Summary
Qui viene presentata la fabbricazione di un dispositivo a doppio strato basato su polidimetilsilossano (PDMS) per la produzione di librerie combinatorie in emulsioni acqua-in-olio (tappi). L'hardware e il software necessari per automatizzare la produzione di tappi sono dettagliati nel protocollo e viene dimostrata anche la produzione di una libreria quantitativa di tappi fluorescenti.
Abstract
La microfluidica a gocce è uno strumento versatile che consente l'esecuzione di un gran numero di reazioni in compartimenti nanolitari chimicamente distinti. Tali sistemi sono stati utilizzati per incapsulare una varietà di reazioni biochimiche, dall'incubazione di singole cellule all'implementazione di reazioni PCR, dalla genomica alla sintesi chimica. L'accoppiamento dei canali microfluidici con valvole di regolazione consente il controllo della loro apertura e chiusura, consentendo così la rapida produzione di librerie combinatorie su larga scala costituite da una popolazione di goccioline con composizioni uniche. In questo documento vengono presentati i protocolli per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo microfluidico a doppio strato basato su PDMS guidato dalla pressione che può essere utilizzato per generare librerie combinatorie di emulsioni acqua-in-olio chiamate tappi. Incorporando programmi software e hardware microfluidico, il flusso dei fluidi desiderati nel dispositivo può essere controllato e manipolato per generare librerie di tappi combinatoriali e per controllare la composizione e la quantità delle popolazioni di tappi costituenti. Questi protocolli accelereranno il processo di generazione di screening combinatori, in particolare per studiare la risposta ai farmaci nelle cellule delle biopsie dei pazienti oncologici.
Introduction
La microfluidica consente la manipolazione di piccole quantità di fluidi in microcanali1. La scala di funzionamento dei tipici dispositivi microfluidici è di decine o centinaia di micrometri, il che consente la miniaturizzazione delle reazioni chimiche e biologiche, consentendo così di eseguire tali reazioni con quantità relativamente piccole di reagenti. Inizialmente, i dispositivi microfluidici sono stati fabbricati con materiali come il silicio2 e il vetro3. Sebbene siano ancora in uso4, pongono alcuni problemi, come la compatibilità con i solventi, l'alto costo di produzione e le difficoltà nell'integrazione dei controlli per il flusso del fluido 5,6. Le metodologie di fabbricazione basate su PDMS, denominate soft-lithography, offrono un'alternativa economica per la prototipazione rapida di dispositivi7 e una strada per fabbricare dispositivi multistrato complessi8. L'aggiunta di valvole e pompe ai dispositivi PDMS consente di controllare il percorso e la velocità dei fluidi nei dispositivi 9,10. Sono stati sviluppati diversi metodi per progettare e azionare le microvalvole in modo reversibile o irreversibile, ad esempio valvole bimetalliche in silicio e alluminio, che vengono azionate termicamente11 o utilizzando gas generato da una reazione elettrochimica per deviare una membrana in nitruro di silicio12. Gu et al. dimostrano l'uso dei pin meccanici di un display Braille per applicare pressione sui microcanali per regolare il flusso13. Un set di microvalvole che ha guadagnato popolarità sono le valvole pneumatiche basate su PDMS introdotte dal gruppo di Stephen Quake14. Tipicamente, tali valvole sono composte da due microcanali ortogonali: un canale di flusso e un canale di controllo. Dopo la pressurizzazione del canale di controllo, una sottile membrana PDMS devia sul canale di flusso, chiudendolo e interrompendo così il flusso del fluido. Una volta depressurizzata, la membrana si rilassa, aprendo così il canale di flusso e consentendo la ripresa del flusso del fluido. Le valvole PDMS consentono quindi la regolazione del flusso in modo robusto e reversibile, poiché il canale di controllo può essere pressurizzato e depressurizzato più volte15. Inoltre, poiché tali valvole possono essere azionate mediante l'applicazione di pressione, aprono strade per il controllo digitale e l'automazione16. Inoltre, poiché sono dello stesso materiale, possono essere integrati senza soluzione di continuità nella fabbricazione di dispositivi basati su PDMS utilizzando tecniche di litografia morbida 8,17,18. Queste caratteristiche rendono le valvole PDMS una scelta interessante per la regolazione del flusso nei dispositivi microfluidici. Thorsen et al. hanno utilizzato il principio di tali valvole per progettare un multiplexer fluidico - una serie combinatoria di valvole pneumatiche - per indirizzare quasi un migliaio di canali di flusso in ingresso con venti canali di controllo19. Questo principio è stato esteso per instradare selettivamente i fluidi ai chemostati microfluidici in-chip in modo che reazioni uniche possano essere eseguite simultaneamente in ciascun reattore 20,21,22,23. Tuttavia, tali microreattori, sebbene utili per ottimizzare l'uso di reagenti limitati, non possono parallelizzare reazioni multiple e non sono sufficienti per studi ad alto rendimento.
La microfluidica delle goccioline è una sottocategoria della microfluidica che prevede la produzione di goccioline attraverso la manipolazione del flusso di liquido immiscibile e multifasico in dispositivi microfluidici24. La formazione di goccioline comporta la rottura di un fluido continuo mediante l'introduzione di un fluido immiscibile, con conseguente pinch-off dovuto all'instabilità dell'energia interfacciale e alla formazione di un'emulsione25. I tensioattivi aiutano nella formazione di goccioline arrotondate quando le emulsioni lasciano il microcanale stabilizzando le energie interfacciali26. Le goccioline più grandi, chiamate tappi, sono meno stabili e possono essere raccolte in un compartimento di contenimento (come un pezzo di tubo) come una serie di compartimenti acquosi distanziati su entrambi i lati da uno o più liquidi immiscibili27. Oltre alla miniaturizzazione e alla compartimentazione, la microfluidica delle goccioline offre anche una maggiore produttività delle reazioni biologiche, poiché è possibile produrre un gran numero di goccioline monodisperse, ciascuna delle quali funge da nanoreattore28. Le goccioline, una volta generate, possono anche essere sottoposte a ulteriori manipolazioni, come la scissione29,30, la fusione31,32, lo smistamento33,34 e l'assemblaggio in strutture di ordine superiore35,36. La microfluidica a gocce ha rivoluzionato diversi campi e tecnologie scientifiche: dalla PCR37 alla trascrittomica a singola cellula38, dalla scoperta di farmaci39,40 alla virologia41, dal sequenziamento di nuova generazione42 alla sintesi chimica43.
L'integrazione della litografia morbida basata su PDMS e delle microvalvole con la tecnologia delle goccioline è una potente combinazione che consente la regolazione del flusso del fluido nei microcanali e il successivo controllo del contenuto delle goccioline. A seconda dell'apertura e della chiusura dei canali, è possibile produrre popolazioni distinte di goccioline, ciascuna con una composizione specifica. Tale piattaforma potrebbe miniaturizzare, compartimentalizzare e parallelizzare le reazioni biochimiche e quindi essere una tecnica utile per lo screening combinatorio44. Lo screening combinatorio è un metodo ad alto rendimento per generare decine di migliaia di combinazioni di reagenti selezionati per produrre librerie costituite da singole popolazioni di composizione nota. Lo screening combinatorio è stato utilizzato per scoprire effetti sinergici tra farmaci e antibiotici per l'inibizione della crescita batterica45. Nel campo della terapia del cancro, lo screening combinatoriale è stato utilizzato per testare combinazioni di farmaci antitumorali per un determinato paziente, facendo così progredire la terapia personalizzata46,47. Mathur et al. hanno sviluppato questa tecnologia integrando un approccio combinatorio di codifica a barre del DNA per valutare i cambiamenti del trascrittoma nello screening dei farmaci ad alto rendimento48. Pertanto, lo screening combinatorio è una tecnologia potente ma nascente e vi è la necessità di sviluppare diverse tecnologie microfluidiche per eseguire e facilitare tali procedure di screening.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di presentare un set completo di protocolli per la fabbricazione di un dispositivo microfluidico a doppio strato in grado di generare una libreria combinatoria di tappi acqua-in-olio e descrivere l'hardware e il software necessari per il funzionamento di tale dispositivo. Il flusso del fluido è regolato tramite valvole pneumatiche basate su PDMS a pressione controllata, a loro volta controllate da un programma LabVIEW personalizzato. Il flusso di reagenti nel dispositivo si ottiene utilizzando pompe a pressione disponibili in commercio. Viene presentato un prototipo a otto ingressi in cui un tappo è formato dal contenuto di tre ingressi, ciascuno contenente un reagente acquoso. La fase acquosa incontra una fase oleosa continua e le spine sono prodotte a una giunzione a T con una frequenza di 0,33 Hz. Il funzionamento del sistema è dimostrato producendo una libreria quantitativa contenente tre distinte popolazioni di candele fluorescenti. Questa tecnologia e questo insieme di protocolli contribuiranno ad accelerare la produzione di librerie combinatorie per scopi di screening ad alto rendimento.
