ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Здесь мы представляем комбинацию эффективных методов рестрикции крыс и подключичной пункции вен, которые позволяют быстро, безопасно и многократно собирать кровь у крыс без анестезии.
Abstract
Существует несколько общепринятых методов получения повторных образцов крови крыс, наиболее часто используемыми методами являются забор боковых вен хвоста без анестезии и забор яремной вены с анестезией. Однако большинство из этих методов требуют помощи и анестезиологического оборудования, а иногда создают трудности с точки зрения забора крови или низкого качества образцов крови. Кроме того, эти способы забора крови отнимают значительное время и человеческие ресурсы, когда требуется повторный забор крови для большого количества крыс. В этом исследовании представлена методика повторного забора крови у крыс без анестезии одним опытным человеком. Высокоудовлетворительные образцы крови можно получить путем пункции подключичной вены. Метод продемонстрировал впечатляющий общий показатель успеха в 95%, при этом среднее время от фиксации крысы до завершения забора крови составило всего 2 минуты. Кроме того, последовательный забор крови в пределах установленного диапазона не причиняет крысам никакого вреда. Этот метод стоит продвигать для забора крови, особенно в крупномасштабных фармакокинетических исследованиях.
Introduction
Крысы являются одними из самых распространенных экспериментальных животных, и существует множество способов получения образцов крови. Для экспериментов, предполагающих однократный забор крови на заключительном этапе, достаточное количество крови может быть получено путем пункции сердца или забора крови из брюшной аорты1. Тем не менее, некоторые исследования требуют повторного забора крови у крыс для рутинного анализа крови или биохимического анализа, особенно в фармакокинетических и токсикологических исследованиях, где повторный забор крови требуется для определения абсорбции, распределения и метаболизмалекарственных средств.
В настоящее время, несмотря на то, что забор крови из хвостовых вен является наиболее распространенным методом забора крови у крыс, несмотря на то, что он не требует анестезии, этот метод может быть сложным для повторных сборов, а объем собранной крови относительно невелик 3,4. Кроме того, хотя кровь может быть взята из подкожных вен и вен полового члена, количество получаемой крови ограничено, и требуется анестезия 1,5. Кроме того, образцы крови, взятые из подчелюстного венозного сплетения, а также из подъязычных, яремных и подключичных вен, обеспечивают более высокое качество образцов, но, как правило, требуют анестезии или помощи нескольких человек 1,6,7,8,9. Наконец, забор крови из ретроорбитальных синусов/каналов не только требует анестезии, но и потенциально может вызвать травмы и стресс у крыс9.
Качество образцов крови, обычно получаемых из магистральных вен, как правило, соответствует самым высокимстандартам1. В настоящее время некоторые исследования показали, что непрерывный микрозабор проб через яремную вену является очень подходящим методом для токсикологических исследований на крысах, хотя этот метод обычно требует катетеризации яремной вены 10,11,12. Поэтому стоит изучить, как получить высококачественные образцы крови в соответствии с принципом 3R исследований на животных без хирургического вмешательства. Целью данного исследования было представить способ эффективного извлечения крови из подключичной вены у крыс. Этот метод позволяет быстро собрать удовлетворительные образцы с помощью процедуры одного человека без необходимости анестезии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Данное исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами, изложенными в 8-м издании Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию13. Исследование получило одобрение Комитета по этике Второй больницы Ланьчжоуского университета и было задокументировано в соответствии с руководящими принципами ARRIVAL 2.014. Двенадцать здоровых крыс линии Вистар (шесть самцов весом 290-330 г и шесть самок весом 250-280 г) в возрасте 12-16 недель были помещены в лабораторию животных GLP Университета Ланьчжоу в течение 3 дней до фактического эксперимента. Использовались клетки для крыс типа R5 размером 545 мм x 395 мм x 200 мм и были оснащены автоклавной подстилкой. Всем крысам был предоставлен неограниченный доступ как к пище, так и к воде. В лаборатории поддерживалась средняя влажность 25%, средняя температура 24 °C, а световой цикл чередовался между днем и ночью (7:00/19:00). В конце исследования все животные были гуманно усыплены с помощью передозировки изофлурана. Для получения исчерпывающей информации о материалах и инструментах, использованных в этом исследовании, пожалуйста, обратитесь к таблице материалов.
