
   2. Добавьте 500 мкл ледяного буфера для промывки органоидов и осторожно пипеткой 2-3 раза с помощью пипеттора на 1000 мкл. Инкубируйте пластину на льду в течение 10 минут.
   3. Перелейте содержимое каждой лунки в коническую пробирку объемом 50 мл. Чтобы убедиться, что все PDO находятся во взвешенном состоянии, промойте каждую лунку дополнительным 300 мкл буфера для промывки органоидов и перелейте в коническую пробирку объемом 50 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 350 x g при 4 °C
   4. Отсасывайте надосадочную жидкость из гранулы BME/органоида с помощью системы вакуумной линии, оставляя ~ 5 мл в пробирке. Добавьте 20 мл буфера для промывки органоидов и аккуратно ресуспендируйте гранулу с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Инкубировать на льду 10 мин.
   5. Центрифуга в течение 5 мин при 350 x g при 4 °C. Отсасывайте надосадочную жидкость с помощью системы вакуумной линии, стараясь не нарушить гранулу PDO.
5. Нанесение PDO на 96-луночную пластину: Выполняйте все действия на льду, если не указано иное.
   1. Ресуспендируйте гранулу PDO в соответствующем количестве ледяной среды для культивирования органоидов, чтобы создать суспензию PDO. Перенесите суспензию PDO в ледяную пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы рассчитать количество органоидных питательных сред, определите количество лунок, которые должны быть покрыты в 96-луночном планшете, принимая во внимание, что PDO покрываются куполом объемом 5 мкл в соотношении 1:1 органоидных питательных сред и BME. Например, при покрытии одной 96-луночной планшетной пластины и использовании только внутренних 60 лунок общее количество необходимой суспензии PDO составит 300 мкл: 150 мкл органоидной питательной среды и 150 мкл BME. Для моделей, демонстрирующих оптимальный рост при различных процентах BME, соотношение BME: среда может быть изменено на этом этапе, хотя важно стандартизировать соотношение для всех анализов для каждой конкретной модели. Чтобы учесть ошибку пипетирования, добавьте 10% объема к каждому компоненту.
   2. Подсчитайте количество PDO.
      1. Перенесите 2,5 мкл суспензии PDO в ледяную пробирку для микроцентрифуги объемом 1,5 мл и смешайте с 2,5 мкл BME. Перенесите смесь 5 мкл на чистое стеклянное предметное стекло микроскопа. Не закрывайте затвор. Смесь застынет в купол.
      2. Визуализируйте с помощью яркопольного микроскопа с 4-кратным увеличением. Подсчитайте количество PDO в смеси 5 мкл; Цель состоит в том, чтобы иметь примерно 25-50 PDO на купол объемом 5 мкл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Если желаемая плотность в испытуемой смеси не достигнута, отрегулируйте окончательный объем суспензии PDO либо путем добавления дополнительных питательных сред для органоидов, либо путем центрифугирования суспензии PDO и ресуспендирования гранулы PDO в меньшем объеме ледяной среды для культивирования органоидов. Независимо от того, как модифицируется суспензия PDO на этом этапе, окончательное соотношение BME:суспензия PDO на шаге 1.5.3. должно быть 1:1.
   3. Используя дозатор объемом 200 мкл с широкими наконечниками, тщательно перемешайте суспензию PDO с равным количеством BME для достижения соотношения органоидных питательных сред к BME 1:1. Избегайте пузырей, которые нарушат целостность куполов.
   4. С помощью пипеттора на 20 мкл засейте 5 мкл куполов в центр каждой лунки предварительно нагретой 96-луночной пластины, засеивая только внутренние 60 лунок. Чтобы обеспечить равномерное распределение PDO, периодически пропитывайте содержимое пробирки объемом 1,5 мл с помощью пипетки на 200 мкл с широкопроходными наконечниками.
   5. После того, как все лунки засеяны, накройте тарелку крышкой и аккуратно переверните. Инкубируйте перевернутую пластину при температуре 37 °C в течение 20 минут в инкубаторе для культуры тканей, чтобы купола затвердели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инвертирование планшета гарантирует, что купол BME/органоидной питательной среды сохранит 3D-структуру, чтобы обеспечить достаточное пространство для формирования PDO.
   6. Переверните тарелку так, чтобы она стояла с крышкой вверх, и инкубируйте в течение 5 минут при 37 °C.

2. Обработка и добавление флуоресцентных красителей для мультиплексирования

1. Пока купола BME затвердевают в 96-луночных планшетах, приготовьте разведения флуоресцентных реагентов для визуализации живых клеток. Конкретные параметры мультиплексирования красного красителя Annexin V и зеленого красителя Cytotox приведены в настоящем документе.
2. Приготовление флуоресцентных реагентов (День -1): Рассчитайте соответствующий объем органоидных питательных сред на основе количества лунок, подлежащих обработке, предполагая, что каждая лунка будет обработана 100 мкл питательной среды, дозированной красителем. Развести краситель в предварительно подогретых питательных средах органоидов до нужной концентрации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество необходимых носителей зависит от эксперимента. Добавьте 10% к конечному объему, чтобы учесть ошибку пипетирования. Например, для обработки внутренних 60 лунок 96-луночного планшета приготовьте 6,6 мл среды, дозированной красителем (Таблица 1).
3. Обработайте каждую лунку 100 мкл 2-кратной дозированной питательной среды органоидов. Добавьте 200 мкл стерильного 1x PBS во внешние пустые лунки планшета. Выдерживают при температуре 37 °C в течение ночи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PBS в периферийных лунках уменьшает испарение среды из внутренних скважин.
4. Добавление лекарственных средств/средств для лечения (день 0): Готовят препараты в предварительно подогретых питательных средах органоидов в 2-кратной концентрации в объеме 100 мкл на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ДМСО может быть токсичен для клеток в высоких концентрациях. Концентрация 0,1% ДМСО не превышена в экспериментах, проведенных в этом исследовании. Помимо лекарственных препаратов, некоторые флуоресцентные реагенты распространяются в виде раствора ДМСО. При работе с такими реагентами важно учитывать общую концентрацию ДМСО.
5. Добавьте 100 мкл 2-кратной дозированной красителя среды в каждую лунку; Избегайте образования пузырей.

