Summary
Основное внимание в этой статье уделяется подробному описанию передового опыта создания сред для привередливых анаэробных микроорганизмов, полученных из окружающей среды. Эти методы помогают управлять анаэробными культурами и могут применяться для поддержки роста неуловимых некультивируемых микроорганизмов, «микробной темной материи».
Abstract
Культурально-зависимое исследование анаэробных микроорганизмов опирается на методологическую компетентность. Эти методы должны создавать и поддерживать подходящие условия роста (например, pH и источники углерода) для анаэробных микроорганизмов, а также позволять извлекать образцы без ущерба для искусственной среды. С этой целью методы, основанные на информации и моделирующие среду in situ, могут оказать большую помощь в культивировании микроорганизмов из этой среды. В этой статье мы описываем анаэробный метод культивирования наземных и подповерхностных микроорганизмов in situ , основанный на анаэробном отборе проб с минимальными возмущениями. В этом протоколе подробно описывается производство настраиваемой анаэробной жидкой среды, а также получение и выращивание анаэробных микроорганизмов в окружающей среде in vitro . Протокол также охватывает важнейшие компоненты анаэробного биореактора, используемого для моделирования условий окружающей среды осадка и анаэробных жидких сред для культур, полученных в окружающей среде. Мы включили предварительные данные секвенирования следующего поколения из поддерживаемого микробиома в течение всего срока службы биореактора, где активная культура динамически корректировалась в ответ на экспериментальный источник углерода.
Introduction
Большинство микроорганизмов остаются некультивированными; Это подтверждается большим несоответствием между клетками, наблюдаемыми с помощью микроскопии, в отличие от нескольких микроорганизмов, успешно культивируемых с использованием агаровых пластин. Стейли и Конопка назвали это несоответствие «Аномалией большого количества плит»1. Оценка неучтенного разнообразия подтверждается метагеномными и метатранскриптомными данными, показывающими множество новых родов, распределенных по ранговым кривым численности из нескольких различных сред2. Микроорганизмы, которые были обнаружены (как правило, путем случайного секвенирования микробного сообщества), но не культивировались, были названы «микробной темной материей»3,4.
В эпоху омиксов культивирование микроорганизмов остается обязательным условием для полной оценки геномных данных и проверки функции/фенотипа присутствующих генов. Секвенирование культивируемых микроорганизмов по-прежнему остается единственным способом уверенного получения полных геномов до тех пор, пока такие технологии, как метагеномика дробовика и метагеном, собранные из окружающей среды, не станут допустимо непогрешимыми. Геномные оценки в сочетании с культивируемыми микроорганизмами дают убедительные выводы для понимания «микробной темной материи». Многие представители «микробной темной материи» выполняют важнейшие функции, влияющие на круговорот питательных и других элементов и производство ценных природных продуктов, поддерживают экологические системы и оказывают экологические услуги. С медицинской точки зрения, около половины всех продаваемых в настоящее время фармацевтических препаратов являются продуктами и производными продуктов из бактерий, и предполагается, что профилирование некультивируемых видов позволит выявить антибиотики будущего. Чтобы получить доступ к этому некультурному большинству, необходимо расширить разнообразие методологий культивирования. Среди представителей «микробной темной материи» анаэробные олиготрофные микроорганизмы в значительной степени недоописаны и,вероятно, обладают экологически и промышленно ценными биохимическими путями, что делает их важными мишенями для культивирования. Однако анаэробные олиготрофные микроорганизмы труднее культивировать, чем их аэробные и копиотрофные аналоги, из-за часто требуемого более длительного времени инкубации, привередливых условий (например, особых нестандартных температур in vitro ) и использования специализированных рецептур сред.
Современные методы культивирования членов «микробной темной материи», включая новые анаэробные олиготрофные микроорганизмы, значительно улучшили наше понимание и увеличили представленность этих микроорганизмов в филогенетическом древе. Существующие методы, использующие информированные среды для культивирования новых микроорганизмов (т.е. среды, полученные с использованием знаний об интересующем микроорганизме (микроорганизмах), можно разделить на три различных метода. Первый из методов заключается в прямом удалении дискретного участка среды для переноса в камеру для роста in vitro, которая уже содержит интересующие микроорганизмы внутри мембраны. Дискретная секция (например, морская вода) обеспечивает интересующие микроорганизмы геохимической средой обитания, которую они используют in situ, в то время как мембрана останавливает движение клеток поперек (интересующие клетки останутся внутри; посторонние клетки, прибывшие с дискретным участком, останутся снаружи). Путем включения соединений, естественным образом доступных для целевых микроорганизмов в их естественной среде обитания, такие микроорганизмы могут культивироваться8. Второй метод использует метатранскриптомику или геномику для выяснения метаболических возможностей, предоставляя ключи к узким параметрам культивирования для целевого дизайна среды. Этот подход обеспечивает эколого-физиологический профиль, который может быть использован для целенаправленного обогащения определенных типов микроорганизмов из окружающей среды. Средства среды предназначены для выявления присутствующих генов, которые, как предполагается, поддерживают целевой микроорганизм (микроорганизмы) для уменьшения разнообразия обогащения,9,10. Одно из предостережений заключается в том, что геномная информация не дает прямого вывода об экспрессии генов, в то время как транскриптомная информация делает это.
Третий метод включает в себя экологически информированные и смоделированные среды, в отличие от первого метода, который не моделирует среду, а использует окружающую среду непосредственно в качестве источника среды. Этот третий метод требует экологической разведки геохимии полевого участка, содержащего интересующие микроорганизмы. Обладая этими знаниями, основные компоненты и физические параметры определяются для создания экологически обоснованной моделируемой среды. Затем среда получает прямую инфузию осадка или жидкости, содержащей микроорганизмы, из окружающей среды в среду. Этот метод особенно ценен в тех случаях, когда микробиолог, занимающийся культивированием, не имеет доступа к достаточному количеству исходной среды (как это необходимо для первого метода) или к соответствующим метатранскриптомным или геномным данным (как это необходимо для второго метода).