1. Расчет объема выборки и отбор животных
- Выберите методуравнения ресурсов 15 , чтобы оценить размер выборки животного с помощью уравнения (1).
E = Общее количество животных − Общее количество групп (1)
Где E – степень свободы дисперсионного анализа (ANOVA) и колеблется от 10 до 20.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании 12 животных были разделены на две группы А и В (три самца и три самки в группе). - Определите первичный исход этого исследования как частоту успеха и время, затрачиваемое на повторный забор крови одним человеком.
- Определите вторичные критерии оценки исходов как изменения массы тела крысы, потребления пищи и воды, а также частоту нежелательных явлений (таких как переломы ключиц, подкожные гематомы, пневмоторакс и смертность).
- Определить успешный отбор крови как соответствующий следующим критериям: i) менее трех пункций для одного забора крови; ii) общее время (от удержания крысы до завершения забора крови) не более 5 мин; и iii) достижение целевого объема крови при получении прозрачной плазмы. Любое отклонение от этих критериев считается ошибкой выборки.
2. Удержание животных и забор крови
Образцы крови крыс групп А и В были собраны двумя опытными исследователями, каждый из которых взял не менее 100 образцов крови. Образцы крови были взяты у обеих групп крыс в общей сложности 96 раз в течение 4 дней. Этот метод забора крови не требует анестезии или дополнительных удерживающих устройств для крыс. Тем не менее, это требует искусных методов обращения.
- В 8:00 утра за день до забора крови (день 1) поместите каждую крысу в отдельную клетку, пока ее еда и вода будут взвешены. Затем попросите другого исследователя, слепого к измерениям, записывать вес крыс, потребление пищи и воды каждый день в 8:00 утра, начиная с первого дня.
- Чтобы следовать этому протоколу, сначала берите кровь в 10:00, а затем в 22:00 каждый день, собирая 0,15 мл крови поочередно из подключичных вен с обеих сторон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество крови, которое должно было быть собрано, определялось максимальным объемом, который крыса с самым низким весом могла выдержать в течение недели. - Промыть шприц гепарином натрия (25 Ед/мл) и продезинфицировать место инъекции спиртом.
- Осторожно погладьте кожу спины крысы и несколько раз ущипните ее за шею, чтобы помочь крысе расслабиться (видео 1).
- Большим и указательным пальцами недоминантной руки крепко возьмитесь за кожу шеи крысы и приподнимите ее (рис. 1А и видео 1).
- Координируя действия доминирующей руки, используйте оставшиеся три пальца и ладонь недоминантной руки, чтобы закрепить кожу спины крысы и обездвижить ее передние конечности (рис. 1B, C и видео 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если крыса сопротивляется или сопротивляется, эту процедуру можно повторить несколько раз, чтобы помочь крысе привыкнуть к обращению. Следующие шаги являются ключом к успешному сбору крови. - Указательным пальцем недоминантной руки осторожно надавите на кожу головы крысы, в то время как другие пальцы вместе с ладонью помогают вращать плечевой сустав наружу. Во время этого процесса используйте доминирующую руку, чтобы полностью разогнуть плечевой сустав крысы (рис. 1D-F и видео 2).
- Крепко возьмитесь за крысу недоминантной рукой, чтобы выровнять голову и тело крысы по прямой линии (рис. 1G, H). Затем доминирующей рукой определите положение ключицы и подтвердите место прокола (рис. 1I, видео 2 и видео 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Брить крысу не нужно. На рисунке 1 бритье проводилось только для того, чтобы лучше показать положение ключицы и прокола. При сдерживании крыс, особенно крыс >350 г, если крыса будет опираться ногами на твердую поверхность, это поможет поддерживать вес ее тела. Кроме того, ограничитель должен контролировать частоту дыхания каждой крысы во время забора крови, чтобы убедиться, что удерживающий механизм не слишком тугой, что может вызвать респираторный дистресс. - Держа шприц параллельно телу крысы в доминирующей руке, кончиком иглы вверх, а шкалой шприца к экспериментатору, сохраняйте угол примерно 15° со средней линией тела крысы. Введите иглу на 0,5 см ниже выемки ключицы (на стыке проксимальной трети ключицы и грудины), следя за тем, чтобы игла оставалась параллельной телу крысы (рисунок 1J и видео 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Особое внимание следует обратить на угол и глубину введения иглы, чтобы избежать прокалывания кровеносного сосуда или непреднамеренного повреждения соседних сосудов. - Осторожно слегка отдергивайте шприц, чтобы создать отрицательное давление, часто сопровождающееся ощущением прорыва при входе в кровеносный сосуд (особенно выраженным во время первоначального забора крови). Сохраняйте это положение и собирайте 0,1-1,0 мл крови с постоянной скоростью по мере необходимости (в соответствии с рекомендациями IACUC о примерно 4-5,3 мл/кг крови в неделю1) (Рисунок 1K и Видео 3).