3. Настройка параметров визуализации

1. Поместите пластину в Цитацию 5. Открытый Программное обеспечение 5-го поколения. Нажмите «Новая задача» > «Ручной режим тепловизора». Выберите «Захватить сейчас» и введите следующие параметры: Объектив (выберите желаемое увеличение); Фильтр (выберите микропластину); Формат микропланшета (выберите количество лунок); и Тип сосуда (выберите тип пластины). Щелкните Использовать крышку и Использовать более медленную скорость оператора. Нажмите кнопку ОК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тип сосуда: Будьте как можно более точны при выборе информации о пластине, поскольку программное обеспечение откалибровано на определенное расстояние от объектива до нижней части пластины для каждого типа пластины и толщины пластика.
   Более низкая скорость несущей: установите этот флажок, чтобы избежать разрушения куполов при загрузке/разгрузке плит.
2. Создайте Z-Stack, который будет отображать всю купол BME.
   1. Выберите интересующую скважину для просмотра (левая панель, под гистограммой).
   2. Выберите канал «Яркое поле» (левая панель, сверху). Нажмите «Автоэкспонирование» и при необходимости отрегулируйте параметры.
   3. Установите нижнюю и верхнюю часть Z-Stack: Разверните вкладку Imaging Mode (левая панель, посередине). Установите флажок Z-Stack . С помощью стрелок регулировки курса (левая панель, посередине) нажимайте на коррекцию вниз до тех пор, пока все PDO не войдут в фокус, а затем не выйдут из фокуса и не станут нечеткими. Установите его в качестве нижней части Z-стека. Повторите то же самое в противоположном направлении, используя стрелки регулировки курса, чтобы установить верхнюю часть Z-Stack.
   4. Чтобы убедиться в том, что настройки Z-Stack подходят для других интересующих скважин, выберите другую скважину (левая панель, под гистограммой) и визуализируйте верхнюю и нижнюю части Z-Stack.
   5. Чтобы вручную ввести положения фокуса, нажмите на три точки рядом с точной настройкой (левая панель, сверху). Откроется окно; введите верхнее значение Z-Stack (находится на левой панели, по центру, в разделе Imaging Mode). Повторите то же самое для нижнего значения Z-Stack. При необходимости отрегулируйте, чтобы захватить желаемый диапазон Z, повторив шаг 3.2.3. Если необходимо выполнить регулировку, выберите другую скважину для проверки настроек.
3. Установите настройки экспозиции для флуоресцентных каналов. Настройки описаны для двух флуоресцентных каналов (GFP и TRITC). Конкретное количество флуоресцентных каналов будет зависеть от эксперимента и от того, какие флуоресцентные кубы установлены в системе визуализации живых клеток.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если ожидается, что интенсивность сигнала будет значительно выше в конце эксперимента, пользователям следует рассмотреть возможность проведения тестовых экспериментов, чтобы определить оптимальные настройки экспозиции в конце эксперимента, которые затем могут быть применены при настройке начальных параметров.
   1. Разверните вкладку Imaging Mode (левая панель, посередине) и откройте Edit Imaging Step. Появится всплывающее окно.
   2. В разделе «Каналы» нажмите на кружок с нужным количеством каналов. Назначьте один канал для яркого поля и дополнительные каналы для каждого флуоресцентного канала. В этом примере Канал 1 = Яркое поле; Канал 2 = GFP; Канал 3 = TRITC. С помощью выпадающего меню «Цвет» выберите соответствующую настройку для каждого канала. Закройте окно редактирования, нажав кнопку ОК.
   3. Настройте каждый флуоресцентный канал.
      1. Переключите канал на GFP (левая панель, сверху).
      2. Нажмите «Автоэкспонирование» (левая панель, вверху). Разверните вкладку «Экспозиция » (левая панель, средняя) и отрегулируйте настройки экспозиции, чтобы свести к минимуму фоновый сигнал.
      3. Скопируйте настройки экспозиции на вкладку «Режим изображения », выполнив шаги 3.3.3.3-3.3.3.6.
      4. Нажмите на значок Копировать рядом с полем Редактировать шаг изображения . Нажмите кнопку Edit Imaging Step, после чего откроется другое окно.
      5. Под каналом GFP щелкните значок буфера обмена в строке «Экспозиция », чтобы добавить в канал настройки «Освещенность», «Время интеграции» и «Усиление камеры ».
      6. Повторите шаги 3.3.3.4-3.3.3.5 для канала TRITC. Нажмите кнопку ОК , чтобы закрыть окно.
4. Настройте предварительную обработку изображений и шаги Z-проекции, чтобы автоматизировать предварительную обработку изображений.
   1. Нажмите на значок камеры (левая панель, нижний угол). Откроется новое окно.
   2. В разделе Add Processing Step (левая панель, внизу) нажмите Image Preprocessing (Предварительная обработка изображений). Откроется новое окно.
   3. На вкладке «Яркое поле » снимите флажок «Применить предварительную обработку изображения».
   4. Убедитесь, что для каждой вкладки «Флуоресцентный канал» выбран параметр «Применить предварительную обработку изображения ». Снимите флажок Использовать те же параметры, что и канал 1 и нажмите кнопку ОК. Окно закроется.
   5. В разделе Add Processing Step (Добавить шаг обработки) нажмите Z Projection (Проекция Z). Откроется новое окно. При необходимости отрегулируйте диапазон срезов (например, чтобы сузить диапазон Z). Закройте окно, нажав кнопку ОК.
5. Создание протокола.
   1. Нажмите кнопку Набор изображений на панели инструментов. В раскрывающемся меню нажмите Создать эксперимент из этого набора изображений. Окно визуализации закроется, и откроется окно процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры, выбранные в ручном режиме тепловизора , будут автоматически загружены в новое окно, в результате чего можно будет создать экспериментальный протокол.
   2. Установите температуру и градиент: нажмите «Установить температуру» под заголовком «Действия» (слева). Откроется новое окно. Выберите «Инкубатор включен» и вручную введите желаемую температуру в разделе «Температура». Затем в разделе Градиент вручную введите 1. Закройте окно, нажав кнопку ОК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Создание градиента 1 °C предотвратит образование конденсата на крышке пластины.
   3. Обозначьте колодцы на изображении.
      1. Дважды щёлкните по шагу изображения в разделе Описание. Нажмите «Полная пластина » (правый угол, сверху). Откроется окно "Компоновка пластины ".
      2. Выделите интересующие вас скважины с помощью курсора. Нажмите кнопку ОК. При необходимости установите флажки «Объединение автофокусировки » и «Объединение захвата ». Нажмите кнопку ОК , чтобы закрыть окно.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Биннинг потребует регулировки экспозиции, как описано в шаге 3.3.3.2 выше. Конкретные сценарии, в которых может использоваться эта функция, см. в разделе «Обсуждение».
   4. Установите интервалы для кинетической визуализации.
      1. Нажмите « Параметры » под заголовком «Другое » (слева). Установите флажок Прерывистая кинетическая процедура .
      2. В поле Расчетное общее время введите время выполнения эксперимента (например, 5 дней). В разделе "Расчетный интервал" введите интервал для получения изображения пластины (например, каждые 6 часов).
      3. Нажимайте кнопку Пауза после каждого запуска, чтобы дать время для переноса планшета в инкубатор. Закройте окно, нажав кнопку ОК.
   5. Обновление шагов по сокращению объема данных.
      1. Нажмите кнопку ОК, чтобы закрыть окно процедуры. Откроется вкладка для обновления шагов по сокращению данных. Выберите Да. Дважды щёлкните по Предварительной обработке изображений. Просмотрите различные каналы, чтобы проверить настройки, и нажмите кнопку ОК.
      2. Дважды щёлкните по Z-проекции. Щелкните по различным каналам, чтобы проверить настройки. Нажмите кнопку ОК. Затем снова нажмите кнопку «ОК », чтобы закрыть окно «Сокращение данных».
   6. Отформатируйте макет пластины.
      1. Откройте мастер компоновки пластин и обозначьте типы колодцев, выполнив шаги 3.6.2-3.6.3.
      2. Щелкните по значку "Компоновка пластин " на панели инструментов (в левом углу, вверху), чтобы открыть Мастер компоновки пластин.
      3. Установите флажки рядом с типами скважин, используемых в эксперименте. В разделе «Контроль анализа» введите количество различных типов элементов управления с помощью стрелок. Нажмите кнопку Далее , чтобы открыть окно Контроль пробы #1 .
      4. Задайте пробирные контрольные условия скважины, выполнив шаги 3.6.5-3.6.8.
      5. В окне Контроль анализа #1 введите метку управления в поле Идентификатор компоновки пластины . При желании введите ФИО в соседнее поле. Выберите количество репликаций для соответствующего условия управления с помощью стрелок.
      6. Если в элементе управления используется несколько концентраций или серия разбавлений, щелкните Определить разведения/концентрации и используйте раскрывающееся меню, чтобы выбрать Тип. Введите значения для каждой концентрации/разведения в таблицу.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Функцию auto можно использовать, если концентрация изменяется с постоянным приращением.
      7. Выберите вкладку «Цвет » на панели инструментов. Выберите желаемый цвет текста и цвет фона для управления в выпадающем меню. Нажмите кнопку Далее.
      8. При необходимости повторите процедуру с дополнительными элементами управления.
      9. Устанавливают условия отбора проб в скважине по 3.6.10-3.6.12.
      10. На странице Настройка образца введите префикс идентификатора образца (например, SPL). Выберите количество репликаций с помощью стрелок. При использовании образцов с различными концентрациями для обработки выберите Концентрации или Разведения в ниспадающем меню Тип . Введите разведения/концентрации в таблицу и введите единицы измерения в поле Единицы измерения .
      11. Выберите Поля идентификации на панели инструментов. Введите желаемые названия категорий (например, идентификатор образца, лекарственного препарата) в таблицу.
      12. Выберите вкладку Цвет на панели инструментов. Выберите другой цвет для каждой группы обработки/образца. Нажмите кнопку Finish (Готово). Откроется страница "Компоновка пластины".
          ПРИМЕЧАНИЕ: Числа слева коррелируют с различными номерами выборок.
      13. Присвойте идентификаторы образцов, выполнив шаги 3.6.14-3.6.16.
      14. Выбирать SPL1 на левой панели. Используйте курсор для выбора колодцев.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Инструменты автоматического выбора можно настроить в поле последовательного назначения. Количество реплик и ориентация макета могут быть предварительно назначены.
      15. Повторите то же самое с другими образцами, чтобы завершить компоновку пластины. Когда все будет готово, нажмите кнопку ОК.
      16. На панели инструментов Файл выберите Идентификаторы образцов. Заполните столбцы «Идентификатор образца » соответствующей информацией для каждого образца (например, тип препарата). Нажмите кнопку ОК.
   7. Сохраните протокол.
      1. На панели инструментов нажмите «Файл » > «Сохранить протокол как». Выберите папку для сохранения файла. Введите имя файла. Нажмите кнопку Сохранить , чтобы закрыть окно.
      2. Нажмите «Файл» > «Выход» на панели инструментов. Откроется вкладка для сохранения изменений в ручном режиме тепловизора. Выберите Нет.
      3. Откроется вкладка для сохранения изменений в эксперименте 1. Выберите Нет. Откроется вкладка для обновления определения протокола. Выберите Обновить. Закройте программное обеспечение.
6. Импортируйте протокол в BioSpa OnDemand и завершите настройку эксперимента.
   1. Откройте программное обеспечение BioSpa OnDemand (программное обеспечение для планирования).
   2. Выберите доступный слот в программном обеспечении.
   3. Извлеките пластину из системы визуализации живых клеток. Нажмите кнопку Открыть ящик , чтобы получить доступ к соответствующему слоту в программном обеспечении для планирования и вставить пластину. Нажмите кнопку Закрыть ящик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен в любой момент после создания протокола на шаге 3.5.7 выше. Тем не менее, пластина должна находиться в Цитации 5, чтобы выполнить прогон времени на следующем шаге 3.6.4.3.
   4. Импортируйте протокол.
      1. На вкладке «Информация о процедуре» выберите «Пользователь» в раскрывающемся меню. Рядом со слотом протокола нажмите кнопку Выбрать > Добавить новую запись.
      2. Рядом со слотом протокола нажмите кнопку Выбрать. После этого откроется новое окно для перехода к нужному протоколу в файловой архитектуре. Нажмите кнопку Открыть , чтобы импортировать протокол в программное обеспечение для планирования.
      3. Введите время, необходимое для получения изображения пластины. Нажмите кнопку ОК , чтобы закрыть окно Список протоколов Gen5 .
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг особенно важен при одновременном выполнении нескольких экспериментов. Чтобы определить время, необходимое для создания образа, нажмите кнопку Выполнить временный прогон сейчас. Нажмите кнопку ОК.
   5. Установите интервалы визуализации и запланируйте эксперимент.
      1. В поле Интервал введите интервал визуализации, указанный в шаге 3.5.4.
      2. В разделе «Параметры времени начала» выберите «Когда доступно». В разделе « Длительность» выберите «Фиксированная » или «Непрерывная».
         ПРИМЕЧАНИЕ: Можно назначить конкретное время запуска вместо запуска протокола в следующее доступное время. При выборе параметра «Фиксированная длительность » будет задана конкретная конечная точка для эксперимента, а пользователю потребуется указать экспериментальный период времени. Непрерывная длительность позволяет проводить эксперимент без конечной точки и может быть завершен только в том случае, если пользователь остановит эксперимент.
      3. Щелкните Запланировать плиту/сосуд. Откроется последовательность проверки пластин. Откроется вкладка с предлагаемым временем первого чтения. Нажмите кнопку Да, чтобы принять это расписание.

