Aplysia californica neuronas desarrollan un gran crecimiento en los conos de la cultura que son excelentes para imágenes de alta resolución de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. Aquí, se presenta un protocolo para la disección y de las planchas de las neuronas de células Aplysia bolsa, así como para la creación de una cámara de imágenes de células vivas.
Abstract
Conos de crecimiento neuronales son estructuras altamente móviles en la punta de los axones que pueden detectar señales de orientación en el medio ambiente y la transducción de esta información en el movimiento direccional hacia la celda de destino adecuado. Para entender completamente cómo la información se transmite a la orientación de la superficie celular a la base de redes citoesqueleto dinámico, se necesita un sistema de modelo adecuado para imágenes de células vivas de la dinámica de proteínas de alta resolución temporal y espacial. Típico de los conos de crecimiento de vertebrados son demasiado pequeños para analizar cuantitativamente la F-actina y la dinámica de los microtúbulos. Las neuronas de la liebre de mar Aplysia californica son 5-10 veces más grande que las neuronas de los vertebrados, fácilmente se puede mantener a temperatura ambiente y son células muy robusta de micromanipulación y mediciones biofísicas. Sus conos de crecimiento tienen muy definido regiones citoplásmicas y un sistema de citoesqueleto bien descritos. Los cuerpos de las células neuronales se pueden microinyección con una variedad de sondas para el estudio de la motilidad del cono de crecimiento y orientación. En el presente Protocolo que demostrar un procedimiento para la disección de los ganglios abdominales, la cultura de las neuronas de células bolsa y la creación de una cámara de imágenes de imágenes de células vivas de los conos de crecimiento.
Protocol
Soluciones L15-ASW medio de cultivo celular (1l) 1 bolsa de polvo L15 Añadir 800 ml de H 2 O ultrapura NaCl 400 mM MgSO4 27 mM MgCl2 28 mM L-glutamina 4 mM Gentamicina 50 mg / ml HEPES 5 mM Ajustar el pH a 7.9 Añadir gota a gota, CaCl2 9,3 mM (parada si se precipita) Añadir H 2 O ultrapura a 1 l Compruebe la osmolaridad (950-1000 mg / …
Discussion
Aplysia neuronas de células bolsa de proporcionar un suero libre de cultivos de células neuronales del sistema con muy pocas células no neuronales. Estas neuronas forman los conos de crecimiento muy grande adecuado para hacer frente a una serie de preguntas de biología celular importante. Bolsa de neuronas de células pueden ser instrumentalizadas fácilmente y con imágenes a temperatura ambiente durante varias horas. Utilizando microscopía de fluorescencia moteado (FSM), una cuantitativa puede analizar los distintos parámetros de F-…
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a Ryan Maneri (Producciones ostrero, LLC) para filmar nuestro procedimiento y Rodney McPhail (Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Purdue) para obtener ayuda con la edición de vídeo disección. La investigación en el laboratorio de Suter es apoyado por subvenciones del NIH (R01 NS049233) y el Centro Bindley Bioscience en la Universidad Purdue de DMS
Lee, A. C., Decourt, B., Suter, D. M. Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones. J. Vis. Exp. (12), e662, doi:10.3791/662 (2008).