- Если при проколе нет крови, попробуйте аккуратно отрегулировать угол и глубину иглы или аккуратно повернуть шприц (Видео 3). Если три последовательные попытки на одной и той же стороне не увенчались успехом, остановите все кровотечения, а затем переключитесь на противоположную сторону для прокола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется быстрый прокол кожи, чтобы крыса не боролась из-за дискомфорта. - Приложите ватный тампон для гемостаза и верните крысу в клетку (Видео 4).
- Обработайте образцы крови в соответствии с требованиями эксперимента.
3. Обработка образцов крови
- Выбросьте иглу шприца в контейнер для острых предметов. Собранную кровь переложить в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл, предварительно промытую гепарином. Поместите пробирку в центрифугу, установив ее на 4 °C и 1 200 x g, и центрифугируйте в течение 10 минут для отделения плазмы. Перелейте сыворотку с помощью пипетки Пастера объемом 1,0 мл в чистую микроцентрифужную пробирку и храните ее при температуре -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить гемолиз из-за давления, при необходимости удалите кончик иглы. Во время аспирации плазмы избегайте забора клеток крови со дна пробирки. Иногда на поверхности шприца может собираться крысиная шерсть; Следите за тем, чтобы шерсть не попала в трубку, так как это может привести к образованию тромбов.
4. Статистический анализ
- Представьте все данные в виде среднего ± стандартного отклонения и проверьте их на однородность дисперсии.
- Используйте точный критерий Фишера, чтобы сравнить показатели успешности между группами.
- Используйте двухвыборочный независимый t-критерий для сравнения общих средних значений между двумя группами.
- Используйте дисперсионный анализ (ANOVA) для непрерывных измерений, таких как время забора крови, масса тела, потребление пищи и воды. Считать P < 0,05 статистически значимым.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Высококачественные образцы плазмы имеют бледно-желтый оттенок, чистоту и прозрачность, лишенные какого-либо красного оттенка или сгущения, как показано на рисунке 2A. На рисунке 2В показан гемолиз (левая сторона) или коагуляция (правая сторона) в результате неправильных процедур соответственно. За 96 сеансов забора крови в течение 4 дней среднее время забора одной крови для групп А и В составило 119,87 ± 33,62 с и 123,28 ± 30,96 с соответственно. Существенной разницы во времени забора крови между двумя группами в сутки не выявлено (t = 0,66, P = 0,54, табл. 1). Наименьшее время индивидуального забора крови составило 78 с и 89 с соответственно.
Среднее количество попыток, необходимых для успешного забора одной крови, составило 1,21 и 1,17 для групп А и В соответственно. Достоверной разницы в количестве попыток между двумя группами не выявлено (t = 0,58, P = 0,60, табл. 2). Общие показатели успешности составили 93,8% (45/48) и 95,8% (46/48) для групп А и В соответственно, без существенной разницы в общих показателях успешности между двумя группами (P > 0,05, табл. 1). Существенной разницы во времени забора крови в группе В в каждый момент времени не выявлено. В группе А время забора крови на вторые сутки было меньше, чем на четвертые сутки (105,75 ± 14,22 с против 144,5 ± 25,45 с, t = 12,39, P < 0,01; Таблица 1) См. Кроме того, большее количество попыток и более длительное время прокола часто указывают на более высокую частоту неудач (рис. 3A-C). На третий день группа В столкнулась с одной неудачей, связанной с гемолизом. На четвертый день группа А столкнулась с тремя неудачами: одна из-за гемолиза, а две другие из-за невозможности получить образцы крови. Группа В также испытала одну неудачу из-за невозможности получить образец крови.