Protocol
1. Litografia morbida
NOTA: Il dispositivo microfluidico è composto da due strati, strato di flusso e strato di controllo (Figura 1A), e ogni strato è modellato da wafer modellati individualmente utilizzando rispettivamente un fotoresist positivo e negativo (fare riferimento alla tabella dei materiali per i dettagli sul fotoresist e sugli sviluppatori).
- Eseguire la fabbricazione di wafer per lo strato di flusso come descritto di seguito.
- Disidratare un wafer di silicio (diametro 100 mm, orientato <1-0-0>, 525) per una notte (12-16 h) a 250 °C.
- Lasciare raffreddare il wafer prima di procedere alla centrifuga. Applicare 3-4 mL di fotoresist positivo al centro del wafer.
- Centrifugare per 40 s a 1400 giri/min (344 giri/min) per ottenere un'altezza della caratteristica di 45 μm.
- Cuocere delicatamente su piastra utilizzando una rampa di temperatura, aumentando di 450 °C /h, da 35 °C a 105 °C. Questo passaggio può essere eseguito anche su tessuti in microfibra per evitare il contatto diretto e ridurre al minimo il gorgogliamento del fotoresist. Rimuovere il wafer dalla piastra e lasciarlo raffreddare su fazzoletti in microfibra.
- Posizionare la fotomaschera (prodotta commercialmente) corrispondente allo strato di flusso (lato dell'emulsione rivolto verso il basso) sul wafer di silicio rivestito di resist ed esporla sotto una lampada UV, a 10 mW/cm2, fino a raggiungere un'esposizione totale di 200 mJ/cm2 .
- Utilizzare due piastre riscaldanti - una a 65 °C e l'altra a 95 °C - per eseguire una cottura post-esposizione - rispettivamente per 1 min e 7 min - sulle lastre.
- Sviluppa il wafer trasferendolo in una piastra di Petri piena di sviluppatore per fotoresist positivo. Agitare la piastra di Petri agitandola su un agitatore da banco con il wafer completamente immerso e aggiornare periodicamente la soluzione di sviluppo fino a quando il wafer non è completamente sviluppato e le caratteristiche possono essere chiaramente viste.
- Utilizzare acqua demineralizzata per risciacquare i residui di resistenza dal wafer e controllare con uno stereomicroscopio eventuali residui all'interno dei canali. Rimuovere i residui riportando il wafer nella soluzione di sviluppo o aggiungendo con cura lo sviluppatore al wafer con una micropipetta. Una volta completato, asciugare il wafer utilizzando una pistola a spruzzo di azoto.
- Ridisporre il wafer posizionandolo su una piastra riscaldante impostata a 110 °C per 25 minuti. Questo processo produce feature arrotondate.
- Procedere alla silanizzazione del wafer come descritto al punto 1.3.
NOTA: La deposizione da vapore di esameldisilazano (HMDS) può essere eseguita anche sui wafer di silicio prima dell'applicazione del resist per migliorare l'adesione tra il resist e il wafer.
- Eseguire la fabbricazione di wafer per il livello di controllo come descritto di seguito.
- Prendere un altro wafer di silicio e disidratarlo posizionandolo su una piastra a 110 °C per 15 min.
- Rimuovere la cialda e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere con la centrifuga.
- Applicare 5 mL di fotoresist negativo al centro del wafer.
- Utilizzare il seguente protocollo di rotazione per ottenere un'altezza caratteristica di 40 μm: 5 s a 500 giri/min (accelerazione di 100 giri/min), 33 s a 1400 giri/min (300 giri/min) e infine decelentare a 0 giri/min per 5 s a 300 giri/min/s.
- Cuocere delicatamente con due piastre separate impostate a 65 °C e 95 °C rispettivamente per 1 min e 15 min. Rimuovere il wafer dalla piastra e lasciarlo raffreddare su fazzoletti in microfibra.
- Posizionare la fotomaschera (prodotta commercialmente) corrispondente allo strato di controllo (lato emulsione rivolto verso il basso) sul wafer rivestito di resistenza ed esporre il wafer sotto una lampada UV, impostata a 15 mW/cm2, fino a raggiungere un'esposizione totale di 250 mJ/cm2 .
- Utilizzare due piastre riscaldanti - una a 65 °C e l'altra a 95 °C - ed eseguire una cottura post-esposizione del wafer rispettivamente per 2 minuti e poi 5 minuti. Rimuovere il wafer dalla piastra e lasciarlo raffreddare su fazzoletti in microfibra.
- Sviluppare il wafer trasferendolo in una piastra di Petri riempita con lo sviluppatore per fotoresist negativo per 4 minuti. Aggiorna lo sviluppatore e continua il processo per altri 4 minuti.
- Sciacquare il wafer con isopropanolo per rimuovere i residui di fotoresist e utilizzare uno stereomicroscopio per controllare il wafer per eventuali residui all'interno dei canali.
- Rimuovere i residui riportando il wafer nella soluzione di sviluppo o aggiungendo con cura lo sviluppatore al wafer con una micropipetta. Una volta completato, asciugare il wafer utilizzando una pistola a spruzzo di azoto.
- Una volta completamente sviluppato, cuocere il fotoresist posizionando il wafer su una piastra riscaldante impostata a 95 °C per 10 minuti.
- Procedere alla silanizzazione come descritto al punto 1.3.
- Eseguire la silanizzazione come descritto di seguito.
- Metti il wafer in un essiccatore. Mettere una bottiglia di vetro nell'essiccatore e aggiungere 4-5 gocce di 1,1,3,3 tetrametildisilossano.
ATTENZIONE: L'1,1,3,3 tetrametildisilossano non è tossico ma è infiammabile. Possono essere utilizzati altri silani, ma potrebbero essere tossici. Si consiglia di eseguire la silanizzazione in una cappa aspirante indossando i dispositivi di protezione individuale (DPI) necessari come camice da laboratorio, occhiali e guanti in nitrile. - Tirare il vuoto per 15 min e sigillare l'essiccatore per 12-16 h per permettere al silano di depositarsi sulla cialda.
- Aprire l'essiccatore e smaltire la bottiglia di vetro. Metti il wafer in una capsula di Petri pulita.
- Metti il wafer in un essiccatore. Mettere una bottiglia di vetro nell'essiccatore e aggiungere 4-5 gocce di 1,1,3,3 tetrametildisilossano.
- Eseguire la fabbricazione di dispositivi microfluidici come descritto di seguito.
NOTA: Il seguente protocollo è stato adattato dai lavori precedenti23.- Preparare due soluzioni PDMS separate, una per il livello di flusso e una per il livello di controllo. Per ogni soluzione, mescolare l'agente di base e l'agente indurente del kit PDMS in un becher e mescolare con un'asta di miscelazione. Lo strato di controllo richiede 10 g di agente di base e 0,5 g di agente indurente (rapporto 20:1), mentre lo strato di flusso richiede 40 g di agente di base e 8 g di agente indurente (rapporto 5:1).
- Degasare le soluzioni PDMS in un essiccatore fino a quando le soluzioni non sono prive di gas.
- Posizionare il wafer dello strato di flusso silanizzato in una capsula di Petri coperta con un foglio e versare la soluzione PDMS corrispondente sul wafer. Rimettere la capsula di Petri nell'essiccatore e tirare il vuoto per degassare ulteriormente (per circa 20 minuti).