Следующий протокол является примером третьего метода; Он основан на информации и направлен на моделирование интересующих сред. В протоколе параллельно представлены три наивных рецепта среды, нацеленных на различные анаэробные культуры микроорганизмов, полученные в полевых условиях. Представлены три культуры: смешанные культуры, происходящие из почвы (далее — смешанная почвенная культура), смешанные культуры, происходящие из скважины (далее — скважинная смешанная культура) и изолированный метаноген, происходящий из скважины (далее — скважинный изолированный метаноген). Составные тождества и количества в рецептах СМИ, представленных здесь, предназначены для начального руководства; Они могут и поощряются к адаптации к окружающей среде читателя и интересующим его микроорганизмам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Производство настраиваемой анаэробной жидкой среды
- Среда для флаконов для культур (производство 500 мл)
- Отмерьте и добавьте соединения в бутылку объемом 1 л и отрегулируйте pH, используя столбец в таблице 1 , соответствующий интересующей читателя культуре (количества в таблице 1 записаны для производства 1000 мл, отрегулируйте соответствующим образом). Смешайте компаунды до однородности, вкручивая бутылку.
- Нагрейте жидкость до кипения, разогрев бутылку в микроволновой печи в течение 5-6 минут. Часто открывайте микроволновую печь и осторожно взбалтывайте жидкость с помощью термостойкой перчатки. Быстро откройте микроволновую печь, если жидкость после бурления остается неподвижной; В противном случае жидкость может быстро расшириться и переполнить бутылку.
- Присоедините стерильную стеклянную пипетку объемом 10 мл к газовому коллектору N2 (на основе конструкции Balch et al.11, хотя для получения газа чистоты N2 не требуется нагретая медная колонка; дополнительную информацию о газовом коллекторе см. в Дополнительном файле 1 ). Откройте коллектор, чтобы выпустить O2 и дать газу N2 вытекать наружу.
- Поместите наконечник пипетки в жидкость и отрегулируйте поток газа так, чтобы пузырьки были умеренно энергичными. Промойте жидкость с помощью N2 до тех пор, пока бутылка не станет слишком горячей, чтобы к ней можно было прикоснуться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это зависит от содержимого носителя, но обычно занимает ~20 минут. - Ожидая, пока флакон остынет, выложите 10 стерильных флаконов с культурой по 100 мл; или, если готовится среда для сбора смешанной почвы, установите две стерильные бутылки по 500 мл.
- Когда флакон с фильтрующим материалом остынет на ощупь, потяните наконечник пипетки вверх в свободное пространство флакона. Добавьте 0,125 г NaHCO3 и 0,300 гNa2S∙9H2Oи подождите, пока резазурин не станет бесцветным.
ВНИМАНИЕ: Na2S∙9 H2O вызывает коррозию, токсичен и раздражает. Используйте средства индивидуальной защиты при работе и тщательно промойте металлические инструменты после контакта. - Ожидая, пока резазурин изменит цвет, прикрепите металлические канюли к установке газового коллектора и поместите наконечники канюль в бутылки для культивирования. Отрегулируйте потокN2 в бутылки до умеренной скорости, чтобы жидкость, добавленная на следующем этапе, не плескалась из-за потока газа.
- После того, как резазурин станет бесцветным, добавьте 50 мл жидкости в каждый флакон для культуры или 250 мл жидкости в каждый флакон объемом 500 мл.
- Закрывайте каждую бутылку резиновой пробкой подходящего размера сразу после извлечения канюль. Закрепите пробку алюминиевым уплотнением (для бутылочек с культурой) или завинчивающейся крышкой GL45 с открытым верхом (для бутылок объемом 500 мл).
- Поместите бутылки в автоклавируемый контейнер и наполните контейнер водопроводной водой, пока уровень воды не сравняется с уровнем воды в бутылках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что бутылки не разорвутся из-за напряжения, вызванного перепадами температур на стекле во время автоклавирования. - Автоклавируйте бутылки при температуре 121 °C в течение 30 мин.
- Среда для биореактора (производительность 8 л)
- Подготовка карбоя
- Откройте клапан шарового крана с зазубринами для шланга 1/4 дюйма (6,4 мм). Прикрепите две силиконовые трубки длиной 6 см с внутренним диаметром (ID) 1/4 дюйма (6,4 мм) и внешним диаметром (OD) 1/2 дюйма (12,7 мм) на оба конца шарового крана с зазубринами для шланга.
- Прикрепите к одному концу узла фитинг адаптера для шланга 5/16–1/4 дюйма (7,9–6,4 мм). Прикрепите другой конец узла к штуцеру шланга 8-литрового карбоя.
- Используйте стяжку-молнию, чтобы закрепить соединение между штуцером шланга и трубкой, а также соединение между переходным фитингом штуцера для шланга и трубкой.
- Автоклавировать карбой со сборкой при 121 °C в течение 30 мин.
- Средняя производительность
- Закройте клапан шарового крана штуцера шланга на 8 л в сборе.
- Отмерьте и добавьте соединения в 8-литровый контейнер и отрегулируйте pH, используя столбец в таблице 1 , соответствующий интересующей читателя культуре (количества в таблице 1 записаны для производства 1000 мл, отрегулируйте соответствующим образом). Добавьте перемешиватель и используйте горячую плиту для перемешивания, чтобы смешать смеси до однородности.
- Нагрейте жидкость до кипения с помощью помешивающей плиты. Дайте жидкости закипеть в течение 30 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нагрев жидкости до кипения зависит от содержимого среды, но может занять 2-3 часа. - Присоедините стерильную стеклянную пипетку объемом 10 мл к газовому коллектору N2 (на основе конструкции Balch et al.11, хотя для получения газа чистоты N2 не требуется нагретая медная колонка; дополнительную информацию о газовом коллекторе см. в Дополнительном файле 1 ). Откройте коллектор, чтобы выпустить O2 и дать газу N2 вытекать наружу.
- Выключите огонь, затем поместите наконечник пипетки в жидкость и отрегулируйте поток газа так, чтобы пузырьки были умеренно энергичными, но не переполнялись. Промывайте жидкостьN2 в течение 30 мин.
- Потяните наконечник пипетки вверх в свободное пространство коробки. Добавьте 2,0 г NaHCO3 и 4,8 гNa2S∙9 H2O и подождите, пока резазурин не станет бесцветным.
ВНИМАНИЕ: Na2S∙9 H2O вызывает коррозию, токсичен и раздражает. Используйте средства индивидуальной защиты при работе и тщательно промойте металлические инструменты после контакта. - Как только резазурин станет бесцветным, извлеките стеклянную пипетку и сразу же закройте коробку пробкой #10. Скрутите проволоку над пробкой и вокруг кромки карбоя, чтобы закрепить пробку.