В течение 4 последовательных дней наблюдения обе группы крыс демонстрировали устойчивую прибавку в весе. Потребление воды и пищи оставалось относительно постоянным среди крыс того же пола. На протяжении всего процесса забора крови не было зафиксировано ни одного случая гибели крыс, а также не наблюдалось каких-либо существенных осложнений, таких как переломы ключиц, пневмоторакс или гематомы в местах прокола (рис. 3D-F и табл. 3).
Рисунок 1: Методы фиксации и забора крови подключичной вены у крыс. (А-Н) Манипуляции фиксации; (I) местоположение ключицы и места забора крови; (J-L) процесс забора крови и гемостаза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Успешные и неудачные взятые образцы крови. А) типичные образцы крови и изолированная плазма; (B) гемолизированные (слева) и свернутые (справа) образцы крови Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Оценка эффективности и безопасности забора крови. А) среднее время забора крови в сутки; (Б) среднее число пункций в день; (C) показатели успешности и неудач забора крови в обеих группах; (D-F) изменения массы тела, потребления пищи и воды во время забора крови в обеих группах крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Анатомия сосудов шеи крысы. А) поверхностные анатомические структуры; (Б) глубокие анатомические структуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Группа | Время | Среднее время забора крови (с) | |||
| День 1 | День 2* | День 3 | День 4 | ||
| A | 10:00 | 92,83 ± 7,38 | 100,5 ± 17,36 | 117.83 ± 12.02 | 146,6 ± 24,76 |
| 22:00 | 108,67 ± 10,86 | 111.00 ± 6.95 | 158,33 ± 60,47 | 142.40 ± 25.96 | |
| Среднее время | 100.75 ± 12.20 | 105.75 ± 14.22 | 138.08 ± 48.07 | 144,5 ± 25,45 | |
| Процент успеха | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 75% (9/12) | |
| Общий процент успеха | 93.8% (45/48) | ||||
| Общее среднее время | 119,87 ± 33,62 | ||||
| B | 10:00 | 98.17 ± 7.24 | 110.17 ± 14.33 | 123,67 ± 30,99 | 147,2 ± 17,47 |
| 22:00 | 106.00 ± 14.35 | 126.67 ± 17.12 | 123.17 ± 17.50 | 165,67 ± 49,70 | |
| Среднее время | 102.08 ± 12.02 | 118.42 ± 17.82 | 123.92 ± 25.16 | 157,27 ± 39,63 | |
| Процент успеха | 100% (12/12) | 100% (12/12) | 91.7% (11/12) | 91.7% (11/12) | |
| Общий процент успеха | 95.8% (46/48) | ||||
| Общее среднее время | 123.28 ± 30.96 | ||||
Таблица 1: Время забора крови и показатели успешности двух групп крыс. *Время забора крови во вторые сутки было меньше, чем в четвертые сутки в группе А (t = 12,39 Р < 0,01).
| Группа | Время | Среднее количество проколов | |||
| День 1 | День 2 | День 3 | День 4 | ||
| A | 10:00 | 1 | 1 | 1 | 1.67 |
| 22:00 | 1 | 1 | 1.33 | 1.67 | |
| Средний | 1 | 1 | 1.17 | 1.67 | |
| Общий средний | 1.21 | ||||
| B | 10:00 | 1 | 1 | 1.17 | 1.5 |
| 22:00 | 1.17 | 1 | 1.17 | 1.33 | |
| Средний | 1.08 | 1 | 1.17 | 1.42 | |
| Общий средний | 1.17 | ||||
Таблица 2: Среднее число пункций для забора крови у крыс.