- Spin coat del wafer dello strato di controllo silanizzato con la soluzione PDMS corrispondente. Versare 3-4 ml di soluzione al centro del wafer e centrifugare per 20 s a 1500 giri/min a 408 giri/min/s. Posizionare il wafer su una superficie piana in una capsula di Petri chiusa per 20 minuti.
- Mettere sia lo strato di flusso che quello di controllo in forno a 80 °C per 18-20 minuti. Monitorare periodicamente i due strati per verificare se sono induriti. Gli strati sono pronti quando sono abbastanza duri da essere malleabili ma leggermente appiccicosi, in quanto ciò migliora il legame tra i due strati.
- Ritagliare il PDMS attorno a ciascuno dei dispositivi sul wafer dello strato di flusso con un bisturi. Assicurarsi di non tagliare troppo vicino alle caratteristiche e lasciare circa 2 cm di spazio tra la caratteristica e i bordi del PDMS. Una volta staccato dal wafer di silicio, coprire il blocco PDMS con del nastro adesivo sul lato della caratteristica per evitare qualsiasi contaminazione da polvere.
- Una volta ritagliati tutti i blocchi PDMS, posizionarli uno ad uno sul wafer dello strato di controllo corrispondente eseguendo un allineamento approssimativo a occhio.
- Dopo che tutti i blocchi sono stati posizionati sulle aree corrispondenti sullo strato di controllo, regolare la posizione di ciascuno dei blocchi in modo che le valvole di controllo si sovrappongano sui canali di flusso corrispondenti per completare l'allineamento. Questo può essere effettuato anche con l'aiuto di uno stereomicroscopio.
- Rimuovere le sacche d'aria tra i due strati applicando pressione. Se la sacca d'aria si trova sopra o vicino a una feature, fare attenzione a non comprimere i canali durante l'applicazione della pressione.
- Mettere i dispositivi nel forno a 80 °C e lasciarli incollare per 12-16 ore. Posizionare pesi da 100 g su ciascuno dei dispositivi per migliorare l'incollaggio tra i due strati.
- Estrarre il wafer e ritagliare ogni singolo dispositivo. Staccare i dispositivi dal wafer dello strato di controllo e coprire il lato della caratteristica con del nastro adesivo.
- Posizionare ogni singolo dispositivo su un tappetino da taglio con il lato della caratteristica rivolto verso l'alto e praticare un foro per ciascuno degli otto ingressi dello strato di flusso, gli otto ingressi del canale dello strato di controllo, gli ingressi dell'olio e l'uscita utilizzando un punzone per biopsia da 0,75 mm con il lato della caratteristica rivolto verso l'alto.
- Caricare l'asher al plasma con un vetrino da microscopio e un singolo dispositivo con il nastro rimosso e il lato della caratteristica rivolto verso l'alto. Eseguire l'incenerimento al plasma di ossigeno con una potenza di 30 W per una durata di 20 s.
- Estrarre il dispositivo e il vetrino non appena l'incenerimento è completo e posizionare il dispositivo con il lato della funzione rivolto verso il basso sul carrello. L'adesione tra PDMS e vetro dovrebbe essere immediatamente visibile ad occhio nudo. Applicare pressione su tutte le regioni con sacche d'aria per spremere l'aria.
- Posizionare i dispositivi su una piastra riscaldante impostata a 110 °C per 60 minuti con un peso sopra per migliorare l'incollaggio del PDMS al vetro.
2. Configurazione hardware
NOTA: Uno schema delle connessioni al dispositivo microfluidico è mostrato nella Figura 1B e la realizzazione di tale schema utilizzando l'hardware necessario è mostrata nella Figura 2.
- Impostare le valvole pneumatiche come descritto di seguito.
NOTA: Ogni canale di controllo, che regola una valvola PDMS sul chip, è a sua volta controllato da una singola elettrovalvola. Il prototipo qui presentato è costituito da otto canali di controllo (Figura 1A) e quindi sono necessarie otto elettrovalvole.- Le elettrovalvole sono controllate tramite un programma software LabVIEW personalizzato (Main Interface Program; Figura 3 e Fascicolo supplementare 1, Fascicolo supplementare 2, Fascicolo supplementare 3, Fascicolo supplementare 4). Questo programma invia comandi MODBUS tramite una connessione TCP (Supplementary File 5, Supplementary File 6), ad un controller WAGO. Collegare il dispositivo WAGO al computer con il programma LabVIEW utilizzando un cavo ethernet. Procedere al collegamento sequenziale delle elettrovalvole alle porte del controller WAGO. Per una descrizione più dettagliata, fare riferimento ai protocolli23 descritti in precedenza.
- Collegare l'array di elettrovalvole a una fonte di aria compressa utilizzando un tubo da 1/4 di pollice e impostare la pressione dell'array di valvole a 3,5 bar. In questo sistema sono state utilizzate le otto valvole contrassegnate 9-16.
- Impostare i regolatori di pressione come descritto di seguito.
NOTA: Per controllare il flusso del fluido viene utilizzata una pompa a pressione disponibile in commercio (Figura 2). Sono stati utilizzati un set di pompe a otto e quattro porte per ospitare otto ingressi acquosi e due ingressi olio nel dispositivo. La pressione di ciascuna porta è regolata tramite un software fornito dai produttori.- Collegare la pompa a pressione a una fonte di aria compressa assicurandosi che la pressione fornita non superi la pressione massima consentita dalla pompa (2,2 bar sia per i controller a otto porte che per quelli a quattro porte).
- Collegare le pompe a pressione a un computer utilizzando un connettore USB.
- Una volta accese, le pompe dovrebbero essere visibili nel software corrispondente. Impostare le pressioni a zero durante l'installazione delle pompe.
- Collegare un luer maschio a un connettore barb da 3/32 pollici a ciascuna delle 12 porte di uscita luer lock femmina sui controller.
- Collegare un pezzo di tubo morbido (OD: 3 mm, ID: 1 mm, L: 15 cm) all'ardiglione. Collegare un altro luer maschio al connettore a innesto da 3/32 pollici all'altra estremità del tubo morbido.
- Collegare un tronchetto luer (23 G, 0.5 pollici) al connettore a innesto. A questo punto, il regolatore di pressione è predisposto e pronto per essere utilizzato.
3. Configurazione del dispositivo microfluidico
- Collegare il tubo del canale di controllo come descritto di seguito (Figura 2).
- Per ciascun canale di controllo, tagliare una lunghezza di tubo in politetrafluoroetilene (PTFE) (OD: 0,042 pollici, ID: 0,022 pollici). Inserire il perno di un tronchetto luer da 23 G, 0,5 pollici a un'estremità.
- Collegare lo stub luer a un luer maschio a un connettore in nylon barbiglio da 3/32 pollici. Inserire l'aletta del connettore in un tratto di tubo in poliuretano (OD: 4 mm, ID: 2.5 mm). Collegare l'altra estremità del tubo in poliuretano direttamente a un'elettrovalvola.
- Riempi una siringa con acqua e collega un mozzo luer da 23 G, 0,5 pollici all'estremità.
- Collegare l'estremità libera del tubo in PTFE a questa siringa e iniettare acqua fino a circa metà del tubo.
- Scollegare il tubo dalla siringa e inserire l'estremità libera del tubo in un foro praticato del canale di controllo corrispondente (Figura 1A-C 1-8). Ripetere fino a quando ciascun canale di controllo non è stato collegato all'elettrovalvola corrispondente.
NOTA: In questo documento, le elettrovalvole 9-16 sono state collegate ai canali di controllo corrispondenti rispettivamente a C1 a C8 . Sebbene questi possano essere collegati in qualsiasi modo, è importante ricordare l'ordine e la sequenza delle connessioni, specialmente durante l'utilizzo del programma Main Interface. - Utilizzare il programma Interfaccia principale (Figura 3) per aprire tutte le elettrovalvole (pressurizzare tutti i canali di controllo). Questo spingerà il fluido dal tubo nei canali di controllo del dispositivo microfluidico e quindi lo riempirà. Un esempio di valvole pressurizzate e depressurizzate è mostrato nella Figura 4.