4. Анализ изображений в программном обеспечении Gen5 (рис. 2)

1. Откройте модуль Анализ изображений.
   1. Откройте Gen5. В диспетчере задач выберите Эксперименты > Открыть. Выберите эксперимент, чтобы открыть файл. Нажмите кнопку "Пластина > вид" на панели инструментов.
   2. Измените ниспадающее меню Данные на Проекция Z. Дважды щёлкните по интересующей вас колодце. Выберите Анализ, > я хочу настроить новый шаг сокращения данных анализа изображений. Нажмите кнопку ОК.
2. Клеточный анализ
   1. Основная маска
      1. В разделе «Настройки анализа» выберите «Тип: Канал клеточного анализа и обнаружения: ZProj[Tsf[Яркое поле]] (левая панель, в центре).
      2. Щелкните Опции. Откроется страница Основная маска и количество. В поле Пороговое значение установите флажок Авто и нажмите кнопку Применить. Щелкните поле «Выделить объекты» (правая панель, внизу), чтобы отобразить объекты в пределах заданного порогового значения. При необходимости отрегулируйте, чтобы включить интересующие вас объекты.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Пороговые настройки основаны на интенсивности пикселей. Например, если пороговое значение равно 5000, в анализ будут включены пиксели с интенсивностью более 5000.
      3. В разделе "Выбор объекта" укажите минимальный и максимальный размер объекта (мкм). При необходимости отрегулируйте, чтобы исключить клеточный мусор/отдельные клетки.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Размер PDO может значительно отличаться в зависимости от модели и типа. Используйте измерительный инструмент в программном обеспечении Gen5 для определения минимальных и максимальных пороговых значений размера PDO для каждой модели. Пользователи могут выбрать меньший минимальный порог размера PDO по сравнению со значением, предоставленным измерительным инструментом, чтобы предотвратить исключение фрагментов PDO в более поздние моменты времени после медикаментозного лечения.
      4. Чтобы ограничить анализ определенной областью скважины, снимите флажок Анализировать все изображение и нажмите кнопку Подключить. В окне Image Plug используйте ниспадающее меню, чтобы выбрать Plug shape. При необходимости отрегулируйте параметры размера и положения в соответствии с интересующей областью.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Важно максимально увеличить количество PDO в разъеме, а также исключить области, свободные от PDO, чтобы свести к минимуму фон. Назначьте размер подключаемого модуля, который будет последовательно захватывать большинство интересующих объектов в репликациях. Генерация заглушки, которая также исключает края купола, важна, поскольку она исключает любые объекты, которые могут казаться искаженными из-за преломления света из-за крайней кривизны купола по краям. Параметр «Включить первичные объекты ребер » также можно снять, чтобы захватывать только целые PDO в пределах вилки.
   2. Анализ субпопуляций. Пример обозначения субпопуляции приведен на рисунке 3.
      1. Щелкните Вычисляемые метрики (Calculated Metrics) на панели инструментов Клеточный анализ (Cellular Analysis). Нажмите кнопку Выбрать или создать интересующие метрики уровня объекта (правый угол, внизу). В разделе «Доступные метрики объектов» выберите интересующие вас метрики (например, цикличность) и нажмите кнопку «Вставить». Нажмите кнопку ОК.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Морфология и плотность каждой модели PDO определяют наилучшие метрики, представляющие интерес для различения субпопуляции.
      2. Щёлкните на Анализ субпопуляций (Subpopulation Analysis ) на панели инструментов Клеточный анализ (Cellular Analysis ). Нажмите кнопку Добавить , чтобы создать новую подпопуляцию. Откроется всплывающее окно.
      3. При необходимости введите имя для субпопуляции. В разделе Метрики объекта выберите интересующую метрику и нажмите кнопку Добавить условие. В окне "Редактировать условие " введите параметры для выбранной метрики объекта. При необходимости повторите эти действия с дополнительными метриками.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры могут быть настроены вручную или установлены с помощью инструмента Finder. Например, чтобы исключить мусор, пользователи могут добавить Площадь в качестве метрики объекта и выбрать объекты меньше 800. Цикличность в качестве объектной метрики обычно используется, и все объекты с округлостью больше 0,2–0,5 включаются в зависимости от модели.
      4. В таблице в нижней части окна отметьте нужные результаты для отображения. Нажмите кнопку ОК > Применить.
      5. Чтобы просмотреть объекты в пределах подпопуляции, используйте ниспадающее меню Сведения об объекте (правая панель, по центру), чтобы выбрать подпопуляцию. Объекты, попадающие под параметры, будут подсвечены на изображении.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы изменить цвета подсветки основной маски и подпопуляции, нажмите кнопку Настройки (правая панель, внизу).
      6. Чтобы настроить параметры субпопуляции, снова откройте окно Анализ подпопуляций (Subpopulation Analysis ) на панели инструментов Клеточный анализ (Cellular Analysis ). Выберите подпопуляцию и нажмите кнопку Редактировать. Нажмите кнопку Добавить шаг.
         ПРИМЕЧАНИЕ: При этом один и тот же анализ будет применен ко всем скважинам в рамках эксперимента во все моменты времени. В выпадающем меню на странице Матрица можно выбрать разные метрики для индивидуального просмотра.