- Подготовка карбоя
2. Получение in situ анаэробных микроорганизмов окружающей среды
- Забор поверхностных анаэробных проб (почвенная смешанная культура)
- Принесите в поле бутылку (бутылки) со смешанной питательной средой для почвенных культур, приготовленную, как указано выше, и керноотборник.
ПРИМЕЧАНИЕ: Авторами используется стандартная коническая коронка Giddings 2 5/8" (Таблица материалов). Тем не менее, можно использовать любой керн или мастерок, который может взять пробы на желаемую глубину. - Вдавливайте (забивайте сваи/колышки) керн в осадок до тех пор, пока верхняя часть цилиндра для сбора проб не окажется на одном уровне с поверхностью осадка.
- Поверните керн на 90°, чтобы освободить керн, и потяните вверх, пока образец не будет извлечен из окружающей среды.
- В рыхлых отложениях (например, с которыми можно столкнуться при отборе проб водно-болотных угодий) накройте основание керна новой рукой в нитриловой перчатке во время извлечения, чтобы предотвратить выпадение или распространение образца в воду при извлечении.
- Быстро приблизите на глаз на 6-7 см вверх от основания сердцевины. Новой рукой в нитриловой перчатке надрежьте сердцевину и отделите нижнюю часть на 6-7 см.
- Сразу же перенесите дно сердцевины в бутылку с культурой. Если почва/осадок слишком большой, быстро сформируйте его, чтобы он легче поместился в бутылку, максимально минимизировав воздействие аэробной атмосферы.
- После переноса образца немедленно переместите пробку и удерживайте ее на месте с помощью завинчивающейся крышки.
- Держите образец в прохладном месте. По возвращении в лабораторию охладите флакон для сбора при температуре 4 °C.
- Принесите в поле бутылку (бутылки) со смешанной питательной средой для почвенных культур, приготовленную, как указано выше, и керноотборник.
- Подповерхностный анаэробный отбор проб (скважинная смешанная культура)
- Поставьте стерильную бутылку объемом 1 л у газового коллектора. Укупорьте бутылку резиновой пробкой. Капните 100% этанол на пробку и подожгите ее с помощью зажигалки.
- Прикрепите стерильную иглу 23 G к газовому коллектору N2 . Откройте коллектор, чтобы выпустить O2 и позволить газу N2 (или Ar) вытекать с умеренной скоростью.
- Как только пробка перестанет гореть, вставьте иглу в бутылку. Вставьте в баллон вторую стерильную иглу 23 G, не прикрепленную к газовому коллектору. Промывайте флакон в течение 1-2 минут.
- Извлеките иглу, не прикрепленную к газовому коллектору. Нагнетайте давление в баллоне в течение 1 минуты. Извлеките оставшуюся иглу.
- Поднесите баллон под давлением и стерилизованную иглу 23 G к месту бурения скважины. Забор жидкости из скважины осуществляется в соответствии с методами Merino et al.12.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от метода, подключения и расхода скважины это меняет стратегию отбора пробы воды. При непрерывном потоке воды набирают воду, как описано в шаге 2.2.6. будет достаточно. Если поток воды периодический или с низким расходом, то можно использовать альтернативный метод входа/выхода. Во всех ситуациях сведите к минимуму загрязнение и постарайтесь убедиться, что собранная проба соответствует окружающей среде, в которой необходимо взять пробы. Это широко обобщенное утверждение, поскольку, по опыту авторов, каждое мероприятие по сбору образцов на правительственных или частных объектах должно быть в значительной степени адаптировано к имеющейся доступности. - Быстро откройте бутылку, закачайте жидкость, чтобы полностью заполнить бутылку, и закройте бутылку.
- Вставьте иглу 23 G, которую принесли с собой на место, в резиновую пробку бутылки, чтобы уменьшить давление в бутылке. Извлеките иглу.
- Держите образец в прохладном месте. По возвращении в лабораторию охладите флакон для сбора при температуре 4 °C.
3. Выращивание in vitro анаэробных микроорганизмов, полученных в полевых условиях
- Выращивание по бутылке с культурой
- Выложите стерильную бутылку N2 с пробкой, а также флаконы для культивирования и бутылку для сбора, приготовленные, как указано выше. Капните 100% этанол на пробки и подожгите их с помощью зажигалки.
- Соберите иглу 23 G на шприц объемом 1 мл. Как только пробки перестанут гореть, вставьте иглу во флаконN2 и наберите ~1 млN2. Извлеките иглу.
- Медленно нажмите на поршень, чтобы освободить N2. Как только шприц опустеет, вставьте иглу во флакон для сбора и наберите 0,5 мл пробы окружающей среды. Извлеките иглу.
- Вставьте иглу во флакон для культивирования и введите образец. Извлеките иглу.
- Взболтайте бутылку и поместите ее в инкубатор при температуре, указанной в таблице 1 или в интересующей читателя обстановке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прогресс культивирования (в бутылке или биореакторе) контролируется с помощью гемоцитометра Петрова-Хаузера глубиной 0,02 мм. Обогащение анаэробных или привередливых микроорганизмов, как правило, не достигает плотности клеток, при которой можно использовать OD600 , а другие методы обнаружения непрактичны для рутинного и повторяющегося мониторинга. Пределы обнаружения, контроль качества и статистические расчеты зависят от типа камеры для подсчета клеток и потребностей пользователя.
- Рост по биореакторам
- Подготовка баллона модифицированным шприцем
- Снимите поршень с трех шприцев с замком Люэра объемом 10 мл (по одному на каждую окончательную сборку). Отрежьте фланец от каждого шприца и подпилите отрубленный конец, чтобы он не проткнул баллоны. Очистите модифицированный шприц от всех подпиленных стружок.
- Подготовьте двойной воздушный шар, поместив один воздушный шар внутрь другого.
- Протяните конец удвоенного баллона над модифицированным шприцем объемом 10 мл.
- Слегка отделите конец внешнего баллона от внутреннего. Выдавите весь воздух, попавший между баллонами.
- Затяните стяжку вокруг основания баллонов, чтобы закрепить баллоны на шприце.