- Collegare i reagenti e adescare il dispositivo come descritto di seguito.
- Assicurarsi che tutti i canali di controllo siano pressurizzati premendo il pulsante Pressurizza tutti i canali di controllo nel programma Interfaccia principale (Figura 3).
- Per ciascuno dei reagenti acquosi, tagliare un segmento di tubo in PTFE (OD: 0.042 in, ID: 0.022 in) abbastanza lungo da collegare le pompe agli ingressi degli ingressi del dispositivo microfluidico. Collegare uno dei tubi allo stub luer dal passaggio 2.2.6.
- Riempire una siringa con il reagente richiesto e collegare un tronchetto luer da 23 G, 0,5 pollici all'estremità.
- Iniettare il reagente nel tubo in PTFE corrispondente fino a quando il tubo non è pieno. Fare attenzione che il reagente non entri nella porta di uscita del set di pompaggio.
- Inserire l'estremità libera del tubo in un ingresso corrispondente nel chip microfluidico.
- Applicare una pressione di 400 mbar a ciascuno dei reagenti acquosi in ingresso utilizzando il software in dotazione.
- Depressurizzare in sequenza i canali di controllo singolarmente utilizzando il programma Main Interface (Figura 3) per assicurarsi che tutti i reagenti abbiano raggiunto il giunto a T del dispositivo. Azionare le singole valvole, se necessario, premendo i pulsanti corrispondenti sul programma nella casella Pressurizzazione manuale dei canali di controllo.
- Ripetere i passaggi da 3.2.3 a 3.2.5 per i reagenti dell'olio. Applicare una pressione di 400 mbar a ciascuno dei reagenti dell'olio in ingresso.
- Depressurizzare contemporaneamente tutti i canali di controllo premendo Depressurizza tutti i canali di controllo (Figura 3) fino a rimuovere tutta l'aria dal dispositivo. Questo è osservabile ad occhio nudo o al microscopio.
- Pressurizzare tutti i canali di controllo premendo il pulsante Pressurizza tutti i canali di controllo (Figura 3). A questo punto, tutti i reagenti sono stati collegati e il dispositivo è innescato e pronto per l'uso.
- Programmare ed eseguire l'esperimento come descritto di seguito.
- Codificare la composizione, la sequenza e le repliche di ciascuna popolazione di spine da produrre in un file .csv come mostrato nel file supplementare 7 che funge da input per l'esperimento automatico nel programma di interfaccia principale (Figura 3). Contrassegnare i canali di controllo necessari con uno 0 se corrisponde a un ingresso che deve essere aperto e un 1 se deve essere chiuso. Ogni riga nel file .csv corrisponde a una popolazione di tappi distinta.
- Caricare il .csv sul programma Main Interface facendo clic sul pulsante Cartella nella scheda File dell'esperimento .
- Immettere i campi pertinenti nel programma come Iterazioni dell'esperimento (per determinare quante volte viene prodotta la sequenza di tappi data), Tempo di depressurizzazione (per determinare per quanto tempo i canali di ingresso devono essere aperti e il canale di controllo corrispondente deve essere depressurizzato in millisecondi), Tempo di pressurizzazione (per determinare per quanto tempo gli ingressi devono essere chiusi tra le sequenze di popolazione di tappi in millisecondi).
- Selezionare i canali di ingresso corrispondenti alla produzione di codici a barre nella sezione Ingressi codici a barre (fino a 3 canali) insieme alla durata per la quale devono essere aperti (Tempo per la codifica a barre (ms)). In alternativa, questi codici a barre possono anche essere codificati nel file .csv di input, come mostrato nel file supplementare 7.
- Ridurre la pressione dei reagenti dell'olio in ingresso a 200 mbar.
- Collegare un tubo in PTFE (OD: 0.042 pollici, ID: 0.022 pollici) della lunghezza desiderata all'uscita per raccogliere le spine. Al fine di garantire una produzione uniforme dei tappi, utilizzare tubi di circa 100 cm preriempiti con tappi per la raccolta. Questo per neutralizzare la differenza di pressione all'uscita che viene esercitata dalla raccolta dei tappi nel tubo.
- Premere Esegui esperimento per avviare il programma e collegare la produzione.
- Eseguire la registrazione e l'analisi dei dati come descritto di seguito (vedere la Figura 5).
NOTA: Questa sezione descrive specificamente un metodo per analizzare le spine fluorescenti. A seconda della natura dei tappi generati, questa sezione può essere modificata secondo necessità.- Riempi una siringa con olio (olio minerale o olio fluorurato) e collega un mozzo luer da 23 G 0,5 pollici all'estremità. Fissare la siringa a una pompa.
- Collegare una delle estremità del tubo di raccolta riempito al tronchetto luer sulla siringa. Fissare l'altra estremità del tubo di raccolta riempito sopra la lente dell'obiettivo di un microscopio.
- Posizionare un serbatoio di scarico sotto l'estremità del tubo vicino all'obiettivo.
- Focalizzare il microscopio su una determinata regione del tubo e impostarlo per registrare la fluorescenza nei canali desiderati.
- Impostare la pompa su una portata di 50 μL/min.
- Registra il video del canale fluorescente come file .avi.
- Analizza il file .avi utilizzando lo script python fornito (File supplementare 8) per estrarre la fluorescenza media in una regione di interesse (ROI) predefinita per fotogramma del file .avi (un esempio del quale è fornito nel File supplementare 9).
- Usare lo script R personalizzato fornito (file supplementare 10) per estrarre le condizioni e tracciare i dati non elaborati e le altezze dei picchi.
NOTA: lo script R nel file supplementare 10 è stato utilizzato per l'analisi in questo documento. Le funzioni R personalizzate utilizzate in questo script per tagliare i dati, rilevare le condizioni utilizzando i codici a barre e analizzare le altezze dei picchi per i singoli tappi e la stampa sono fornite nel file supplementare 11.
Representative Results
Una delle caratteristiche cruciali del chip microfluidico sono le valvole PDMS e la loro capacità di regolare il flusso del fluido è stata caratterizzata in quanto influenza il paradigma operativo del dispositivo. A tal fine, la portata di acqua distillata (misurata utilizzando un sensore di portata commerciale) attraverso i canali di ingresso è stata registrata in funzione delle diverse pressioni di ingresso durante la pressurizzazione periodica (3,5 bar per 2000 ms) e la depressurizzazione (1000 ms) delle valvole PDMS (Figura 6A). È stato osservato che le valvole erano in grado di regolare il flusso del fluido fino a circa 800 mbar di pressione in ingresso, come indicato dalla caduta della portata a zero quando le valvole vengono azionate (Figura 6 B-D). Ciò convalida l'uso di tali valvole basate su PDMS per regolare il flusso di reagenti all'interno dei canali. Inoltre, a 1200 mbar, la pressione di ingresso è troppo alta perché le valvole possano regolare il flusso, come dimostra la portata che non si riduce a zero (Figura 6E). Mentre la durata della pressurizzazione e della depressurizzazione delle valvole PDMS può essere modificata, è stata calcolata la velocità di variazione del flusso del fluido in base alle attuali condizioni di pressurizzazione (2000 ms) e depressurizzazione (1000 ms). Per una pressione di ingresso di 400 mbar, il flusso può essere attivato e disattivato rispettivamente a una velocità di 1,26 Hz e 1,44 Hz (Figura 6C).