5. Экспорт данных из Gen5 в Excel

1. Чтобы настроить файл данных для экспорта, выберите значок Report/Export Builders на панели инструментов. Во всплывающем окне нажмите кнопку Новый экспорт в Excel.
2. На странице «Свойства» всплывающего окна выберите «Область > пластину» и «Содержимое > Пользовательский». Нажмите на опцию «Содержимое» на панели инструментов. Нажмите «Редактировать шаблон», после чего откроется программа Excel.
3. В электронной таблице выберите Надстройки > Таблица > скважинные данные. Наведите курсор на различные выборки, чтобы увидеть параметры экспорта. Выберите интересующую метрику (например, Object Mean[ZProj[Tsf[TRITC]]]).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Компоновку пластин можно добавить в шаблон анализа электронных таблиц, выбрав Надстройки > Сводка протокола > Компоновка.
4. Откроется окно редактирования . В поле Скважины обозначьте скважины для экспорта либо по идентификатору скважины, либо по Скважине #. Нажмите кнопку ОК. Шаблон будет загружен в файл электронной таблицы. Закрыть электронную таблицу. Шаблон автоматически сохраняется.
5. Нажмите кнопку «ОК » в окне « Новый экспорт в Excel » и закройте окно «Построители отчетов/экспорта ».
6. Щелкните значок «Экспорт » на панели инструментов 5-го поколения. Поставьте галочку напротив нужного файла экспорта. Нажмите кнопку ОК. Поколение 5 автоматически заполнит шаблон электронной таблицы и откроет файл в Excel.

6. Анализ внешних данных

1. Откройте файл экспорта (.xlsx) в Excel.
2. Для каждой скважины разделите каждое отдельное значение на значение точки времени 0:00 для этой скважины. Это установит точку времени 0 равной 1, и каждое значение после этого будет относительным к первоначальному показанию.
3. Откройте новый файл в программе для анализа данных. Выберите вариант компоновки XY .
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовался GraphPad Prism (версия 9.5.1).
4. Входные метки для каждой группы данных. Скопируйте и вставьте временные точки и соответствующие нормализованные значения для каждой группы обработки в таблицу Prism. График для данных будет сгенерирован автоматически, и его можно найти в разделе Графики.

Representative Results

Наша цель состояла в том, чтобы продемонстрировать возможность использования мультиплексной визуализации живых клеток для оценки терапевтического ответа PDO. Экспериментальные эксперименты были проведены на двух отдельных моделях рака эндометрия: ONC-10817 и ONC-10811 (см. Дополнительный рисунок 1 и Дополнительный рисунок 2 для данных ONC-10811). Апоптоз (окрашивание аннексина V) и цитотоксичность (поглощение Cytotox Green) кинетически контролировали в ответ на агент, индуцирующий апоптоз, ставроспорин. В частности, PDO помещали в 96-луночные планшеты, обрабатывали красителями Annexin V Red и Cytotox Green и помещали в инкубатор при температуре 37 °C на ночь, как показано на рисунке 1. В двух независимых моделях PDO мы подтвердили, что лечение красителями Annexin V и Cytotox Green не токсично (дополнительный рисунок 2). На следующий день ЗОП лечили повышенными концентрациями ставроспорина (0,01 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ, 500 нМ). Впоследствии в программном обеспечении Gen5 были разработаны протоколы, и эксперименты должны были выполняться в течение 5 дней, с визуализацией каждые 6 часов. Данные были проанализированы с помощью функции клеточного анализа в программном обеспечении Gen5, как описано в разделе 4 протокола. Первичная маска была установлена с помощью функции Auto threshold со снятым флажком "Разделять касающиеся объекты" и с параметрами размера минимум: 30 мкм и максимума: 1000 мкм. Субпопуляция PDO определялась по цикличности > 0,25. Средние интенсивности объектов в каналах TRITC (аннексин V, апоптоз) и GFP (Cytotox Green, цитотоксичность) в указанной субпопуляции PDO были экспортированы в виде файла .xlsx для дальнейшего анализа. Средняя интенсивность объекта для каждой скважины в каждый момент времени в каналах GFP и TRITC была нормализована до времени 0. Нормализованные данные флуоресценции затем переносились в файл Prism и визуализировались в виде линейного графика.

Лечение ставроспорином приводило к значительному, дозозависимому увеличению апоптоза и ухудшению здоровья клеток с течением времени по сравнению с контролем транспортных средств, о чем свидетельствует увеличение средней интенсивности объекта как в каналах TRITC (аннексин V), так и GFP (цитотокс) (Рисунок 4, Рисунок 5, Дополнительное видео 1, Дополнительное видео 2, Дополнительное видео 3, Дополнительный видеоролик 4, дополнительный видеоролик 5, дополнительный видеоролик 6 и дополнительный видеоролик 7). Дозы ставросспорина 500 нМ, 100 нМ и 10 нМ приводили к статистически значимому увеличению как апоптоза, так и цитотоксичности с течением времени (рис. 5A-C), а также в конце эксперимента (рис. 5E, F). Кроме того, ставроспорин эффективно ингибировал рост и образование ЗОП в этих концентрациях, о чем свидетельствует общее уменьшение общей площади ЗОП, в то время как контрольные скважины демонстрировали увеличение общей площади ЗОП (рис. 4 и рис. 5D).

Поскольку основным преимуществом визуализации живых клеток является возможность коррекции вариабельности в покрытии, мы провели эксперимент, в котором жизнеспособность клеток оценивалась как конечная точка. Экспериментальные данные анализа конечной точки были собраны с использованием модели PDO, которая была сгенерирована из ксенотрансплантата рака простаты, полученного от пациента. Изображения яркого поля были получены в начале периода лечения (0-й день), после чего был добавлен двойной реагент с красителем, который измеряет как жизнеспособность (акридиновый оранжевый, AO), так и гибель клеток (йодид пропидия, PI). Компонент АО излучает зеленый флуоресцентный сигнал при связывании с двухцепочечной ДНК, что является показателем жизнеспособности клетки. Компонент PI окрашивает мертвые ядрообразные клетки и может быть использован для количественной оценки гибели клеток в ответ на лечение. Для того, чтобы учесть вариабельность покрытия PDO, мы разработали метод определения количества PDO на лунку в момент времени 0 путем преобразования изображений яркого поля в цифровые фазово-контрастные изображения (дополнительный рисунок 3 и дополнительный файл 1).

Пациентов с раком предстательной железы лечили даунорубицином, химиотерапевтическим агентом, вызывающим гибель клеток, в течение 7 дней. По завершении эксперимента образцы были окрашены AOPI, как описано в дополнительном файле 1, с последующим анализом флуоресцентных изображений в Gen5. На рисунке 6A показана панель изображений из анализа конечной точки AOPI на 7-й день. При сравнении ЗОП, обработанных транспортными средствами (первый ряд), с ЗОП, обработанных 10 мкМ даунорубицином (второй ряд), наблюдалось явное снижение зеленой флуоресценции (показатель жизнеспособности, второй столбец) и увеличение красной флуоресценции (показатель гибели клеток, третий столбец). Затем эти результаты были количественно оценены на рисунке 6B, где мы показываем массив показаний, которые могут быть получены с помощью метода окрашивания конечной точки AOPI. На верхнем левом графике показано измерение жизнеспособности, полученное с помощью окрашивания АО, нормированное к количеству PDO, определенному с помощью анализа цифровых фазово-контрастных изображений каждой лунки в день 0. Эти данные коррелируют с визуальным результатом, показанным на рисунке 6А, согласно которому по мере увеличения концентрации даунорубицина жизнеспособность резко снижалась. Это более подробно отражено на верхнем правом графике, который демонстрирует увеличение гибели клеток, обозначаемое увеличением красной флуоресценции, приобретенной при окрашивании PI.

Затем данные PI были объединены с показателем жизнеспособности (AO) для расчета отношения жизнеспособности и мертвости (рис. 6B, нижний левый график). Это соотношение является полезным подходом для определения того, является ли лекарственный препарат цитостатическим или цитотоксическим. В частности, цитотоксический препарат будет достигать гораздо ближе к 0, чем цитостатик, из-за того, что препарат, который является цитостатическим, будет ингибировать рост, но не может индуцировать гибель клеток. Наконец, площадь PDO может быть точно рассчитана с помощью зеленой флуоресценции окрашивания AO, даже когда PDO могут подвергаться клеточной гибели и блеббингу. На правом нижнем графике показана средняя площадь PDO, которая была рассчитана как сумма площадей, обозначенных в анализе субпопуляции, деленная на номер PDO. Анализ этой области может дать дополнительные указания относительно того, является ли лечение просто ингибированием роста PDO или на самом деле вызывает регрессию PDO. Обратите внимание, что анализ средней площади PDO был выполнен с использованием канала GFP и функции клеточного анализа, в отличие от рисунка 5D, где для вычисления общей площади PDO использовались изображения яркого поля. Эти данные подчеркивают гибкость конвейера анализа в зависимости от доступности данных и интереса пользователей.