- Приготовление модифицированной пробки
- Снимите поршни с десяти шприцев с замком Люэра объемом 1 мл (по два на каждую модифицируемую пробку). Отрежьте фланец от шприцев.
- Установите две резиновые пробки размера #10 (для 8-литровых бутылок) и три размера для бутылок с резьбой GL45 (для бутылок с уловом). С помощью сверла 1/4 дюйма (6,4 мм) просверлите два отверстия в верхней части каждой резиновой пробки, достаточно широкие, чтобы модифицированные шприцы могли поместиться, и достаточно узкие, чтобы посадка была герметичной.
- Вставьте модифицированные шприцы через отверстия резиновой пробки.
- Очистите и автоклавируйте модифицированную пробку при температуре 121 °C в течение 30 минут.
- Подготовка сборки биореактора
- Продезинфицируйте 70% этанолом все запорные краны, переходные соединители замка Люэра с внутренней резьбой и другие неавтоклавируемые материалы биореактора и автоклавируйте при 121 °C в течение 30 минут все трубки (после нарезки по длине), пробки, стекловату и другие автоклавируемые материалы биореактора.
- Установите стерильный биореактор (Рисунок 1 и Рисунок 2) на кольцевую подставку и закрепите его ремнем-цепочкой. Кроме того, установите водяную баню, перистальтический насос, закупоренную 8-литровую бутылку, содержащую среду (из шага протокола 1.2), одну бутылку объемом 3,5 л (бутылку для отбора проб) и одну бутылку объемом 500 мл (бутылку для отбора проб).
- Укупорка автомобиля
- Выложите баллон модифицированным шприцем. Подсоедините трехходовой запорный кран к наконечнику замка Люэра шприца.
- Возьмите баллон в сборе и подсоедините трехходовой запорный кран к трубке резервуара N2. Поверните трехходовой запорный кран, чтобы перекрыть конец, открытый для атмосферы.
- Откройте бензобак и наполните баллон N2. После заполнения поверните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать конец воздушного шара. Закройте бензобак и отсоедините трубку бака от трехходового запорного крана.
- Подсоедините последовательно: трехходовой запорный кран (баллона с модифицированным шприцем), двуходовой запорный кран, переходную муфту с внутренней резьбой и наконечник замка Люэра одного из модифицированных шприцев пробки.
- К наконечнику замка Люэра другого шприца подсоедините двусторонний запорный кран. Закройте оба клапана двуходовых запорных кранов на модифицированном стопорном узле.
- Размотайте проволоку, удерживающую пробку немодифицированного размера #10 автомобиля. Быстро замените немодифицированную пробку на модифицированную пробку в сборе и скрутите проволоку, как раньше, чтобы закрепить модифицированный стопор в сборе с автомобилем.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если вы уверены и подготовлены, модифицированный узел стопора может быть использован для закупорки автомобиля на заключительном этапе подготовки среды (шаг 1.2.2.7). - Поверните трехходовой запорный кран, чтобы перекрыть конец, открытый для атмосферы. Последовательно откройте двусторонний запорный кран. Газ баллона и свободное пространство 8-литрового карбоя теперь соединены.
- Укупорка бутылок для отбора проб и пробоотборных бутылок
- Укупорите 3,5-литровую бутылку без отбора проб с помощью модифицированной пробки для бутылок с резьбовой отделкой GL45, нанеся 70% этанола на основание пробки, чтобы помочь поместить ее в бутылку. Закройте бутылку завинчивающейся крышкой GL45 с открытым верхом.
- Подсоедините последовательно: баллон с наконечником замка Люэра модифицированного шприца, трехходовым запорным краном, переходной муфтой с замком Люэра с внутренней резьбой и наконечником замка Люэра одного из модифицированных шприцев с пробкой. Поверните трехходовой запорный кран, чтобы перекрыть открытый конец прямо в атмосферу.
- К наконечнику замка Люэра другого шприца подсоедините переходную муфту с внутренней резьбой и замком Люэра.
- Повторите описанные выше три шага для бутылки для отбора проб объемом 500 мл.
- Настройка насосно-компрессорных труб
- Измерьте расстояние между отверстиями водяной рубашки биореактора и зазубринами шланга водяной бани. Отрежьте две длины силиконовых трубок с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы охватить это расстояние.
- Соберите два прямых соединителя шлангов с завинчивающимися крышками GL14 с открытым верхом. Прикрепите каждый к одному концу двух частей трубки.
- Закрутите завинчивающиеся крышки на отверстиях водяной рубашки биореактора. Прикрепите другие концы трубки к зазубрителям шланга водяной бани так, чтобы вода вытекала из водяной бани, входила в нижнюю часть водяной рубашки биореактора, выходила в верхней части водяной рубашки и возвращалась на водяную баню. Затяните застежки-молнии вокруг концов трубки, чтобы закрепить трубку на зазубринах шланга водяной бани.
- Для насосов, аналогичных мини-насосу VWR со сверхнизким расходом и переменным расходом, проденьте через насос прилагаемый узел трубки с прорезью 3/16 дюйма (4,8 мм).
- Измерьте расстояние между узлом трубки карбоя и узлом трубки перистальтического насоса. Отрежьте длину силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы преодолеть это расстояние.
- Прикрепите один конец трубки к штуцеру шланга узла трубки карбоя, а другой - к штуцеру шланга узла трубки перистальтического насоса, ориентируя их таким образом, чтобы среда вытекала из кассеты и проходила через перистальтический насос.
- Измерьте расстояние между трубкой перистальтического насоса в сборе и нижним отверстием биореактора. Отрежьте длину силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы преодолеть это расстояние.
- Прикрепите один конец этой трубки к штуцеру шланга трубки перистальтического насоса в сборе, а другой осторожно прикрепите к нижнему отверстию биореактора. Стараясь не разбить стекло, а также закрепить соединение, затяните стяжку вокруг конца трубки, чтобы прикрепить трубку к нижнему отверстию биореактора.
- Измерьте и отрежьте примерно 5 дюймов (127 мм) длины силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм).
- Прикрепите гнездовой разъем адаптера замка Люэра к трехходовому запорному крану. Прикрепите любой конец трехходового запорного крана к трубке.
- Соберите один угловой соединитель шланга с завинчивающейся крышкой GL14 с открытым верхом. Прикрепите его к другому концу трубки.