| Род | Группа | Вес (г) | Потребление пищи (г) | Водозабор (г) | |||||||||
| День 1 | День 2 | День 3 | День 4 | День 1 | День 2 | День 3 | День 4 | День 1 | День 2 | День 3 | День 4 | ||
| ♀ | A | 260 ± 7,5 | 267,7 ± 6,3 | 271 ± 5.4 | 278 ± 6.5 | 13,3 ± 0,79 | 13,5 ± 0,93 | 14,0 ± 0,29 | 14,0 ± 0,77 | 23,9 ± 0,36 | 23,1 ± 0,77 | 24,4 ± 0,70 | 24,6 ± 0,12 |
| B | 262 ± 12.8 | 268,3 ± 14,0 | 272,7 ± 9,4 | 279 ± 7.0 | 14,4 ± 0,45 | 13,9 ± 0,52 | 14,7 ± 0,26 | 14,3 ± 0,56 | 23,6 ± 0,73 | 23,7 ± 0,65 | 24,4 ± 0,91 | 24,1 ± 1,79 | |
| Т/К | 0.35 | 0.09 | 0.38 | 0.23 | 2.44 | 1.22 | 2.34 | 1.12 | 0.43 | 0.76 | 0.00 | 0.71 | |
| Скорректированное значение P | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | 0.68 | 0.98 | 0.71 | 0.99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | >0,99 | |
| ♂ | A | 313,7 ± 12,0 | 325,7 ± 9,1 | 329 ± 14.2 | 340 ± 15,6 | 15,9 ± 0,64 | 16,2 ± 0,08 | 15,7 ± 0,70 | 15,9 ± 0,73 | 26,2 ± 0,62 | 27,2 ± 0,9 | 26,9 ± 1,0 | 25.3 ± 1.1 |
| B | 311 ± 16,4 | 322,3 ± 18,0 | 330,7 ± 17,6 | 342 ± 16.9 | 15,3 ± 0,74 | 15,7 ± 0,85 | 15,1 ± 0,33 | 15,3 ± 0,86 | 27,1 ± 0,37 | 25.6 ± 1.27 | 27,5 ± 0,76 | 26,2 ± 0,99 | |
| q | 1.50 | 1.88 | 0.94 | 1.13 | 2.34 | 1.85 | 2.10 | 1.97 | 1.90 | 3.57 | 1.24 | 1.82 | |
| Скорректированное значение P | 0.94 | 0.86 | >0,99 | 0.99 | 0.71 | 0.87 | 0.79 | 0.83 | 0.86 | 0.33 | 0.98 | 0.88 | |
Таблица 3: Изменение суточной массы тела, потребления пищи и воды крысами.
Видео 1: Успокоение и обращение с крысами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Видео 2: Процедуры сдерживания крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Видео 3: Процедура забора крови у крыс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Видео 4: Гемостатическая компрессия в месте пункции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несмотря на то, что забор крови из хвостовой вены является наиболее распространенным методом повторного забора крови у крыс, на него могут влиять анестезирующие препараты, а из-за небольшого размера хвостовой вены количество крови, которое может быть собрано за один раз, ограничено, что приводит к увеличению продолжительности забора крови 4,5. Несмотря на то, что высокоэффективные системы жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) в сочетании с капиллярной микровыборкой (КМС) вен хвоста крысы могут уменьшить количество крови, используемой у крыс11, не все учреждения оснащены этим дорогостоящим оборудованием. Забор крови из ретробульбарного сплетения/синуса часто вызывает беспокойство и боль у крыс, а неправильная эксплуатация может даже повредить зрению и здоровью крыс. Поэтому этот метод не рекомендуется для забора крови у крыс9.
Подключичная вена расположена между большой грудной мышцей и дельтовидной мышцей крысы и впадает в яремную вену на трети внутренней ключицы (рис. 4). В исследовании Yang et al. успешность забора крови из подключичной вены у крыс под наркозом составила примерно 90% квалифицированным оператором, минимальное время которого от начала до конца пункции составляло 65с7. В исследовании Wang et al. образцы крови были взяты из подключичной вены крысы с использованием вертикального подхода. Несмотря на то, что их метод не включал анестезию, он требовал сотрудничества двух человек, чтобы надежно ограничить крысу6. Этот протокол исследования показывает хорошее преимущество забора крови. Этот протокол не требует каких-либо специальных удерживающих устройств или анестезиологического оборудования. При правильном обращении крысы, как правило, проявляют минимальное сопротивление. Среднее время от удержания крыс до завершения забора крови составило всего 2 минуты, что позволило достичь впечатляющего общего показателя успеха в 95%. Этот метод значительно экономит человеческие ресурсы и сокращает время, необходимое для забора крови. Кроме того, полученные образцы плазмы получаются чистыми и прозрачными, с минимальным возникновением событий гемолиза и свертывания крови, что сводит к минимуму повторение эксперимента. Владение этой техникой особенно ценно для проведения крупномасштабных фармакокинетических и токсикологических экспериментов на крысах, требующих многократного забора крови.