Наконец, мы сравнили золотой стандарт показаний жизнеспособности, CellTiter-Glo 3D, с показанием флуоресценции жизнеспособности с помощью AOPI (рис. 6C). Обратите внимание, что данные на этой панели не были нормализованы к номеру PDO времени 0, поскольку такая нормализация обычно не выполняется лабораториями, использующими набор CellTiter-Glo 3D. Мы наблюдали одну и ту же тенденцию к действию препарата в обоих тестах, при этом жизнеспособность ЗОП снижалась по мере увеличения концентрации даунорубицина. Единственное визуальное различие между этими показаниями заключалось в том, что 3D-анализ CellTiter-Glo достиг IC50 до анализа AOPI и почти полностью достиг 0. Такой результат можно объяснить механизмом действия даунорубицина. Даунорубицин является ингибитором топоизомеразы-II, который приводит к двухцепочечным разрывам ДНК, что приводит к остановке клеточного цикла и, в конечном итоге, к апоптозу¹⁴. Во время остановки клеточного цикла может произойти истощение АТФ¹⁵. Учитывая, что 3D-анализ CellTiter-Glo основан на реакции АТФ-люциферазы для генерации сигнала люминесценции, мы предполагаем, что более сильное снижение жизнеспособности клеток при более высоких концентрациях даунорубицина было связано с истощением АТФ, а не с полной гибелью клеток. В подтверждение этой идеи на рисунке 6А изображена популяция, живущая в культуре с ЗОП, обозначенная зеленой флуоресценцией.

Рисунок 1: Обзор протокола нанесения покрытия, визуализации и анализа. PDO помещаются в 96-луночную пластину и обрабатываются флуоресцентными красителями и лекарственными препаратами. Параметры визуализации для эксперимента (например, экспозиция, Z-стек) создаются в программном обеспечении Gen5. Изображения получаются с помощью Cytation 5 и обрабатываются в Gen5, а данные экспортируются для дальнейшего анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Обзор функции Cellular Analysis. 1: Обозначить вилку: Вилка предназначена для включения областей интереса. 2: Установить основную маску: Основная маска определяет интересующие объекты на основе размера и интенсивности пикселей в выбранном канале. На этом репрезентативном изображении объекты, включенные в основную маску, обведены фиолетовым цветом. 3: Определение субпопуляции: Дополнительная подпопуляция может быть определена для дальнейшего уточнения требуемой генеральной совокупности для анализа. Субпопуляция на изображении примера (обведена желтым цветом) определена на основе циркулярности (>0,25) и площади (>800). Изображения были получены с помощью 4-кратного объектива. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Примеры маскировки субпопуляций с помощью функции Cellular Analysis. Субпопуляции определяются в канале светлого поля. Субпопуляция на изображениях-примерах (обведена желтым цветом) определена на основе округлости (>0,25) и площади (>800). Изображения были получены с помощью 4-кратного объектива. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Лечение ставроспорином приводит к дозозависимому увеличению апоптоза и цитотоксичности. Изображения яркого поля (4-кратный объектив) с наложением флуоресценции GFP и TRITC показаны для доз ставросспорина 500 нМ, 10 нМ и 0,1 нМ в 3 временных точках: 0 ч, 54 ч, 114 ч. Красный флуоресцентный сигнал указывает на апоптоз (аннексин V), а зеленый флуоресцентный сигнал указывает на цитотоксичность (цитотоксик). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Мультиплексная флуоресцентная визуализация живых клеток для оценки ответа PDO. Модель PDO ONC-10817 была покрыта 96-луночными планшетами и инкубирована красителями Annexin V Red (1:400) и Cytotox Green (200 нМ) в течение ночи при 37 °C. На следующий день ЗОП лечили возрастающими концентрациями ставроспорина и визуализировали каждые 6 ч в течение ~5 дней. (А,Б) Время- и дозозависимое увеличение (А) цитотоксичности или (В) апоптоза в ответ на ставроспорин. Данные были построены в виде средней интенсивности объекта в канале GFP или TRITC. (C) Сравнение временного хода апоптоза и цитотоксичности в ответ на 100 нМ или 500 нМ ставроспорин. Данные были построены в виде значений средней интенсивности объекта в каналах GFP и TRITC. (D) Ставроспорин ингибирует рост ЗОП. Данные были представлены в виде средней общей площади PDO. Данные в A-D были нормализованы к номеру PDO в момент времени 0 ч в каждой скважине и построены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего значения (SEM). N=5 технических повторений на одну обработку. p < 0,0001 по сравнению с управлением автомобилем с помощью 2-way ANOVA. (E) Репрезентативные изображения яркого поля, GFP и TRITC 500 нМ, обработанных ставроспорином, в сравнении с транспортным средством в конце эксперимента (114 ч). Изображения были получены с помощью 4-кратного объектива. (F) Количественная оценка цитотоксичности, апоптоза и жизнеспособности через 114 часов. Средняя интенсивность объекта GFP (слева) и средняя интенсивность объекта TRITC (в центре) были рассчитаны в точке времени 114 часов с использованием результатов панелей A-C. Жизнеспособность (справа) оценивали с помощью реагента CellTiter-Glo 3D в соответствии с протоколом производителя. Значения необработанной люминесценции (RLU) были нормализованы к общей площади PDO в момент времени 0 ч и построены как жизнеспособность складки относительно управления транспортным средством, которая была установлена равной 1,0. ** p<0.01, ***p<0.001, **** p<0.0001 в сравнении с управлением автомобилем с помощью одностороннего ANOVA с post-hoc тестом Даннета. N = 5 технических повторений на одну обработку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Использование визуализации живых клеток для нормализации данных анализа конечных точек. ЗОП лечили возрастающими концентрациями ингибитора топоизомеразы-II, даунорубицина, в течение 7 дней. ЗОП подвергались воздействию раствора для окрашивания AOPI и визуализировались, как описано в Дополнительном файле 1. AO = акридиновый оранжевый, мера жизнеспособности (канал GFP); PI = йодид пропидия, мера гибели клеток (красный канал Техаса). (A) Репрезентативные изображения, полученные с помощью окрашивания AOPI после 7 дней обработки 10 мкМ даунорубицином или контролем транспортного средства (0,1% ДМСО). (B) Различные показания с использованием флуоресценции AOPI в качестве метода жизнеспособности/гибели клеток конечной точки. Подробное описание методов анализа см. в Дополнительном файле 1 . Вверху слева, анализ жизнеспособности ЗОП через 7 дней, определяемой с помощью окрашивания АО. Вверху справа, анализ гибели клеток с помощью ПИ-окрашивания. Данные для окрашивания АО и ПИ были нормализованы к номеру PDO в момент времени 0 ч, а затем к контрольному номеру транспортного средства, который был установлен на 1,0, и построены как среднее значение и стандартное отклонение. Внизу слева - расчет отношения жизнеспособности к мертвости с использованием средних объектных интегралов для AO и PI окрашиваний. Внизу справа, площадь PDO, определенная по окрашиванию АО. Клеточный анализ проводили в канале GFP. (C) Сравнение двух методов проверки жизнеспособности PDO. После визуализации оценивали жизнеспособность с помощью реагента CellTiter-Glo 3D по протоколу производителя. График выживаемости складки по сравнению с контролем транспортного средства был построен при возрастающих концентрациях даунорубицина. Данные представляют собой среднее значение и стандартное отклонение для N = 6 технических повторений на одну обработку; данные не были нормализованы по времени 0 ч в панели C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Лечение	# скважин	Объем носителя	Аннексин		100 мкМ цитотокс
			Разбавление	Том	Разбавление	Том
Мультиплекс	60	6,6 мл	1:400	16,5 мкл	200 нм	13,2 мкл

Таблица 1: Пример эксперимента по мультиплексированию. Аннексин V красный связывает экспонированный фосфатидилсерин на наружной створке мембран апоптотических клеток. Cytotox Green интегрируется в клетки с нарушенной целостностью мембраны и связывает ДНК.