Le precedenti iterazioni di un dispositivo microfluidico combinatorio ad alto rendimento simile incorporavano anche un canale di scarico accoppiato a ciascun canale di flusso46,47. Questi dispositivi sono stati utilizzati in un regime di portata costante (in cui i reagenti sono stati iniettati nel dispositivo a portate costanti anziché a pressione costante) e i canali di scarico sono stati programmati per aprirsi quando i canali di ingresso corrispondenti sono stati chiusi per alleviare qualsiasi accumulo di pressione. Tali canali, sebbene utili, provocano una perdita di reagenti poiché il contenuto del canale di scarto non contribuisce alla formazione di tappi. Inoltre, sono necessari canali di controllo aggiuntivi - e quindi pompe aggiuntive - per regolare l'apertura e la chiusura dei canali di scarico. Nel prototipo qui presentato, i canali di scarto sono stati rimossi ed è stato stabilito un paradigma operativo che consente di ridurre lo spreco di reagenti e di ridurre la complessità progettuale e operativa. Ciò comporta l'iniezione dei reagenti acquosi in modalità a pressione costante anziché in modalità a portata costante. Per comprendere meglio i due regimi, è stata valutata in ciascun caso la relazione tra pressione e portata nei canali durante l'azionamento della valvola (utilizzando la stessa configurazione mostrata nella Figura 6A), i cui risultati sono mostrati nella Figura 7. Nella Figura 7A, la portata dell'acqua distillata è stata misurata durante l'iniezione a pressione costante (300 mbar) ed è stato osservato che durante l'azionamento della valvola, la portata scende a zero e dopo la depressurizzazione della valvola la portata torna ai livelli di pre-attuazione. Tuttavia, in un regime di portata costante, in cui la pressione nei canali è stata registrata durante l'iniezione dell'acqua distillata a una portata costante (2,5 μL/min; Figura 7B), l'azionamento della valvola non ha comportato la completa chiusura dell'ingresso - evidenziato dalla portata che non scende a zero - ed è stato osservato un accumulo di pressione nel canale. Questa è la pressione che viene alleviata dall'apertura dei canali di scarico. Poiché un regime di pressione di ingresso costante consente il funzionamento del dispositivo senza contropressione all'azionamento della valvola, annullando così la necessità di canali di scarico, questo regime è stato adottato per il funzionamento del chip microfluidico.
Per dimostrare la funzionalità del dispositivo microfluidico, è stata generata una libreria combinatoria quantitativa di tappi fluorescenti. Agli otto ingressi del dispositivo, tre reagenti acquosi - fluoresceina (50 μM) in quattro ingressi (I1Io3, Io5, Io7), acqua distillata in tre ingressi (I4Io6, Io8), un ingresso con un colorante di colore blu (I2; per fungere da codice a barre) - e due reagenti oleosi - olio fluorurato (FC-40) e olio minerale (MO) negli ingressi O1 e O2, rispettivamente - sono stati collegati (Figura 1A, Figura 8A). L'olio fluorurato funge da fase di trasporto in cui i tappi acquosi vengono dispersi, mentre l'olio minerale favorisce la stabilità del tappo e riduce al minimo l'adesione del contenuto del tappo alle pareti, riducendo così al minimo la contaminazione incrociata tra i tappi46. Con tre ingressi che contribuiscono alla composizione di una singola popolazione di spine, questa configurazione può generare tre distinte popolazioni fluorescenti: FFF - composto da fluoresceina da tre canali, FFW - composto da fluoresceina da due canali e acqua da un canale e FWW - composto da fluoresceina da un canale e acqua da due canali. Con questa configurazione, ci sono 12 condizioni distinte (popolazioni di tappi prodotte con una combinazione distinta di tre ingressi) che possono produrre tappi FWW, 18 condizioni distinte che possono produrre tappi FFW e quattro condizioni distinte che possono produrre tappi FFF. Pertanto, il chip è stato programmato per produrre queste 34 diverse condizioni con cinque diverse repliche di spine ciascuna, insieme a cinque repliche di spine di codici a barre che le separano. Si consiglia di intervallare le popolazioni di tappi fluorescenti con una popolazione di codici a barre, ovvero un insieme di tappi colorati (idealmente non fluorescenti) (in questo caso formati aprendo i canali di ingresso corrispondenti al colorante blu e due canali di acqua distillata) visibili ad occhio nudo. Consente all'utente di monitorare la produzione di tappi per problemi come la rottura o la fusione dei tappi e aiuta nell'analisi a valle dei tappi. Pertanto, un totale di 340 tappi - 170 tappi sperimentali e 170 tappi per codici a barre che separano le diverse condizioni - sono stati generati e raccolti in tubi di PTFE, un campione dei quali è mostrato in Figura 8B. Il tempo di depressurizzazione e il tempo di pressurizzazione sono stati fissati rispettivamente a 1000 ms e 2000 ms. Sono stati analizzati la fluorescenza dei tappi e la loro variabilità all'interno e tra le diverse condizioni sperimentali, i cui risultati sono mostrati in Figura 8C,D. Figura 8C mostra la fluorescenza per fotogramma del file .avi generato nel passaggio 3.4.6, che evidenzia le 34 condizioni sperimentali in considerazione (delimitate da una linea blu). Il valore medio di fluorescenza dei picchi all'interno di una condizione è mostrato in rosso e le linee tratteggiate indicano l'errore standard all'interno di tale condizione. Le altezze dei picchi di tutti i tappi in ciascuna popolazione, ottenute sottraendo la fluorescenza basale dalla fluorescenza massima rilevata in ciascun picco, sono state tracciate in Figura 8D. L'ultimo picco in ciascuna condizione è stato trascurato per i calcoli in quanto si trattava di un tappo contaminato a causa della miscelazione di reagenti alla giunzione a T (poiché la fluorescenza dei tappi è stata registrata in ordine inverso rispetto alla produzione del tappo, il primo tappo in una popolazione durante la produzione è l'ultimo tappo in una popolazione durante l'analisi). Era evidente che l'altezza dei tappi FWW è circa un terzo (media = 40,9, deviazione standard = 3,1) e quella dei tappi FFW è circa due terzi (media = 78,4, deviazione standard = 5) dell'altezza dei tappi FFF (media = 117, deviazione standard = 10). Questi risultati corrispondono alle proporzioni attese di fluorescenza in diverse popolazioni di spine FFF/FFW/FWW, il che evidenzia la robustezza del dispositivo e il suo funzionamento.