В нашем исследовании основной случай недостаточности забора крови был на 4-й день, что может быть связано с повреждением вен, вызванным повторными пункциями. Повторные проколы могут привести к повреждению сосудистой стенки и спровоцировать воспалительную реакцию, в результате чего сосудистая стенка утолщается и затвердевает, и даже вызывает сужение сосудов. Если гемостаз после пункции недостаточен, экстравазированная кровь может в дальнейшем вызвать отек тканей и воспаление, что впоследствии приведет к образованию рубцовой ткани. В эти рубцовые ткани трудно проникнуть, а также они могут растягивать и заставлять кровеносные сосуды смещаться, что затрудняет их обнаружение и прокол. В нашем исследовании для забора крови использовался шприц весом 26 г (0,45 мм), который хорош по сравнению с человеческими венами, но все же наносит значительный ущерб венам крыс. Об этом свидетельствует четкое ощущение проникновения при прохождении иглы через сосуд во время первого забора крови, которое уменьшается по мере увеличения количества заборов крови, с более длительным временем забора крови и более высокой частотой неудач. Поэтому мы рекомендуем использовать более тонкую иглу инсулина для забора крови, и после забора крови следует прикладывать адекватное давление, чтобы предотвратить образование гематомы, а также проводить поочередные заборы крови, чтобы обеспечить достаточное восстановление вен. По нашему опыту, хорошо обученный флеботомист может использовать иглу 26G для поочередного забора крови из двусторонних подключичных вен одной и той же крысы 8-10 раз в течение 24 часов, со средним интервалом 2-3 часа между каждым забором крови. Тем не менее, максимальное количество заборов крови, которое может выдержать крыса, период восстановления и цикл забора крови могут зависеть от используемого игольчатого калибра, интервалов забора крови, требуемых различными экспериментами, и квалификации флеботомиста. Эти факторы нуждаются в дальнейшем изучении в будущих исследованиях. Для интенсивного забора крови, необходимого для фармакокинетических экспериментов, лучше поочередно брать кровь из левой и правой подключичной вены. В тех случаях, когда она действительно недоступна, могут быть дополнены другие методы забора крови.
Масса тела, потребление воды и пищи являются наиболее основными и понятными показателями для оценки состояния здоровья крыс16. Раннее исследование показало, что забор крови через яремную вену менее 0,9 мл в сутки не влияет на гемодинамику крыс и не приводит к какой-либо значительной потере веса. Однако, когда забор крови превышает 1,5 мл, это может привести к потере веса17. В исследовании Yokoya et al. повторный микроотбор проб из яремной вены (50 мкл каждый раз, 6-7 раз в течение 24 ч) не влиял на массу тела крыс или потребление пищи10. Кроме того, способ забора крови может влиять на массу тела и потребление пищи крысами. В предыдущем исследовании с использованием забора крови из сублингвальных вен 24-часовой сбор 0,5-1,0 мл крови в первый день привел к снижению массы тела крыс и уменьшению потребления пищи, хотя потеря веса небыла значительной. В этом исследовании масса тела крыс по-прежнему неуклонно увеличивалась в течение периода забора крови, и не было существенных изменений в потреблении пищи и воды, осложнений, связанных со сбором крови, и смерти крыс, что указывает на то, что этот метод безопасен и надежен.
Важно подчеркнуть, что приучение крыс к процессу удержания перед сбором крови, вероятно, уменьшит стресс у крыс и повысит вероятность успешного сбора крови. Недостаточная фиксация и недостаточное обнажение вен могут привести к сбоям в сборе крови и даже вызвать локальный разрыв вен из-за того, что крысы борются с болью. В более легких случаях это может привести к заметным подкожным гематомам, в то время как в тяжелых случаях это может привести к гибели крыс. Кроме того, плохая фиксация может привести к тому, что крысы сбегут и причинят вред людям. Поэтому мы настоятельно рекомендуем досконально освоить технику обращения, прежде чем приступать к процедуре забора крови. Кроме того, важно быть осторожным с силой, прилагаемой для вращения плечевого сустава наружу, так как чрезмерное давление может привести к переломам ключиц у крысы.