Дополнительный рисунок 1: Мультиплексная визуализация живых клеток ONC-10811. PDO помещали в 96-луночные планшеты и инкубировали в красителях Annexin V Red (1:400) и Cytotox Green (200 нМ) в течение ночи при 37 °C. На следующий день ЗОП лечили возрастающими концентрациями ставроспорина и проводили визуализацию каждые 6 ч в течение 5 дней. (А) Время- и дозозависимое увеличение цитотоксичности в ответ на ставроспорин. Данные были построены в виде средней интенсивности объекта в канале GFP. (Б) Доза-реакция ставроспорина через 114 ч. Данные были построены в виде значений средней интенсивности объекта в канале GFP в момент времени 114 часов. (C) Зависящее от времени и дозы увеличение апоптоза в ответ на ставроспорин. Данные были построены в виде средней интенсивности объекта в канале TRITC. (D) Доза-реакция ставроспорина через 114 ч. Данные были нанесены на график в виде значений средней интенсивности объекта в канале TRITC в момент времени 114 часов. Данные в точках А и С были нормализованы к номеру PDO в момент времени 0 ч на уровне скважины. N = 5 технических повторений на одну обработку в каждой модели. p < 0,0001 по сравнению с управлением автомобилем с помощью 2-way ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Лечение Аннексином V и Цитотоксом не нарушает жизнеспособность ЗОП. PDO помещали в 96-луночные планшеты и инкубировали с красителями Annexin V Red (1:400) и Cytotox Green (200 нМ) в течение ночи при 37 °C. После 24-часовой инкубации жизнеспособность оценивали с помощью 3D-анализа CellTiter-Glo в соответствии с протоколом производителя. (A) Жизнеспособность обработанных красителями и необработанных ЗОП в течение 24 часов. Представлены как значения относительных единиц освещенности (RLU), так и значения, нормированные к суммарной площади PDO. В частности, CellTiter-Glo3D RLU для каждой лунки была нормализована до суммирования площади PDO для этой лунки на момент нанесения покрытия (т.е. сразу после добавления красителя). Общая площадь PDO была определена с помощью вычисления "Object Sum Area" в Cellular Analysis. N = 10. (B) Жизнеспособность обработанных красителями и необработанных PDO в течение 114 часов. Представлены как необработанные значения люминесценции, так и значения, нормированные к общей площади PDO. CellTiter-Glo3D RLU для каждой лунки нормировали к суммированию площади PDO через 24 ч после нанесения покрытия, что соответствует времени 0 ч в экспериментах по кинетической визуализации. N = 5. Значимость в А и В оценивали с помощью непарного t-критерия; Значения p перечислены на графиках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Анализ ЗОП без меток с использованием цифрового фазового контраста. На этом рисунке представлены репрезентативные изображения (объектив 2,5x), показывающие анализ без меток, как описано в Дополнительном файле 1: Настройка параметров визуализации для анализа в одной фокальной плоскости зрения (Яркое поле/Цифровые фазово-контрастные изображения) и Анализ цифровых фазово-контрастных изображений в программном обеспечении Gen5. (A) Пример яркого поля PDXO модели рака предстательной железы в одной фокальной плоскости. (Б) Изображение яркого поля в А было преобразовано в цифровое фазово-контрастное изображение. Темные объекты на изображении яркого поля выглядят яркими на изображении цифрового фазового контраста, и наоборот. (C) Пример маскировки PDO с использованием цифрового фазово-контрастного изображения. Обратите внимание, что края интересующих объектов становятся гораздо более четкими по сравнению с яркими полевыми изображениями. На этом репрезентативном изображении объекты в основной маске обведены желтым цветом. Подпопуляция в (C) (обведена розовым цветом) определяется на основе цикличности (>0,3), площади (>1000), Mean[Dig.Ph.Con] > 2000, StdDev[Dig.Ph.con] > 5000 + < 13500 и Peak[Dig.Ph.Con] > 12500. Параметры, использованные на этом репрезентативном рисунке, были применены к данным, показанным на рисунке 6 , чтобы нормализовать их к количеству клеток на день 0. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Модели PDO могут различаться по морфологии и консистенции покрытия. Верхняя панель: Примеры дифференциальной дисперсии PDO в куполах BME. Нижняя панель: Репрезентативные изображения дискогезивных и циркулярных PDO. Все изображения были получены с помощью микроскопа EVOS. Отмечаются увеличения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Примеры изображений, использующих клеточный анализ и статистику изображений для количественной оценки флуоресценции. Используя клеточный анализ, пользователи могут определять конкретные популяции на изображении и измерять флуоресценцию в этих областях. Статистика изображений также может быть использована для измерения флуоресценции в изображении путем определения порога для исключения фоновых сигналов. Об ограничениях использования статистики изображений см. в разделе Обсуждение. Изображения сделаны с 4-кратным увеличением. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица 1: Компоненты питательных сред органоидных культур. Обратите внимание, что реагенты были оптимизированы для культивирования гинекологических раковых PDO. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 1: Покадровое видео лечения ставросспорином 500 нМ с изображениями, полученными каждые 6 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 2: Покадровое видео лечения ставросспорином 100 нМ с изображениями, полученными каждые 6 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный видеоролик 3: Покадровое видео лечения ставросспорином 10 нМ с изображениями, полученными каждые 6 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 4: Покадровое видео лечения ставросспорином 1 нМ с изображениями, полученными каждые 6 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 5: Интервальная видеосъемка лечения ставросспорином 0,1 нМ с изображениями, полученными каждые 6 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 6: Интервальная видеосъемка стауроспорина 0,01 нМ с изображениями, полученными каждые 6 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительное видео 7: Интервальная видеосъемка автомобиля (0,06% DMSO) с изображениями, полученными каждые 6 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный файл 1: Дополнительные протоколы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Культуры PDO становятся все более популярными модельными системами in vitro из-за их способности отражать клеточные реакции и поведение². Были достигнуты значительные успехи в генерации, культуре и методах расширения PDO, однако методы анализа терапевтических ответов отстают. Коммерчески доступные 3D-наборы для определения жизнеспособности представляют собой литические анализы конечных точек, в которых отсутствуют потенциально ценные данные о кинетическом отклике и что ограничивает последующий анализ другими методами⁸. Новые исследования применяют визуализацию живых клеток для оценки реакции на лекарственные препараты в моделях PDO. В данной работе мы представляем метод оценки терапевтического ответа PDO с течением времени с использованием мультиплексной флуоресцентной визуализации живых клеток. Мультиплексирование флуоресцентных красителей позволяет одновременно количественно оценивать различные клеточные реакции. В дополнение к апоптозу и цитотоксичности, мы предполагаем, что этот подход может быть расширен в будущих исследованиях для изучения других фенотипических эффектов при PDO.

Протокол, представленный в настоящем документе, предназначен для получения кинетических изображений в светлом поле и флуоресцентных изображений PDO, покрытых в виде куполов в 96-луночной пластине. Основные этапы включают в себя: 1) нанесение покрытия, 2) обработку красителем и лекарственным препаратом, 3) определение параметров визуализации, 4) предварительную обработку и анализ изображения по завершении получения кинетического изображения и 5) экспорт данных для анализа в другое статистическое программное обеспечение (рис. 1). Интактные PDO помещаются в 96-луночный планшет в виде куполов BME объемом 5 мкл, состоящих из заранее определенного соотношения BME и органоидных питательных сред (обычно 1:1). Протокол, представленный в настоящем документе, использует UltiMatrix в качестве BME из-за минимальной вариабельности от партии к партии и превосходных оптических свойств для визуализации. Могут потребоваться модификации для сбора PDO, культивируемых в других BME, таких как Matrigel, а также для моделей, которые комковаты и трудно диссоциируют (см. примеры на дополнительном рисунке 4). Затем флуоресцентные красители добавляют в питательную среду для органоидов во время нанесения покрытия (День -1) в 2-кратной концентрации в объеме 100 мкл и инкубируют в течение ночи для определения исходной гибели клеток. На следующий день (день 0) лекарственные препараты или другие методы обработки добавляются в питательную среду для органоидов в 2-кратной концентрации в объеме 100 мкл, а затем добавляются в каждую лунку для получения окончательного объема 200 мкл. Конечный объем 200 мкл уменьшает эффект мениска при визуализации. Кинетические изображения получаются с помощью планшетного ридера Cytation 5 в паре с настольным инкубатором BioSpa. Инкубатор BioSpa позволяет инкубировать экспериментальные планшеты при фиксированной температуре 37 °C и 5%_CO2 среды. В BioSpa можно хранить до 8 планшетов и таким образом одновременно проводить 8 экспериментов. Параметры визуализации для каждой пластины настраиваются в программном обеспечении Gen5 с помощью «Ручного режима тепловизора» и сохраняются в виде протокола. Затем протокол загружается в программное обеспечение для планирования (BioSpa OnDemand). Программное обеспечение BioSpa OnDemand автоматизирует рабочий процесс получения кинетического изображения, включая физический перенос планшета из инкубатора BioSpa в Cytation 5 и определение протокола, который следует использовать в Gen5 для сбора данных. Изображения анализируются с помощью функции Cellular Analysis в программном обеспечении Gen5 (рис. 2). Описаны специфические методы анализа Z-проекций флуоресцентных и ярких полевых изображений. Конкретные методы анализа отдельных плоскостей Z и/или только изображений яркого поля приведены в Дополнительном файле 1. Наконец, пользователи могут определить конкретные характеристики данных, такие как площадь PDO, число и средняя интенсивность флуоресценции, для экспорта в виде электронной таблицы Excel для последующего статистического анализа эффектов лекарств.