Figura 1: Schema del design del dispositivo e configurazione microfluidica. (A) Lo strato di flusso del chip è mostrato in blu e lo strato di controllo è mostrato in rosso. Un totale di otto reagenti acquosi unici possono fluire attraverso gli ingressi (I1-8) verso il diaframma a T, dove incontrano le fasi oleose dagli ingressi dell'olio (O1-2) per formare tappi che vengono raccolti all'uscita. Ogni canale di flusso in ingresso è sotto il controllo di un canale di controllo univoco (C1-8). (B) Lo schema del chip microfluidico insieme ai collegamenti dei tubi agli ingressi, ai canali di controllo e ai reagenti dell'olio è mostrato insieme al tubo di uscita. Le frecce indicano la direzione del flusso del fluido nel tubo. Il riquadro mostra il principio di funzionamento delle valvole PDMS. Le linee tratteggiate indicano che il livello di controllo si trova sotto il livello di flusso. Questa cifra è stata modificata da Dubuc et al49. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema della configurazione hardware per la produzione di spine. Le pompe a pressione controllano il flusso dei reagenti (sia acquosi che oleosi) nei canali di ingresso e le elettrovalvole controllano l'azionamento delle valvole PDMS. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il programma di interfaccia principale per controllare il dispositivo microfluidico. Questo programma su misura consente la pressurizzazione manuale delle singole valvole pneumatiche (pannello bianco). Consente inoltre l'esecuzione di un esperimento completo (pannello blu) in cui accetta un file .csv con le popolazioni di tappi desiderate e i parametri necessari come i tempi di pressurizzazione e depressurizzazione della valvola e visualizza lo stato di esecuzione dell'esperimento, inclusi quali canali di controllo sono pressurizzati e non, in tempo reale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Azionamento della valvola azionata dalla pressione. Immagini al microscopio a campo chiaro di (A) valvola PDMS (orizzontale) in fase di depressurizzazione e del canale di ingresso (verticale) aperto e (B) valvola PDMS in fase di pressurizzazione e chiusura del canale di ingresso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Schema della configurazione della registrazione dei dati. Il tubo di raccolta è collegato a una siringa con olio, che è fissata a una pompa. I tappi vengono fatti volare attraverso il tubo di raccolta e le immagini/video vengono acquisiti utilizzando un microscopio a fluorescenza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Effetto dell'azionamento della valvola sulla portata a una data pressione di ingresso. (A) Schema della configurazione hardware utilizzata per monitorare la portata nei canali microfluidici. La risposta della portata nei canali quando vengono azionati a diverse pressioni di ingresso di (B) 200 mbar, (C) 400 mbar, (D) 800 mbar e (E) 1200 mbar. La durata dell'azionamento della valvola è mostrata nella regione ombreggiata in rosso. Per tutti gli esperimenti è stata utilizzata acqua distillata. La deviazione standard di tre misurazioni indipendenti è mostrata dalla regione ombreggiata in verde. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Relazione tra pressione e portata dei reagenti nei canali di ingresso all'azionamento della valvola. (A) In un regime di pressione di ingresso costante (300 mbar) la portata si riduce a zero all'azionamento della valvola. (B) In un regime di portata costante (2,5 μL/min) l'azionamento della valvola provoca un rapido accumulo di pressione nel canale fino a quando la valvola non viene depressurizzata. La durata dell'azionamento della valvola è mostrata nella regione ombreggiata in rosso. Per tutti gli esperimenti è stata utilizzata acqua distillata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Produzione di popolazioni di tappi fluorescenti. (A) Schema della configurazione sperimentale che descrive la connessione dei diversi reagenti al dispositivo. Abbreviazioni: F = fluoresceina, W = acqua distillata, B = colorante alimentare blu, FC-40 = olio fluorurato e MO = olio minerale. (B) Immagine di esempio del tubo di raccolta contenente tappi. (C) I dati grezzi ottenuti dall'analisi mostrano l'intensità media di fluorescenza misurata in una specifica regione di interesse (ROI) rispetto al numero di fotogramma del file video. Le linee rosse mostrano la media della fluorescenza di picco per ciascuna condizione (popolazione di spine prodotte con una specifica combinazione di tre ingressi) e le linee tratteggiate mostrano l'errore standard corrispondente. (D) Boxplot dell'altezza dei picchi nelle diverse condizioni. I punti corrispondono ai singoli picchi, le caselle per ogni condizione vanno dal primo al terzo quartile della distribuzione dei picchi corrispondenti e la linea spessa viene utilizzata per il valore mediano. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1: Il programma di interfaccia principale per il funzionamento del dispositivo. L'interfaccia di controllo per la pressurizzazione manuale dei canali di controllo e l'esecuzione di un esperimento automatico nel dispositivo a otto ingressi. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 2: programma di interfaccia principale alternativo per il funzionamento del dispositivo. L'interfaccia di controllo per il funzionamento di un dispositivo a otto ingressi senza funzione di codifica a barre. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 3: Sottoprogramma LabVIEW con variabili globali. SubVI del programma di interfaccia principale che elenca e visualizza lo stato delle variabili globali nel programma di interfaccia principale, vale a dire i canali di controllo. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 4: Programma LabVIEW per salvare i valori delle variabili globali. SubVI del programma di interfaccia principale che salva lo stato corrente delle valvole come array, che verrà utilizzato per mantenere lo stesso stato delle valvole nel caso in cui l'utente rimanga inattivo per più di 30 secondi. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 5: Programma LabVIEW Transmission Control Protocol (TCP). SubVI per mantenere la connessione TCP tra il programma di interfaccia principale e il controller WAGO. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 6: Variabile globale TCP sottoprogramma LabVIEW. Programma per memorizzare la variabile di output TCP. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 7: Input per l'esecuzione di esperimenti automatici. Il file .csv che codifica la composizione, la sequenza e le repliche delle popolazioni di tappi per l'esecuzione di esperimenti per produrre tappi fluorescenti quantitativi, come dettagliato in questo articolo. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 8: Script Python per l'analisi della popolazione di tappi fluorescenti. Script python personalizzato per leggere i valori di fluorescenza dalla registrazione dei plug-in (file .avi). Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 9: Output dell'analisi della fluorescenza dei plug. Output dallo script Python contenente valori di fluorescenza per un ROI 5x5 dalla registrazione dei plug. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 10: programma R per leggere il file di output. Programma personalizzato utilizzato in questo lavoro per leggere i valori fluorescenti in uscita e tracciare i dati grezzi, le altezze dei picchi e le deviazioni standard. Fare clic qui per scaricare questo file.
File supplementare 11: funzioni R per l'analisi e la rappresentazione grafica di dati fluorescenti. Funzioni R personalizzate utilizzate per 1. tagliare i dati grezzi dei valori fluorescenti, 2. definire diverse condizioni sperimentali, 3. identificare i picchi dalle condizioni date, 4.tracciare i dati grezzi e le condizioni rilevate sovrapposte e 5. Traccia i picchi identificati e i dati grezzi sovrapposti. Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
In questo articolo è stata presentata una serie di protocolli per la fabbricazione e il funzionamento di un dispositivo microfluidico basato su PDMS per la generazione automatizzata di librerie combinatorie in compartimenti acqua-in-olio chiamati plug. La combinazione di microfluidica con tecnologia a goccioline fornisce una potente tecnica per incapsulare piccole quantità di reagenti in un gran numero di compartimenti, aprendo così strade per lo screening combinatorio su larga scala.
In precedenza, sono state descritte diverse tecnologie per generare compartimenti chimicamente distinti utilizzando la microfluidica, ognuna con i suoi vantaggi e limiti. Kulesa et al.50, hanno descritto una strategia per incapsulare le cellule con codici a barre in goccioline utilizzando piastre di microtitolazione e fondendo queste goccioline utilizzando un campo elettrico per creare una libreria combinatoria. Sebbene un tale approccio possa generare molte combinazioni di goccioline, è limitato dalla necessità di passaggi di gestione manuale nel flusso di lavoro. Tomasi et al.51 hanno sviluppato una piattaforma microfluidica per fondere una gocciolina contenente sferoidi (aggregati cellulari fluttuanti) con una gocciolina di stimolo, consentendo così la manipolazione del microambiente sferoide. Questo metodo consente lo studio di fenomeni importanti come le interazioni cellula-cellula e l'effetto dei farmaci, ma è relativamente basso. Eduati et al.46 e Utharala et al.47 hanno sviluppato una piattaforma basata su valvole microfluidiche in grado di generare librerie combinatorie ad alto rendimento in modo automatizzato. Tuttavia, in questi studi, le valvole vengono azionate utilizzando un dispositivo Braille, che richiede ingombranti passaggi di allineamento tra la microvalvola e il chip microfluidico. Una caratteristica chiave del sistema descritto in questo documento è l'implementazione di valvole pneumatiche PDMS per regolare il flusso del fluido nei canali di ingresso. Poiché queste valvole sono basate su PDMS, possono essere incorporate piuttosto agevolmente nelle fasi di fabbricazione del chip microfluidico. Inoltre, sono un'opzione relativamente semplice per controllare il flusso di liquidi nei canali di ingresso, in quanto possono essere azionati applicando pressione attraverso una fonte di gas esterna. Infine, è possibile programmare la durata e la sequenza di pressurizzazione e depressurizzazione di queste valvole, automatizzando così la produzione di popolazioni distinte di tappi in modo ad alta produttività. Un'altra caratteristica importante è l'uso di regimi di pressione costante per l'iniezione di reagenti attraverso l'ingresso, che consente di rinunciare all'incorporazione di canali di scarico per alleviare qualsiasi accumulo di pressione che si verifica in un regime di portata costante. Ciò semplifica la progettazione del dispositivo, riduce la necessità di valvole e hardware aggiuntivi per controllare le valvole del canale di scarico e riduce al minimo lo spreco di reagenti.