- Закрутите завинчивающуюся крышку на самое верхнее вертикальное отверстие биореактора. Поверните трехходовой запорный кран, чтобы перекрыть конец, направленный на биореактор.
- Измерьте расстояние между самым верхним вертикальным узлом порта в сборе и узлом бутылки для сбора проб без отбора проб. Отрежьте длину силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы преодолеть это расстояние. Отрежьте фланцы от двух шприцев с замком Люэра объемом 1 мл и вставьте их в концы трубки.
- Прикрепите один конец этой трубки в сборе к трехходовому запорному крану самого верхнего вертикального узла порта, а другой конец прикрепите к гнездовому разъему адаптера замка Люэра на узле бутылки для отбора проб без отбора проб.
- Измерьте расстояние между самым верхним вертикальным узлом порта и узлом бутылки для отбора проб. Отрежьте длину силиконовой трубки с внутренним диаметром 3/16 дюйма (4,8 мм) и наружным диаметром 3/8 дюйма (9,5 мм), чтобы преодолеть это расстояние. Отрежьте фланцы от двух шприцев с замком Люэра объемом 1 мл и вставьте их в концы трубки.
- Прикрепите один конец этой трубки в сборе к трехходовому запорному крану самого верхнего вертикального узла порта, а другой — к гнездовому разъему адаптера замка Люэра на узле бутылки для отбора проб.
- Заполнение биореактора
- Закройте один из портов GL18 биореактора белой резиновой перегородкой. Закройте другой порт GL18 и остальные вертикальные открытые порты GL14 силиконовыми перегородками с покрытием из ПТФЭ размера GL18/GL14 (ПТФЭ обращен к стеклу) и открытыми верхними завинчивающимися крышками.
- Стержнем длиной 50 см уложите 0,9 г стекловаты в основание биореактора.
- Автоклав 1,3 л песка при 121 °C в течение 30 мин. Наполните биореактор песком с помощью воронки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь могут быть заменены другие типы отложений, основанные на окружающей среде читателя и интересующих его микроорганизмах. - Поместите трубку в резервуар сN2 в верхнюю часть биореактора и промойте свободное пространство биореактораN2 в течение 2 минут. Немедленно закройте биореактор пробкой размера #7 и завинчивающейся крышкой GL45 с открытым верхом.
- От бутылки для отбора проб отсоедините трубку и поверните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать конец, направленный на баллон. Подсоедините трубку к резервуару N2 к разъему адаптера замка Люэра с внутренней резьбой и промойте свободное пространство биореактораN2 в течение 2 минут. Немедленно подсоедините трубку и верните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать открытый конец для атмосферы.
- Повторите описанный выше шаг для бутылки для отбора проб.
- Поверните трехходовой запорный кран самого верхнего вертикального отверстия биореактора, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку для отбора проб. Перекачайте жидкость из машины в биореактор. Приостановите насос, выпустите воздух из баллона с бутылкой для отбора проб и наполните баллон карбояN2 по мере необходимости.
- После того, как биореактор будет заполнен средой, установите скорость потока насоса на 0,6 мл/мин (цифровое значение 40 на мини-насосе).
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь можно заменить другие желаемые считывателем скорости потока. - Установите температуру водяной бани в соответствии с таблицей 1 или окружающей средой, интересующей читателя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Посевной материал может быть добавлен на этом этапе или позже, в зависимости от специфики исследования. Если вы делаете прививку на этом этапе, перейдите к шагу 3.2.4.10. Если прививка выполняется позже, перейдите к шагу 3.2.5. - Выложите флакон для сбора или флакон для посева и стерильный флакон с пробкой изN2. Капните 100% этанол на пробки и подожгите их с помощью зажигалки.
- Соберите иглу 23 G на шприц объемом 60 мл. Как только пробки перестанут гореть, вставьте иглу во флаконN2 и наберите ~50 млN2. Извлеките иглу.
- Медленно нажмите на поршень, чтобы освободить N2. Как только шприц опустеет, вставьте иглу во флакон для сбора и наберите 50 мл образца окружающей среды. Извлеките иглу.
- Замените иглу 23 G на стерильную длинную металлическую иглу (канюлю, длина 31,5 см). Вставьте длинную металлическую иглу через белую резиновую перегородку на порте GL18 биореактора.
- Протолкните иглу в осадок и введите посевной материал. Извлеките иглу.
- Техническое обслуживание биореактора
- Каждый день, когда работает биореактор, выполняйте следующие действия:
- Проверьте уровень водяной бани. Если низкий, добавьте больше воды (используйте дистиллированную воду для увеличения срока службы оборудования за счет уменьшения коррозии и накопления минералов).
- Проверьте баллон бутылки для отбора проб; Полный баллон будет препятствовать потоку среды. Когда он заполнится, поверните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку-уловитель. Сожмите баллон, чтобы опорожнить его; Затем верните трехходовой запорный кран, чтобы заблокировать конец, открытый для атмосферы; Повторяйте до тех пор, пока шарик не опустеет.
- Проверьте баллон 8-литрового карбоя. Если низкий уровень, закройте последовательный двуходовой запорный кран и отсоедините трехходовой запорный кран от двуходового запорного крана. Заправьте и снова прикрепите узел номера позиции, выполнив шаги 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 и 3.2.3.3.7.
- Проверьте уровень среды в 8-литровом контейнере. Если низкий, соберите еще одну 8-литровую коробку и приготовьте больше среды, следуя шагам протокола 1.2. и 3.2.3.3. Приостановите насос, закройте шаровой кран штуцера шланга, быстро отсоедините старую машину и подсоедините новую машину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для расхода 0,6 мл/мин каждые 9 дней потребуется новая среда. - Проверьте уровень среды в бутылке для отбора проб. Если он заполнен, соберите еще одну бутылку для отбора проб в соответствии с шагом 3.2.3.4.1. Промойте новый флаконN2, быстро отсоедините баллон с модифицированным шприцем и трубкой от старой бутылки и подсоедините к новой бутылке.
- Извлеките модифицированную пробку из полной бутылки для отбора проб без отбора проб. Автоклавировать жидкость при 121 °C в течение 30 мин; Затем утилизируйте жидкость в соответствии с институциональной политикой читателя. Очистите и автоклавируйте все части сборки бутылки для отбора проб, чтобы подготовить их к следующему использованию.
