使用二氢乙锓 （DHE） 荧光染料生成活性氧 （ROS） 的高通量筛选评估

Summary

该方案描述了一种使用二氢乙铵（DHE）作为荧光染料探针，使用高通量筛选方法定量细胞内活性氧（ROS）的新方法。该方案描述了三种不同肝细胞癌细胞系中细胞内活性氧（ROS）的定量评估方法。

Abstract

活性氧（ROS）在生理和病理过程中调节细胞代谢中起着关键作用。生理 ROS 的产生在正常细胞功能（如增殖、信号传导、细胞凋亡和衰老）的空间和时间调节中起着核心作用。相比之下，慢性 ROS 过量生产会导致多种疾病，例如癌症、心血管疾病和糖尿病等。因此，以准确和可重复的方式量化ROS水平对于了解正常的细胞功能至关重要。基于荧光成像的方法来表征细胞内 ROS 物种是一种常用的方法。文献中的许多成像 ROS 方案使用 2′-7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFH-DA） 染料。然而，这种染料在使用和可解释性方面存在重大局限性。目前的实验方案演示了使用二氢乙铓（DHE）荧光探针作为在高通量环境中量化ROS总产量的替代方法。高通量成像平台CX7 Cellomics用于测量和量化ROS的产生。这项研究是在三种肝细胞癌细胞系 HepG2、JHH4 和 HUH-7 中进行的。该协议深入描述了评估细胞内ROS所涉及的各种程序，包括- DHE溶液的制备，用DHE溶液孵育细胞以及表征ROS生产所需的DHE强度的测量。该方案表明，DHE荧光染料是一种稳健且可重复的选择，可以以高通量方式表征细胞内ROS的产生。用于测量 ROS 产生的高通量方法可能有助于各种研究，例如毒理学、药物筛选和癌症生物学。

Introduction

活性氧 （ROS） 是一组天然存在的、高反应性的、时间不稳定的化学自由基，是细胞正常细胞代谢的一部分。ROS 在调节细胞中发生的正常生理和生化过程中起着关键和必不可少的作用 ^1,2。细胞中ROS产生的主要来源是线粒体电子传递链（ETC）途径，作为正常生物能量循环的一部分。ROS产生的重要其他来源包括酶促反应，例如细胞中的细胞NADPH氧化酶。食物分子（例如葡萄糖）的代谢通过线粒体基质中的氧化磷酸化途径发生。ROS产生的基线水平对于调节正常的生理细胞信号传导过程至关重要。已知许多属于葡萄糖代谢信号通路的关键蛋白质分子（例如 Akt 和 PTEN）对细胞内 ROS 水平有反应。此外，ROS 由各种细胞内酶产生，例如黄嘌呤氧化酶、一氧化氮合酶和过氧化物酶体成分，作为细胞酶途径^{的一部分 1,2}。与活性氧的天然来源相比，某些环境因素，如外源性物质、传染性病原体、紫外线、污染、吸烟和辐射，也会导致活性氧的过量产生，而活性氧是细胞内氧化应激的关键驱动因素^1,3。细胞氧化应激升高可对细胞内的天然生物分子（如脂质、蛋白质和 DNA）造成损害，导致各种疾病，如癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性炎症和神经退行性疾病 ^1,3,4。因此，ROS的准确测量对于了解氧化应激诱导的疾病病理生理学所涉及的细胞机制至关重要。

由于细胞内 ROS 产生和消除的时间很短，因此对各种 ROS 自由基的定量测量仍然是一个挑战。电子顺磁共振 （EPR）⁵、高压液相色谱 （HPLC） 和基于荧光探针的成像等方法用于测量各种细胞 ROS⁶。虽然 EPR 和 HPLC 等方法可产生定量准确的估计，但这些方法涉及细胞空间形态的破坏，并且通常采用样品的全局和批量测量形式。相比之下，基于成像的方法（例如基于荧光探针的方法）保留了ROS生成的细胞形态和空间背景。然而，各种荧光探针对不同类型 ROS 自由基的特异性尚未得到充分证实 ^7,8。几种荧光探针，如二氢乙铵 （DHE）、二氯二氢荧光素二乙酸酯 （DCFH-DA）、二氢罗丹明 （DHR）、二甲基蒽 （DMA）、2,7 二氯二氢荧光素 （DCFH）、1,3-二苯基苯并呋喃 （DPBF） 和 MitoSox 可用于商业 ROS 检测。在过去的几十年中，DHE、MitoSox 和 DCFH-DA 是测量细胞和组织中 ROS 的常用荧光染料 ^8,9。DCFH-DA 是一种广泛使用的染料，用于检测细胞内 H、₂、O₂ 和氧化应激。尽管 DCFH-DA 很受欢迎，但之前的多项研究表明，它不能可靠地用于测量细胞内 H₂O₂ 和其他 ROS 水平^{8、9、10、11、12、13、14}。