Mentre la fabbricazione di dispositivi con PDMS è relativamente semplice, l'implementazione di tali dispositivi richiede l'uso di un ampio armamentario hardware come le elettrovalvole pneumatiche (per controllare l'azionamento delle valvole PDMS), le pompe a pressione (per controllare il flusso di reagenti in ingresso e olio) e i programmi software (per regolare le elettrovalvole). Sebbene rappresentino un investimento significativo, tale configurazione fornisce coerenza e affidabilità per il corretto funzionamento del dispositivo. Inoltre, i componenti hardware e l'architettura delineati in questo protocollo sono configurati in modo modulare. Pertanto, è possibile utilizzare alternative per alcuni moduli per ridurre i costi o per adattarli a un'esigenza specifica. Ad esempio, esiste una varietà di pompe che possono essere utilizzate in base all'utilità, al budget, alla disponibilità e alla convenienza 52,53,54. È possibile incorporare componenti aggiuntivi come serbatoi di fluido e regolatori di temperatura per i reagenti di ingresso sensibili23. Inoltre, questo design può essere ingrandito o ridotto per soddisfare esigenze scientifiche specifiche. Ad esempio, in questo documento, viene descritto un prototipo a otto ingressi che consente di combinare otto reagenti unici per produrre tappi. Questo può essere scalato a un dispositivo a 16 ingressi che consente un numero maggiore di ingressi e combinazioni più ampie di essi. Di conseguenza, avrà bisogno di canali di controllo ed elettrovalvole aggiuntivi per indirizzare gli ingressi, ma un tale prototipo consente di generare librerie combinatorie più grandi e diversificate. Infine, in questo articolo, ogni popolazione di tappi è prodotta dall'apertura di tre degli otto ingressi acquosi del dispositivo microfluidico. È stato osservato che per tale configurazione, una pressione di circa 200 mbar per i reagenti oleosi e di 400 mbar per i reagenti acquosi corrispondeva a un regime di produzione di tappi, che è guidato esclusivamente dall'azionamento della valvola. Quando sono state applicate pressioni più elevate all'olio, è stata osservata una rottura dei tappi e l'applicazione di pressioni più basse ha portato a una fusione dei tappi. Il regime di pressione ottimale per la produzione di tappi dipende da un'ampia gamma di fattori, come il numero di ingressi che contribuiscono alla formazione di un tappo, la natura e la viscosità dei fluidi e le dimensioni dei canali, e deve essere ottimizzato come e quando necessario.
Uno degli svantaggi del funzionamento in regime di pressione costante è che fluidi con viscosità diverse hanno portate diverse a pressione costante. Pertanto, è necessario assicurarsi che i reagenti acquosi che fluiscono attraverso gli ingressi siano di viscosità comparabili. L'uso di fluidi di diversa viscosità influenzerà non solo il flusso del fluido nei canali di ingresso, ma anche la formazione di tappi alla giunzione a T, compromettendo così la composizione delle popolazioni di tappi. Un altro inconveniente è la contaminazione di una popolazione di tappi da reagenti residui alla giunzione T. Quando il dispositivo passa dalla produzione di diverse popolazioni di spine, la prima/ultima spina nella sequenza di ciascuna popolazione tende ad essere contaminata dalla popolazione precedente o successiva. Questo può essere superato producendo repliche extra di ciascuna popolazione e scontando il tappo contaminato durante l'analisi. Infine, esiste anche la possibilità di variazioni tra i singoli dispositivi derivanti da incongruenze nella fabbricazione e/o fonti esterne (fluttuazioni di pressione). Questo problema può essere mitigato riutilizzando più volte un singolo chip microfluidico e assicurandosi che venga eseguita un'esecuzione completa di una libreria combinatoria su un singolo chip per ridurre al minimo l'effetto di queste incoerenze.
Il dispositivo microfluidico e il relativo set di protocolli operativi presentati in questo documento sono stati utilizzati per dimostrare la produzione di una libreria combinatoria quantitativa di spine. Questa piattaforma può, quindi, generare rapidamente librerie combinatorie di popolazioni di plug distinte in modo ad alto rendimento. Di conseguenza, tali tecnologie possono essere utilizzate per una varietà di scopi di screening, tra cui, ma non solo, lo screening combinatorio dei farmaci su campioni bioptici dei pazienti - per cui un piccolo numero di cellule recuperate da una biopsia può essere distribuito in un gran numero di goccioline e trattato con un'ampia combinazione del farmaco antitumorale per ottimizzare la terapia individuale per un determinato campione di paziente - e quindi accelerare la terapia oncologica personalizzata46, 48,55.
Disclosures
F. E. è un freelance per TheraMe! ARGENTUM. Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Stacey Martina del NanoLab TuE per l'aiuto con la deposizione da vapore HMDS. Questa ricerca è stata finanziata dall'Institute for Complex Molecular Systems (ICMS) presso la TU/e e dal programma di gravitazione IMAGINE! (numero di progetto 24.005.009).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,1,3,3 tetramethyldisiloxane | Merck Life Science NV | MFCD00008256 | |
| 4 channel digital input/output module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-504 | |
| Acetone | Boom Labs | BOOMSKEUZW3 | |
| Analysis Software | Eindhoven University of Technology | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE | |
| AZ 40XT 11D | Merck Life Science NV | 212299 | Positive photoresist |
| AZ 726 MIF developer | Merck Life Science NV | 10055824960 | Developer for positive photoresist |
| Biopsy Punch, Rapid Core | World Precision Instruments Germany, GMBH | 504529 | 0.75 mm ID, W/Plunge |
| Blue food dye | PME | FC1036 | |
| Controller end module | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-600 | |
| Ethernet Controller | WAGO Kontakttechnik GmbH | 750-881 | |
| FC-40 | Merck Millipore | F9755-100ML | |
| Fluigent flow unit | Fluigent | FLU-S-D | |
| Fluigent pressure system | Fluigent | MFCS-EZ | 0 - 2 bar |
| Fluorescein | Merck Life Science NV | MFCD00005050 | |
| Hot plate | Torrey Pines Scientific | HP61 | |
| Inverted microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-E | |
| Isopropanol | Boom Labs | BOOMSKEUZE3 | |
| LabVIEW (Software Version 20) | Eindhoven University of Technology | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/tree/main/LabVIEW_8_inlet_device_ VERSION_1 |
All files have been saved for LabVIEW version 20. It is advised to use this version or higher to open the files. |
| Luer stubs | Instech Laboratories, Inc. | LS23 | 23 ga, 0.5" |
| Male Luer to barb connectors | Cole Parmer | 45505-32 | 3/32" ID |
| MasterFlex PTFE tubing | Avator/VWR | 48634 | |
| Microscope Slides | VWR | 470150-480 | |
| Microscope slides, Plain | Corning | 2947-75X50 | |
| Mineral Oil | Merck Millipore | 330760-1L | |
| mr DEV 600 | Micro resist Technology | R815100 | Developer for negative photoresist |
| Oven | Thermo Scientific | Heraeus T6P 50045757 | |
| Oxygen plasma asher | Quorum Technologies | K1050X | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | ||
| Photomask Design | Eindhoven University of Technology (Adapted from Merten Lab, EPFL) | https://github.com/SysBioOncology/BilayerMicrofluidicsAnalysis_JoVE/blob/main/8_inlet_JoVE_device_design.dwg | |
| Pneumatic valve array | FESTO | 1x 8 valve array, Normally closed valves | |
| Silicon Wafers | Silicon Materials | <1-0-0>, 100 mm diameter, 525 μm thickness | |
| Single edge blades | GEM Scientific | ||
| Soft tubing | Fluigent | 1 mm ID, 3 mm OD | |
| Spin coater | Laurell Technologies Corporation | WS-650MZ-23NPPB | |
| Stereo microscope | Olympus Corporation | SZ61 | |
| SU-8 3050 | Kayakli Advanced Materials | Y311075 1000L1GL | Negative photoresist |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 1317318 | |
| Syringe | B Braun Injekt - F Fine Dosage Syringe | 10303002 | |
| UV-LED exposure system | Idonus | UV-EXP150S-SYS | |
| Vacuum pump | Vacuumbrand GmbH | MD1C | |
| Weighing scales | Sartorius | M-prove |
References
- Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442 (7101), 368-373 (2006).
- Terry, S. C., Herman, J. H., Angell, J. B. A gas chromatographic air analyzer fabricated on a Silicon wafer. IEEE Transactions on Electron Devices. 26 (12), 1880-1886 (1979).