- Выполняйте выборку каждые 7 дней (или желаемое по желанию читателя) количество дней, выполнив следующие действия:
- Поверните трехходовой запорный кран самого верхнего вертикального отверстия биореактора, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку для отбора проб. Соберите 250 мл жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для скорости потока 0,6 мл/мин сбор 250 мл займет ~7 часов. - Верните трехходовой запорный кран самого верхнего вертикального отверстия биореактора, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку для отбора проб. Отсоедините трубку и бутылку для отбора проб от трехходового запорного крана самого верхнего вертикального отверстия биореактора.
- После тестирования, хранения и/или надлежащей утилизации жидкости для отбора проб очистите все части узла бутылки для отбора проб, кроме баллона с модифицированным шприцем. Автоклавировать все детали при 121 °C в течение 30 мин, за исключением баллона с модифицированным шприцем и адаптерными разъемами с внутренней резьбой и замком Люэра. Соберите для следующего дня отбора проб.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настоятельно рекомендуется иметь дубликат или тройное резервирование деталей, крышек, трубок и перегородок для быстрого ремонта и замены в случае необходимости.
- Поверните трехходовой запорный кран самого верхнего вертикального отверстия биореактора, чтобы заблокировать конец, указывающий на бутылку для отбора проб. Соберите 250 мл жидкости.
- Каждый день, когда работает биореактор, выполняйте следующие действия:
- Подготовка баллона модифицированным шприцем
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы показываем результаты исследования биореактора с использованием метода приготовления скважинной смешанной питательной среды и метода настройки биореактора, как описано в настоящем документе. Скважинная смешанная питательная среда была модифицирована таким образом, чтобы содержать в качестве источника углерода суспензию кукурузных початков, обработанную методом окислительного гидротермального растворения (OHD)13,14. Модифицированную скважинную смешанную питательную среду закачивали в биореактор в течение 44 суток со скоростью 0,4 мл/мин. На 23-й деньбыл добавлен инокулюм, полученный из скважины BLM-1 в районе Долины Смерти в штате Невада, США. Пробы жидкости из биореактора собирали в бутылку для отбора проб на 1, 8, 15, 22, 23 (после инокуляции), 30, 37 и 44 сутки.
Чтобы отследить общее состояние культуры инокулята (и выживших в автоклаве обитателей осадка биореактора до посева), образцы жидкости из биореактора наблюдали путем прямого подсчета клеток. Прямой подсчет клеток в отобранной жидкости проводили с помощью гемоцитометра Петроффа-Хаузера. Чтобы узнать идентичность микробных членов биореактора, ДНК была выделена из жидких образцов биореактора, а гены 16S рРНК были проанализированы с помощью секвенирования нового поколения (NGS). Данные NGS были обработаны собственными силами с использованием mothur в соответствии с MiSeq SOP16.
До инокуляции прямое количество клеток часто было ниже предела обнаружения (b.d.l.), составляющего 1,0 × 10,6 клеток/мл. На 23-й день (после инокуляции) количество клеток составляло 2,6 × 106 клеток/мл, в то время как в последующие 30, 37 и 44 дни количество клеток превышало 1,0 × 107 клеток/мл (рис. 3). Несмотря на то, что на 1-й, 8-й и 22-й дни количество клеток было b.d.l., ДНК для NGS было выделено из каждого момента времени, что указывало на базальное присутствие микроорганизмов до посева в осадке даже после автоклавирования. Присутствующий основной род (определяемый по количеству прочтений в каждой оперативной таксономической единице (OTU)) был стабильным на 8, 15 и 22 день и был идентифицирован как Geobacillus. После инокуляции инокулюмом BLM-1 на 23-е сутки Geobacillus перестали доминировать, и появились новые основные роды, а также множество второстепенных родов, которые по большей части сохраняли свое присутствие до конца исследования (рис. 4). Из этого мы делаем вывод, что инокулюм BLM-1 был активной и динамично изменяющейся культурой внутри биореактора.
Дополнительное исследование данных NGS выявило представителей «микробной темной материи». ОТУ с присвоенными таксономическими названиями, содержащими слова «неклассифицированный» или «некультивируемый», использовались в качестве прокси для ОТУ, содержащих представителей «микробной темной материи». Данные NGS были собраны на 44-й день (последний день после инокуляции микроорганизмами из скважины BLM-1) и отфильтрованы, чтобы не содержать ОТУ, которые были считываются в данных до инокуляции (1, 8, 15 или 22 дни), поскольку эти ОТУ вряд ли были в инокуляте. Отфильтрованные данные NGS за 44-й день содержали 1 844 ОТУ и 3 396 считываний. Из них 366 ОТУ (20%) и 925 прочтений (27%) были неклассифицированы на уровне типа, а 1252 ОТУ (68%) и 2357 прочтений (69%) были неклассифицированными или некультивированными на уровне рода. Несмотря на то, что это пилотное исследование является краткосрочным, оно подтверждает потенциал биореактора с экологически информированной средой для культивирования членов «микробной темной материи».