Учитывая, что модели PDO являются относительно новой модельной системой для исследования эффектов лекарственных средств, методы адаптации к условиям культивирования, в частности, к росту БМЭ, все еще находятся в стадии^{разработки16}. Основная часть исследований, оценивающих реакцию PDO на медикаментозное лечение, опирается на анализ конечных точек на основе АТФ в качестве суррогата здоровья клеток (CellTiter-Glo 3D). Этот метод требует лизиса клеток, что исключает последующий анализ. Альтернативные методы анализа конечных точек, такие как флуоресцентное окрашивание, визуализация в одной временной точке и морфологическое отслеживание, обеспечили другие показатели для характеристики реакции на лекарственные препараты, позволяя использовать образцы для дополнительных целей. Например, протоколы фиксации конечных точек в планшете были применены для высокопроизводительного анализа эффектов лекарств^17,18. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет обойти обширную обработку, необходимую для типичной иммуногистохимии и иммунофлуоресцентной визуализации¹⁹, и особенно полезен, когда образец ограничен, как в случае с моделями PDO. Он также поддается визуализации с высоким разрешением с помощью конфокальной микроскопии. Еще один анализ конечной точки, который не требует лизиса клеток, — это визуализация живых клеток с помощью таких реагентов, как йодид пропидия или акридиновый апельсин. Наш сравнительный анализ CellTiter-Glo 3D и AOPI, последний из которых не требует лизиса клеток, для оценки жизнеспособности и гибели клеток (рис. 6C) подчеркивает преимущества использования красителей для визуализации живых клеток в моделях PDO. Этот метод применялся несколькими группами, в том числе и нашей, для оценки фенотипических эффектов в конце эксперимента 18,19,20. Однако для получения кинетических данных с использованием методов фиксации в скважине или визуализации живых клеток в конечной точке требуется значительная выборка. Безметочная морфологическая оценка PDO с течением времени частично преодолевает это ограничение и может быть оценена с использованием широкого спектра методов визуализации 8,10,17,18, однако изменения в морфологии могут не отражать спектр потенциальных эффектов лекарственного препарата, таких как апоптоз и изменения жизнеспособности клеток. Мы наблюдали значительную вариабельность морфологических изменений в ответ на лекарственные препараты от модели к модели. Например, некоторые PDO будут увеличиваться в площади по мере того, как они подвергаются апоптозу, в то время как другие модели могут уменьшаться. В ограниченном числе исследований кинетические морфологические оценки были мультиплексированы либо с фиксированными, либо с флуоресцентными конечными точками живых клеток^18,20. Представленные здесь методы являются одними из первых для мультиплексирования различных флуоресцентных красителей для одновременной оценки нескольких клеточных эффектов в высокопроизводительной системе.

Одним из самых больших улучшений, обеспечиваемых кинетической визуализацией живых клеток, является то, что она преодолевает ключевые ограничения, связанные с анализом конечных точек. Например, нанесение одинакового количества PDO на лунку технически сложно, поскольку большинство автоматических счетчиков клеток предназначены для объектов размером менее 60 мкм. Визуализация живых клеток позволяет нормализовать количество или площадь PDO в момент времени 0 ч в каждой лунке, что затем может быть использовано для корректировки различий в покрытии между лунками. Золотым стандартом анализа конечной точки для PDO является набор CellTiter-Glo 3D, который измеряет АТФ в качестве суррогата жизнеспособности клеток. Мы широко использовали этот анализ в наших исследованиях гинекологического рака и рака предстательной железы^PDO 13,21,22,23,24. В дополнение к требованию лизиса клеток для измерения АТФ, лекарственные препараты и другие терапевтические методы могут изменять уровни АТФ, потенциально обеспечивая неточную оценку терапевтического ответа. Использование красителей для визуализации живых клеток позволяет количественно оценить более широкий спектр специфических клеточных реакций, таких как апоптоз и цитотоксичность. Важно отметить, что эти реагенты не нарушают жизнеспособность клеток и не вызывают повреждения ДНК, как в случае с йодидом пропидия; это позволяет многократно оценивать реакцию PDO с течением времени. Несмотря на то, что мы не изучали использование акридинового оранжевого (АО) для кинетических мер, механизм действия АО не должен препятствовать такому применению в будущем.

Опухоли состоят из нескольких различных клеточных популяций с различными геномными профилями и морфологией. Из-за сложной гетерогенности моделей PDO отдельные ответы PDO могут различаться, и отслеживание этих ответов является сложной задачей. Наш протокол предоставляет метод оценки нескольких показателей реакции PDO на основе скважины за скважиной. Тем не менее, некоторые технические соображения по-прежнему применимы к визуализации живых клеток. Количество лунок 24-луночной пластины, необходимых для засева 96-луночной пластины, будет зависеть от плотности и скорости роста каждой модели PDO. Поскольку комкование может затруднить анализ изображений (дополнительный рисунок 4), моделям PDO могут потребоваться дополнительные этапы обработки перед нанесением покрытия. При необходимости PDO могут быть механически срезаны во время обработки с помощью энергичного пипетирования наконечником p200 с нешироким отверстием. Ферментативное расщепление с использованием TrypLE Express также может быть использовано перед нанесением покрытия, чтобы способствовать диссоциации PDO и уменьшению слипания. В нашем опыте мы отметили, что продолжительность инкубации TrypLE сильно варьируется в зависимости от модели. Таким образом, инкубация TrypLE должна быть оптимизирована для каждой модели, особенно если исследователи хотят получить одноклеточные суспензии. Время восстановления до начала лечения может потребоваться для моделей PDO, которые особенно чувствительны к ферментативному перевариванию.

Мы представляем методы для специфических реагентов для визуализации живых клеток. Ограничением широкой применимости методов, представленных в настоящем документе, является нехватка реагентов, совместимых с БМЭ. Для других красителей/реагентов, которые еще не были оптимизированы для использования в PDO, может потребоваться дополнительное устранение неполадок для определения оптимальной концентрации и минимизации воздействия растворителей. В зависимости от интересующего показателя (например, апоптоза или цитотоксичности) для оптимизации условий реагента следует использовать лечение соединением, которое, как известно, индуцирует гибель клеток, таким как ставроспорин или даунорубицин¹³ . Дополнительным фактором является оптимальное время для интеграции красителя в купол BME. В наших экспериментах мы проводим ночную инкубацию перед обработкой, чтобы обеспечить полное поглощение красителя куполами, а также определить исходное состояние клеток. Поскольку интенсивность сигнала со временем будет увеличиваться, исследователи должны провести пилотные исследования с красителями, чтобы определить идеальное время экспозиции в конце эксперимента, чтобы избежать переэкспонированных изображений. Наконец, реагенты не должны вмешиваться в клеточные процессы. Например, красители, которые встраиваются в ДНК, несовместимы с кинетической визуализацией. Тем не менее, визуализация живых клеток может быть использована для нормализации данных в анализах конечных точек. Действительно, мы представляем дополнительный метод для количественной оценки жизнеспособности клеток и соотношения жизнеспособных и мертвых клеток с помощью AOPI. В этом эксперименте флуоресцентный сигнал нормируется к числу PDO для каждой лунки, определяемому с помощью визуализации живых клеток на 0-й день (день лечения, рис. 6).

Еще одним ограничением этого метода является использование ручного пипетирования для экспериментов, что может привести к большей вариативности технических повторений. Дальнейшее улучшение воспроизводимости данных может быть достигнуто путем добавления автоматизации к другим этапам экспериментального процесса, таким как использование автоматизированного манипулятора жидкостями для нанесения покрытий и дозирования лекарств, как это было продемонстрировано другими специалистами ^8,10. Однако это дополнение требует дополнительных инвестиций в исследовательскую инфраструктуру, которая может быть доступна не всем исследователям. Учитывая неоднородность области PDO для каждой модели, нормализация результатов до начального числа PDO или области в момент времени 0 ч по-прежнему является полезным подходом с автоматическим посевом.