- Mellors, J. S., Gorbounov, V., Ramsey, R. S., Ramsey, J. M. Fully integrated glass microfluidic device for performing high-efficiency capillary electrophoresis and electrospray ionization mass spectrometry. Anal Chem. 80 (18), 6881-6887 (2008).
- Wlodarczyk, K. L., Hand, D. P., Maroto-Valer, M. M. Maskless, rapid manufacturing of glass microfluidic devices using a picosecond pulsed laser. Sci Rep. 9 (1), 20215 (2019).
- Nielsen, J. B., et al. Microfluidics: innovations in materials and their fabrication and functionalization. Anal Chem. 92 (1), 150-168 (2020).
- Nge, P. N., Rogers, C. I., Woolley, A. T. Advances in microfluidic materials, functions, integration, and applications. Chem Rev. 113 (4), 2550-2583 (2013).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane). Anal Chem. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288 (5463), 113-116 (2000).
- Oh, K. W., Ahn, C. H.
- Au, A. K., Lai, H., Utela, B. R., Folch, A. Microvalves and micropumps for BioMEMS. Micromachines. 2 (2), 179-220 (2011).
- Jerman, H.
- Neagu, C. R., Gardeniers, J. G. E., Elwenspoek, M., Kelly, J. J. An electrochemical microactuator: principle and first results. J microelectromechanical sys. 5 (1), 2-9 (1996).
- Gu, W., Zhu, X., Futai, N., Cho, B. S., Takayama, S. Computerized microfluidic cell culture using elastomeric channels and Braille displays. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15861-15866 (2004).
- Studer, V., et al. Scaling properties of a low-actuation pressure microfluidic valve. J Appl Phys. 95 (1), 393-398 (2004).
- Hansen, C. L., Sommer, M. O. A., Quake, S. R. Systematic investigation of protein phase behavior with a microfluidic formulator. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (40), 14431-14436 (2004).
- Ridgeway, W. K., Seitaridou, E., Phillips, R., Williamson, J. R. RNA-protein binding kinetics in an automated microfluidic reactor. Nucleic Acids Res. 37 (21), e142 (2009).
- Fu, A. Y., Chou, H. P., Spence, C., Arnold, F. H., Quake, S. R. An integrated microfabricated cell sorter. Anal Chem. 74 (11), 2451-2457 (2002).
- Liu, J., Enzelberger, M., Quake, S. A nanoliter rotary device for polymerase chain reaction. Electrophoresis. 23 (10), 1531-1536 (2002).
- Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R.
- Galas, J. C., Haghiri-Gosnet, A. M., Estévez-Torres, A. A nanoliter-scale open chemical reactor. Lab Chip. 13 (3), 415-423 (2013).
- Niederholtmeyer, H., Stepanova, V., Maerkl, S. J. Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (40), 15985-15990 (2013).
- Yelleswarapu, M., et al. Sigma factor-mediated tuning of bacterial cell-free synthetic genetic oscillators. ACS Synth Biol. 7 (12), 2879-2887 (2018).
- van der Linden, A. J., et al. A multilayer microfluidic platform for the conduction of prolonged cell-free gene expression. J Vis Exp. (152), 59655 (2019).
- Shang, L., Cheng, Y., Zhao, Y.
- Seemann, R., Brinkmann, M., Pfohl, T., Herminghaus, S.
- Baret, J. C.
- Clausell-Tormos, J., et al. Droplet-based microfluidic platforms for the encapsulation and screening of mammalian cells and multicellular organisms. Chem Biol. 15 (5), 427-437 (2008).
- Umbanhowar, P. B., Prasad, V., Weitz, D. A. Monodisperse emulsion generation via drop break off in a coflowing stream. Langmuir. 16 (2), 347-351 (2000).
- Abate, A. R., Thiele, J., Weitz, D. A. One-step formation of multiple emulsions in microfluidics. Lab Chip. 11 (2), 253-258 (2011).
- Chen, Y., Gao, W., Zhang, C., Zhao, Y.
- Ahn, K., Agresti, J., Chong, H., Marquez, M., Weitz, D. A. Electrocoalescence of drops synchronized by size-dependent flow in microfluidic channels. Appl Phys Lett. 88 (26), 264105 (2006).
- Fidalgo, L. M., Abell, C., Huck, W. T. S. Surface-induced droplet fusion in microfluidic devices. Lab Chip. 7 (8), 984-986 (2007).
- Bernath, K., et al. In vitro compartmentalization by double emulsions: Sorting and gene enrichment by fluorescence activated cell sorting. Anal Biochem. 325 (1), 151-157 (2004).
- Aharoni, A., Amitai, G., Bernath, K., Magdassi, S., Tawfik, D. S. High-throughput screening of enzyme libraries: thiolactonases evolved by fluorescence-activated sorting of single cells in emulsion compartments. Chem Biol. 12 (12), 1281-1289 (2005).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Huck, W. T. S. Monodisperse uni- and multicompartment liposomes. J Am Chem Soc. 138 (24), 7584-7591 (2016).
- Deng, N. N., Yelleswarapu, M., Zheng, L., Huck, W. T. S. Microfluidic assembly of monodisperse vesosomes as artificial cell models. J Am Chem Soc. 139 (2), 587-590 (2016).
- Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
- Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
- Shembekar, N., Chaipan, C., Utharala, R., Merten, C. A. Droplet-based microfluidics in drug discovery, transcriptomics and high-throughput molecular genetics. Lab Chip. 16 (8), 1314-1331 (2016).
- Wong, A. H., et al. Drug screening of cancer cell lines and human primary tumors using droplet microfluidics. Sci Rep. 7 (1), 9109 (2017).
- Jing, W., Han, H. Droplet microfluidics for high-resolution virology. Anal Chem. 94 (23), 8085-8100 (2022).
- Ding, Y., Choo, J., deMello, A. J. From single-molecule detection to next-generation sequencing: microfluidic droplets for high-throughput nucleic acid analysis. Microfluid Nanofluidics. 21 (3), 58 (2017).
- Nightingale, A. M., et al. A stable droplet reactor for high temperature nanocrystal synthesis. Lab Chip. 11 (7), 1221-1227 (2011).
- De Stefano, P., Bianchi, E., Dubini, G. The impact of microfluidics in high- throughput drug-screening applications. Biomicrofluidics. 16 (3), 031501 (2022).
- Tekin, E., et al. Prevalence and patterns of higher-order drug interactions in Escherichia coli. NPJ Syst Biol Appl. 4, 31 (2018).
- Eduati, F., et al. A microfluidics platform for combinatorial drug screening on cancer biopsies. Nat Commun. 9 (1), 2434 (2018).
- Utharala, R., et al. A microfluidic Braille valve platform for on-demand production, combinatorial screening and sorting of chemically distinct droplets. Nat Protoc. 17 (12), 2920-2965 (2022).
- Mathur, L., et al. Combi-seq for multiplexed transcriptome-based profiling of drug combinations using deterministic barcoding in single-cell droplets. Nat Commun. 13 (1), 4450 (2022).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription–translation for the prototyping of synthetic communication networks. Curr Opin Biotechnol. 58, 72-80 (2019).
- Kulesa, A., Kehe, J., Hurtado, J. E., Tawde, P., Blainey, P. C. Combinatorial drug discovery in nanoliter droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (26), 6685-6690 (2018).
- Tomasi, R. F. X., Sart, S., Champetier, T., Baroud, C. N. Individual control and quantification of 3D spheroids in a high-density microfluidic droplet array. Cell Rep. 31 (8), 107670 (2020).
- White, J. A., Streets, A. M. Controller for microfluidic large-scale integration. HardwareX. 3, 135-145 (2018).
- Brower, K., et al. An open-source, programmable pneumatic setup for operation and automated control of single- and multi-layer microfluidic devices. HardwareX. 3, 117-134 (2018).
- Gonzalez-Suarez, A. M., Long, A., Huang, X. H., Revzin, A. A Compact control system to enable automated operation of microfluidic bioanalytical assays. Biosensors. 12 (12), 1160 (2022).
- Mathur, L., Ballinger, M., Utharala, R., Merten, C. A. Microfluidics as an enabling technology for personalized cancer therapy. Small. 16 (9), e1904321 (2020).