相反，荧光探针二氢乙锾 （DHE） 显示出对细胞内超氧自由基 （O₂^–） 的特异性反应。虽然超氧自由基是在细胞中观察到的许多 ROS 物质之一，但它是一种重要的自由基，参与过渡金属的还原、转化为过氧硝酸盐和氢过氧化物的形成，以及其他细胞内效应。DHE迅速被细胞吸收，并在红色波长^范围15内具有荧光发射。在与超氧自由基发生特异性反应时，DHE形成红色荧光产物2-羟基乙锭（2-OH-E⁺）。因此，DHE可以被认为是用于超氧化物检测的特异性探针。然而，DHE也可以与ONOO^–或OH^.、H₂O 2和细胞色素c进行非特异性氧化_，形成第二种荧光产物乙锭E^+，其可以干扰测量的2-OH-E⁺水平。然而，当用 DHE 染色时，这些 2-OH E⁺ 和 E⁺ 产物组合在一起，代表了细胞内观察到的总细胞 ROS 物质的主要部分。E⁺ 插入 DNA，大大增强其荧光^{8、9、10、11、13、14、15、16}。由于乙锭和2-羟基乙锭的荧光光谱仅略有不同，因此可以使用DHE荧光产物检测和测量继发于超氧化物产生的细胞中观察到的大多数ROS水平。使用 480 nm 波长激发和 610 nm 波长发射 15,16,17 鉴定这些 ROS 物质。

除了选择特定的荧光ROS检测探针外，选择一种灵敏的检测方法来测量细胞内ROS也很重要。因此，准确评估细胞内 ROS 水平是识别患病细胞或暴露于各种环境应激源（如辐射、毒理化合物和遗传毒性物质）的细胞中发生的氧化还原平衡状态紊乱的关键¹⁸。由于 ROS 是细胞中常见的现象，负责调节各种细胞信号传导活动，因此可靠的 ROS 检测方法至关重要。为了能够对细胞内的ROS产生进行这种高通量评估，该协议使用高内涵筛选（HCS）平台来测量ROS种类。目前的方案允许对细胞内ROS的产生进行高通量分析，这在许多毒理学研究中至关重要¹⁹。该协议旨在提供一种简单且通用的解决方案来检测和测量贴壁性肝细胞癌细胞中的细胞内ROS。H₂O₂ 和甲萘醌的化学试剂用作有效的 ROS 刺激剂，以测量受控和高通量环境中 ROS 产生的相对水平。根据需要，可以对该方案进行微调，以在适当条件下测量贴壁和非贴壁细胞中ROS的产生。

Protocol

1. 细胞培养 将测试细胞（HepG2、HUH7 和 JHH4 肝细胞癌细胞）以 10,000 个细胞/孔的接种密度接种到 96 孔板中，最终接种体积为每孔 200 μL。在培养HepG 2细胞之前，在室温（RT）下用IV型胶原（50μg/ mL）涂覆96个板孔2小时。为避免原液凝固，将原液放入冰中，然后开始稀释过程至所需浓度。 孵育期2小时后，吸出多余的胶原蛋白，并用1x PBS洗涤孔三次。 <li…

Representative Results

二氢乙铵 （DHE） 是一种超氧化物响应荧光染料，可提供有关细胞内 ROS 状态的特定信息。DHE染料本质上在细胞质中发出蓝色荧光。然而，在与超氧自由基相互作用时，它被转化为 2-羟基乙鎓，其发出红色波长 （>550 nm） 的荧光（图 1）。DHE染料很容易转运到细胞和细胞核中。发射的荧光可以通过许多实验室中常见的荧光显微镜装置进行可视化。在本研究中，在高内涵筛选平?…

Discussion

在这项研究中，在高内涵筛选系统上建立了使用二氢乙锭 （DHE） 荧光染料评估超氧化物驱动的细胞内活性氧 （ROS） 产生的方案。文献中现有的大多数当前方案都使用DCFH-DA作为荧光成像探针来量化ROS物种。然而，多项研究表明，DCFH-DA并不是测量细胞内ROS的理想探针。DCFH-DA不适合作为探针的各种原因包括：（i）DCFH-DA不与H₂O₂发生直接反应，这使其成为评估细胞内H₂O_2</s…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625