Ключевым преимуществом Cytation 5 по сравнению с другими платформами визуализации живых клеток является возможность настройки функций визуализации и анализа. Тем не менее, программное обеспечение Cytation 5/Gen5 имеет крутую кривую обучения и предполагает, что пользователи обладают базовыми знаниями в области визуализации. Одной из целей этой статьи является предоставление пошаговых инструкций по снижению барьера для других исследователей при включении сложных методов визуализации живых клеток в свои исследовательские программы PDO. Несмотря на то, что конкретные этапы анализа, представленные в настоящем документе, относятся к одной системе, пользователи могут применять принципы мультиплексирования к другим платформам, понимая, что последующий анализ может потребовать использования стороннего программного обеспечения, такого как NIH ImageJ.

Метрики анализа следует выбирать, исходя как из целей эксперимента, так и из условий нанесения покрытия. Например, если эксперимент проводится с использованием флуоресцентного красителя для количественной оценки гибели клеток, интенсивность флуоресценции является эффективным считыванием. Наиболее эффективный показатель флуоресценции (Общая флуоресценция в сравнении со средней интенсивностью объекта) будет зависеть от условий нанесения покрытия (дополнительный рисунок 4). Если PDO равномерно распределены и имеют более круглую, связную морфологию, флуоресценцию можно определить в определенной субпопуляции PDO. Специфической функцией в программном обеспечении Gen5 является клеточный анализ, а на выходе — средняя интенсивность объекта. Однако, если модель PDO комковата или имеет дискогезивную морфологию, мы рекомендуем количественно оценить сигнал флуоресценции на уровне изображения; Эту функцию можно найти в разделе Статистика изображения, а на выходе — Общая интенсивность флуоресценции. Несмотря на то, что этот метод полезен для наблюдения за изменениями на уровне отдельных скважин, этот показатель не является специфичным для интересующих объектов и может ошибочно изменяться, если PDO перемещаются за пределы назначенной пробки в течение всего эксперимента. В сценариях, в которых имеется значительное количество мусора или мертвых отдельных клеток, рекомендуется использовать клеточный анализ для устранения любого флуоресцентного сигнала, который не связан конкретно с PDO. Пример дифференциальных результатов с использованием клеточного анализа и статистики изображений представлен на дополнительном рисунке 5.

Для определения оптимального порога для функции Статистика изображений можно использовать инструмент Линия. С помощью инструмента «Линия» пользователи могут определить диапазон интенсивности флуоресценции в изображении. Мы устанавливаем нижний порог как 25% значения пиковой интенсивности в изображении. Чтобы просмотреть флуоресцентные области, которые входят в обозначенный порог, установите флажок «Пороговые выбросы». Может потребоваться дополнительная тонкая настройка нижнего порогового значения.

Серьезной проблемой при визуализации живых клеток является хранение огромного количества данных, генерируемых в каждом эксперименте. Это особенно актуально в случае культур PDO, где Z-стеки используются для получения изображения в нескольких фокальных плоскостях и создания Z-проекции. Существует несколько способов решения этой проблемы. Во-первых, обеспечьте достаточную вместимость хранилища. Мы установили три твердотельных жестких диска общим объемом 17 ТБ. Другие варианты включают перенос экспериментальных файлов на внешние жесткие диски или сетевое хранилище. Не рекомендуется напрямую записывать файлы в облачное хранилище. Чтобы проанализировать данные, хранящиеся на внешнем диске, просто перенесите эксперимент и файлы изображений на компьютер, оснащенный программным обеспечением 5-го поколения (ПРИМЕЧАНИЕ: передача больших файлов может занять длительное время). Перед анализом изображения необходимо повторно привязать к эксперименту. Откройте файл эксперимента, нажмите «Протокол» на панели инструментов, выберите «Параметры протокола». Щелкните Параметры сохранения изображения и выберите Выбрать новую папку изображения. Найдите файл изображения и нажмите «Выбрать папку для повторной привязки».

В зависимости от целей эксперимента также может подойти использование функции биннинга в 5-м поколении. Биннинг уменьшает размер файла за счет уменьшения количества пикселей, что приводит к снижению разрешения изображения (см. шаг 3.5.3.2). Поэтому биннинг не рекомендуется, если требуются изображения с высоким разрешением. При использовании функции биннинга необходимо отрегулировать настройки экспозиции. После того, как экспериментальный файл будет создан, дважды щелкните по разделу Image (Изображение) и щелкните значок микроскопа, чтобы снова открыть ручной режим Imager. Используйте функцию автоматической экспозиции или при необходимости отрегулируйте экспозицию вручную.

Таким образом, представлены методы оценки апоптоза и клеточного здоровья ЗОП в ответ на цитотоксические агенты. Дальнейшие исследования необходимы для оптимизации методов и разработки дополнительных стратегий анализа для кинетической визуализации ЗОП, таких как другие фенотипы и эффекты препаратов, которые являются цитостатическими, а не цитотоксическими. Основным препятствием является коммерческая доступность красителей и реагентов, совместимых с BME. Предстоит еще много работы, чтобы лучше понять, как кинетическая визуализация живых клеток может быть полностью использована для извлечения наибольшего количества данных из этих моделей.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrfuge tube	Dot Scientific Inc	1008113
15 mL conical centrifuge tube	Sarstedt	62.554.100
554 NM LED Cube	Agilent	1225012
96-well plate	Corning Costar	3596	Prewarmed to 37 °C
96-well plate	Agilent	204626-100	Prewarmed to 37 °C
A83-01	Tocris	2939	Final concentration is 500 nM (component of organoid culture media)
Advanced DMEM/F-12	Gibco	12634-010	component of organoid culture media
B27 Supplement	Gibco	17504044	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
BioTek BioSpa 8 Automated Incubator	Agilent	BIOSPAG-SN	Tabletop incubator; BioSpa OnDemand scheduling software comunicates with Gen5 to transfer plates between the BioSpa and the Cytation 5 for imaging (this protocol uses version 1.01.10)
BioTek Cytation 5 Cell Imaging Multimode Reader	Agilent	CYT5PW-SN	Plate reader; Gen5 software is used for this device (this protocol uses version 3.12.08)
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	R&D Systems	BME001-10
Daunorubicin HCl	Sigma-Aldrich	S3035	Reconstituted in DMSO
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2438
EDTA (0.5 M)	Thermo Fisher	AM9260G
Forskolin	Tocris	1099	Final concentration is 10 µM (component of organoid culture media)
Glutamax	Gibco	35050-061	Final concentration is 1x (component of organoid culture media)
HEPES	Gibco	15630-080	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Human EGF, Animal-Free Recombinant Protein	Gibco	AF-100-15-1MG	Final concentration is 0.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Human FGF-10 Recombinant Protein	Gibco	100-26-1MG	Final concentration is 10 ng/mL (component of organoid culture media)
Human R-Spondin 1 Recombinant Protein	Gibco	120-38-5UG	Final concentration is 250 ng/mL (component of organoid culture media)
Hydrocortisone Stock Solution	StemCell Technologies	7926	Final concentration is 500 ng/mL (component of organoid culture media)
Imaging Filter Cube- GFP	Agilent	1225101
Imaging Filter Cube- TRITC	Agilent	1225125
Imaging LED GFP/CFP	Agilent	1225001
Incucyte Annexin V Red Dye	Sartorius	4641	Reconstituted in organoid culture media
Incucyte Cytotox Green Dye	Sartorius	4633	DMSO solution
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Final concentration is 1.25 mM (component of organoid culture media)
Nexcelom Bioscience ViaStain AOPI Staining Solution	Fisher-Scientific	13366169	Add 1:50 volume
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636	Final concentration is 10 mM (component of organoid culture media)
Noggin	R&D Systems	6057-NG	Final concentration is 100 ng/mL (component of organoid culture media)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122	Final concentration is 10 units/mL (component of organoid culture media)
Phosphate Buffered Saline (1x)	Gibco	14190-144
Primocin	InvivoGen	ant-pm-05	Final concentration is 100 µg/mL (component of organoid culture media)
Recombinant Human Heregulinβ-1	Pepro Tech	100-03	Final concentration is 37.5 ng/mL (component of organoid culture media)
Staurosporine solution from Streptomyces sp.	Sigma-Aldrich	S6942
TrypLE Express	Life Technologies	12604013
Y-27632, CAS 331752-47-7	Sigma-Aldrich	688000	Final concentration is 5 µM (component of organoid culture media)
β-Estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	Final concentration is 100 nM (component of organoid culture media)