Ограничением этого исследования является то, что мы не оценивали систематически изменения стресса, вызванные этим методом забора крови у крыс, путем измерения изменений уровня кортикостерона или мониторинга в клетке, что должно быть изучено в будущих исследованиях. Еще одним ограничением данной статьи является отсутствие альтернативных методов забора крови в качестве контроля. Сравнение с другими методами забора крови на предмет их преимуществ и недостатков будет рассмотрено в будущих исследованиях. В целом, в этом исследовании представлен метод забора крови у крыс у одного человека без необходимости анестезии. Этот подход предлагает простой, быстрый и безопасный способ получения образцов крови у крыс.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет соответствующих финансовых или нефинансовых интересов, которые они могли бы раскрыть.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано проектом «План Цуйин» Второй больницы Университета Ланьчжоу (грант No 1). PR0121015) и Ключевая лаборатория исследований заболеваний мочевыделительной системы провинции Ганьсу (грант No 0412D2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.75% normal saline | Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. | —— | Prepared heparin sodium solution |
| 1 mL Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-01-NS | Blood collection |
| 1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) | Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. | 0.45*12RWLB | Blood collection |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Biosharp | BS-15-M | Blood storage and collection |
| 75% medical alcohol | Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. | —— | Disinfection of rat blood collection site |
| Centrifuge tube holder | Biosharp | BS-05/15-SM60 | —— |
| Electronic scale | Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. | JE1002 | Weigh |
| Heparin sodium injection | Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. | —— | Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL |
| Low temperature centrifuge | HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument Co., Ltd. | H1750R | Separation of serum |
References
- UCSF Office of Research Institutional Animal Care and Use Program. Blood collection: The rat IACUC Guideline. , https://iacuc.ucsf.edu/sites/g/files/tkssra751/f/wysiwyg/GUIDELINE%20-%20Blood%20Collection%20-%20Rat.pdf (2022).
- Hattori, N., Takumi, A., Saito, K., Saito, Y. Effects of serial cervical or tail blood sampling on toxicity and toxicokinetic evaluation in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (10), 599-609 (2020).
- Liu, X., et al. Modified blood collection from tail veins of non-anesthetized mice with a vacuum blood collection system and eyeglass magnifier. Journal of Visualized Experiments. (144), e65513 (2019).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Charlès, L., et al. Modified tail vein and penile vein puncture for blood sampling in the rat model. Journal of Visualized Experiments. (196), e65513 (2023).
- Wang, L., et al. Repetitive blood sampling from the subclavian vein of conscious rat. Journal of Visualized Experiments. (180), e63439 (2022).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Tochitani, T., et al. Effects of microsampling on toxicity assessment of hematotoxic compounds in a general toxicity study in rats. The Journal of Toxicological Sciences. 47 (7), 269-276 (2022).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sørensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Yokoyama, H., et al. Lack of toxicological influences by microsampling (50 µL) from jugular vein of rats in a collaborative 28-day study. The Journal of Toxicological Sciences. 45 (6), 319-325 (2020).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- Lu, W., et al. Microsurgical skills of establishing permanent jugular vein cannulation in rats for serial blood sampling of orally administered drug. Journal of Visualized Experiments. (178), e63167 (2021).
- National Research Council of the National Academies, Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edition, National Research Council, Washington D.C., USA. https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011).
- Perciedu Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. The Journal of Physiology. 598 (18), 3793-3801 (2020).
- Charan, J., Kantharia, N. D. How to calculate sample size in animal studies. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 4 (4), 303-306 (2013).
- Turner, P. V., Pang, D. S., Lofgren, J. L. A review of pain assessment methods in laboratory rodents. Comparative Medicine. 69 (6), 451-467 (2019).
- Kurata, M., Misawa, K., Noguchi, N., Kasuga, Y., Matsumoto, K. Effect of blood collection imitating toxicokinetic study on rat hematological parameters. The Journal of Toxicological Sciences. 22 (3), 231-238 (1997).
- Zeller, W., Weber, H., Panoussis, B., Bürge, T., Bergmann, R. Refinement of blood sampling from the sublingual vein of rats. Laboratory Animals. 32 (4), 369-376 (1998).
Tags
В этом месяце в JoVE выпуск 201 Крыса подключичная вена забор кровиErratum
Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.
The third paragraph in the Discussion section was updated from:
In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
to:
In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.