Рисунок 1: Схема специально разработанного боросиликатного биореактора, используемого для анаэробного культивирования. (A) Вид на биореактор с одной стороны. (B) Поворот A на 90° (по часовой стрелке) вокруг оси Z дает вид). (C) Вид сверху на биореактор. Конструкция с рубашкой позволяет регулировать температуру с помощью воды или масла. Два порта оболочки можно увидеть в правой части изображения на рисунке B. Внутренняя камера может быть заполнена осадочными отложениями любого типа или может быть оставлена пустой для культивирования планктона. Три отверстия для отбора проб (см. справа на рисунке А) позволяют удалять материал на разной глубине колонны биореактора. Стандартные отверстия 45, 18 и 14 GL могут быть герметизированы с помощью тефлоновых или бутиловых перегородок, которые будут удерживать газонепроницаемое уплотнение в течение 1-6 месяцев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Сборка активного биореактора. Стеклянная посуда, представленная на фото слева направо: (А) 8-литровый карбой, (Б) биореактор (см. рис. 1) и (В) бутылка для отбора проб. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Прямое количество клеток в биореакторе. Микробные популяции в биореакторе контролировали с помощью камеры подсчета клеток гемоцитометра Петроффа-Хаузера диаметром 0,02 мм. Посевной материал был добавлен в начале 23-го дня. Количество клеток на 1-й, 8-й и 22-й дни было ниже предела обнаружения. Эффективный предел обнаружения при прямом подсчете клеток составляет 1 × 106 клеток/мл. Аббревиатура: b.d.l. = ниже предела обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Секвенирование нового поколения в биореакторе. ОТУ представлены в виде гистограмм с накоплением, показывающих процент прочтений, принадлежащих уникальным ОТУ для каждого момента времени исследования биореактора. Уникальные ОТУ были отнесены к ассоциированной с ними таксономии на родовой отсечке. Род «Другой» определяется как все роды, имеющие менее 10% прочтений в каждый момент времени. Общее количество представленных прочитываний ДНК составляет 506 358. Количество чтений для каждого момента времени указано в верхней части графика. Посевной материал был добавлен в начале 23-го дня. Аббревиатура: OTU = оперативная таксономическая единица. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
| Соединение | Количество для почвенной смешанной культуры | Количество для скважинной смешанной культуры | Количество выделенного в скважине метаногена |
| Дистиллированная вода | 1000,0 мл | 1000,0 мл | 1000,0 мл |
| ГЕПС | 3.600 г | - | - |
| ШВАБРЫ | - | - | 2.000 г |
| MgCl2 ∙6 ч2О | 0.400 г | 0.400 г | 0.400 г |
| KCl | 0.500 г | 0.250 г | 0.500 г |
| NH4кл | 0,268 г | 0,268 г | 0,268 г |
| Д/о2СО4 | - | 0,284 г | 1.500 г |
| Na2HPO4 ∙2 H2O | - | - | 0,356 г |
| 1 М KH2PO4 при pH 6 | 1,0 мл | 1,0 мл | - |
| 1 МH3BO3 при рН 9,4 | 1,0 мл | 1,0 мл | 1,0 мл |
| Микроэлементы | 1,0 мл | - | 1,0 мл |
| Витамины | - | - | 1,0 мл |
| 1 мг/мл натрия резазурин | 0,4 мл | 0,3 мл | 0,4 мл |
| Регулировка рН до | - | 7.0 | 7.0 |
| Регулировка рН с помощью | - | NaOH | КО |
| Температура инкубации | 25 °С | 60 °С | 47 °С |
Таблица 1: Состав СМИ. Перечень соединений и физических параметров для каждой среды. Представленные СМИ наивны; Они не содержат углерода и источников энергии, так как они могут быть специфичными для интересующих читателя микроорганизмов и окружающей среды. В разделе «Обсуждение» вы найдете идеи о возможном добавлении углерода и источников энергии.
Дополнительный файл 1: Настройка газового коллектора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Раздел этого протокола (раздел 1) обязан своей структурой модифицированной методике Хангейта Миллера и Волина17, которая широко использовалась с момента ее публикации. Практичность этого расширенного протокола обусловлена его описательным характером и сочетанием с получением микроорганизмов in situ . Флаконы для культивирования, содержащие экологически информированные и смоделированные среды, были использованы для успешного культивирования следующих бывших представителей «микробной темной материи», приобретенных in situ: анаэробные подповерхностные бактерии Thermoanaerosceptrum fracticalcis штамм DRI1318, Caldiatribacterium inferamans штамм SIUC1 (регистрационный номер MT023787; рукопись в стадии подготовки) и Anaerothermus hephaesti штамм SIUC3 (образец No MK618647; рукопись в разработке) и анаэробная подповерхностная бактерия неохарактеризованный штамм DRI14 (образец No KR708540).
Одним из основных направлений этого протокола является его высокая адаптивность к поверхностным и подповерхностным анаэробным средам и микроорганизмам. Во-первых, рекомендуется изменить состав среды, чтобы отразить состав интересующей среды. Например, 3 000 мг/л NaCl может быть добавлено в рецептуру при моделировании среды с ионной концентрацией 3 000 мг/л как для Na+, так и для Cl-; или 650 мл песка и 650 мл сланца могут быть помещены в биореактор при моделировании среды с объемным соотношением песчаника и сланца 1:1. Во-вторых, состав среды может быть изменен таким образом, чтобы стимулировать рост конкретных микроорганизмов, представляющих интерес. В частности, наивные СМИ, подобные трем СМИ в этой статье, подготовлены к таким модификациям и зависят от них. Примерами источников углерода и энергии являются фумарат18, пептон18, целлюлозосодержащее органическое вещество19, ацетат20, экстракт дрожжей19,20, ксилит (штамм SIUC1), формиат (штамм SIUC3) и другие потенциальные источники, такие какH2/CO2, цитрат и глюкоза. Наконец, состав среды может быть изменен в зависимости от желаемого исследования. Например, основной интерес исследования, описанного в разделе репрезентативных результатов, заключался в том, чтобы выяснить, как репрезентативные подповерхностные анаэробные микроорганизмы будут реагировать на уникальную смешанную органическую суспензию (суспензия кукурузных початков, обработанная OHD13,14); Таким образом, его рецепт содержал этот источник углерода вместо более традиционных вариантов. Другие потенциальные поправки для конкретных исследований включают добавление пластмасс, кислот и тяжелых металлов или других ксенобиотиков для исследований биоремедиации; добавление неподатливых углеродных полимеров, таких как целлюлоза и пластмассы, для исследований деполимеризованных продуктов с добавленной стоимостью; а также добавление навоза и растительных отходов для мелкомасштабного компостирования и других сельскохозяйственных исследований.
Если требуется поствосстановительный анализ среды, например, измерение pH, окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) и растворенного кислорода (РК), то это может быть достигнуто косвенно, пожертвовав репрезентативным количеством флаконов со средой, чтобы уверенно понять характер этой партии. При воздействии на закрытую бутылку воздуха настоятельно рекомендуется снимать показания ОВП и растворенного кислорода в течение 1 минуты после открытия. Измерения, не зависящие от кислорода (например, pH), можно проводить без необходимости после первоначального вскрытия. Привередливым анаэробным микроорганизмам для роста обычно требуются значения ОВП < -200 мВ. Если среда приводит к значению ОВП > -200 мВ и/или значениям растворенного кислорода >0,40 мг/л), для дальнейшего восстановления среды можно использоватьдополнительный Na2S (0,1-0,2 г/л) или другой восстановитель (например, цитрат титана, L-цистеин, аскорбиновая кислота).
Резазурин часто используется в качестве индикатора кислорода (как в этом протоколе); Однако более точно это окислительно-восстановительный показатель21, указывающий на присутствие кислорода косвенно, поскольку кислород изменяет окислительно-восстановительный потенциал раствора. Резазурин в растворе первоначально имеет синий цвет. При воздействии восстановителей раствор необратимо переходит в розовый цвет. При дальнейшем восстановлении раствор обратимо переходит в бесцветный цвет и возвращается в розовый цвет при окислении. Авторы наблюдали случаи, когда восстановленные среды, содержащие резазурин, переходили от синего к розовому, но не переходили к бесцветному. Тем не менее, авторы также заметили, что такие среды часто переходят в бесцветные после автоклавирования, и что увеличение времени, затрачиваемого на кипячение и промывку среды, обычно позволяет резазурину перейти в бесцветную форму после добавления восстановителей. При желании концентрацию кислорода в среде можно проверить с помощью датчика растворенного кислорода.
Все материалы, необходимые для работы этих биореакторов и самих стеклянных биореакторов, изготовленных на заказ, не превышали ~$5 тыс. (это при условии, что вспомогательное оборудование, такое как водяные бани, насосы и инкубаторы, уже доступно). Эти методы анаэробного культивирования экономически выгодны по сравнению с коммерческими автоматизированными биореакторами, стоимость которых может начинаться от >10 тысяч долларов. Кроме того, многие коммерческие биореакторы переходят на одноразовые реакторные контейнеры, что меняет динамику сравнения и не является экономически эффективным для небольших исследовательских лабораторий/университетов для постоянной замены. Кроме того, коммерческие системы могут иметь производственные химические предубеждения (из-за используемых пластмасс, смазки на прокладках/фитингах или химически обработанной воды), которые будут влиять на успех выращивания привередливых микроорганизмов. Низкая стоимость, настраиваемость и универсальность сбора анаэробной пробы окружающей среды в сочетании с информированной средой, которую можно инокулировать, что приводит к получению обогащений для исследования, значительно повышает шансы на получение уникальных микроорганизмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить преемственность информации и наставничества, которые влияли/развивали эти методы на протяжении многих лет. Доктор Гамильтон-Брем, как бывший аспирант, постдок и нынешний профессор, в долгу перед теми, кто нашел время для обучения анаэробным техникам: доктору Майку Адамсу, доктору Герти Шут, доктору Джиму Элкинсу, доктору Мирче Подару, доктору Дуэйну Мозеру и доктору Брайану Хедлунду. Организации Nature Conservancy и American Rivers поддержали эту работу грантами G21-026-CON-P и AR-CE21GOS373 соответственно. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этой статье, принадлежат авторам и не обязательно отражают точку зрения Nature Conservancy или American Rivers. Эта работа была поддержана грантом Института перспективной энергетики SIU, который с благодарностью признает финансирование, предоставленное через Совет по перспективным энергетическим ресурсам. NGS был выполнен компанией LC Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 1 L borosillicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 1 mL syringe with slip tip | Fisher Scientific | ||
| 10 mL glass pipette | Fisher Scientific | ||
| 100 mL culture bottle | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm hand crimper | Fisher Scientifc | ||
| 23 G needle | Fisher Scientifc | ||
| 500 mL borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| Aluminum seal | Fisher Scientifc | ||
| Cannula, 31.5 cm length | Fisher Scientific | ||
| Cannula, 6 cm length | Fisher Scientifc | ||
| Corer | Giddings Machine Company | Assembled from company parts | |
| Gas manifold | Swagelok | Assembled from many different parts | |
| Lighter | Lowe's | ||
| N2 gas | Airgas | ||
| Nitrile gloves | Fisher Scientific | ||
| Rubber stopper (for GL45 bottles) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Rubber stopper (for culture bottles) | Ace Glass | ||
| Stirring hot plate | Corning | ||
| Trace minerals | ATCC | ||
| Vitamins | ATCC | ||
| Bioreactor-specific Materials | |||
| #10 rubber stopper | Ace Glass | ||
| #7 rubber stopper | Fisher Scientifc | ||
| 1 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 1/4" hose barb ball valve | Amazon | ||
| 10 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 3.5 L borosilicate bottle | Fisher Scientific | ||
| 5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting | Amazon | ||
| 60 mL syringe with luer lock tip | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carboy | Allen Glass | ||
| Angled hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Custom made upon request | |
| Drill | Lowe's | ||
| Female luer lock adapter coupler | Amazon | ||
| GL14 open top cap | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 open top cap | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 open top cap | Ace Glass | ||
| PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap | Ace Glass | 7625-06 | |
| PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap | Ace Glass | 7625-07 | |
| Ring stand | Fisher Scientific | ||
| Ring stand chain clamp | Amazon | ||
| Ring stand clamp | Fisher Scientific | ||
| Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od | Grainger | 55YG13 | |
| Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od | Grainger | ||
| Straight hose connector for GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-22 | |
| Three-way stopcock | Amazon | ||
| Two-way stopcock | Amazon | ||
| Ultra low flow variable flow mini-pump | VWR | ||
| Water bath | Fisher Scientifc | ||
| White rubber septum for 13-18 mm od tubes | Ace Glass | 9096-49 | |
| Wire | Lowe's | ||
| Zip tie | Lowe's |
References
- Staley, J. T., Konopka, A. Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats. Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).
- Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes. MSystems. 3 (5), e00055 (2018).
- Rinke, C., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
- Marcy, Y., et al. Dissecting biological "dark matter" with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).
- Giovannoni, S., Stingl, U. The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age. Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).
- Stewart, E. J.
- Dedysh, S. N. Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps. Front. Microbiol. 2, 184 (2011).
- Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. Isolating" uncultivable" microorganisms in pure culture in a simulated natural environment. Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).
- Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics. mBio. 2 (2), e00012 (2011).
- Tyson, G. W., et al. Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community. Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).
- Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. Methanogens: Reevaluation of a unique biological group. Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).
- Merino, N., et al. Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow. Sci. Total Environ. 842, 156768 (2022).
- Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf (2013).
- Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf (2018).
- Mullin, S. W., et al. Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer. Front. Microbiol. 11, 536535 (2020).
- Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).
- Miller, T. L., Wolin, M. A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes. Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin. Front. Microbiol. 10, 2224 (2019).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).
- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S.
