ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いた活性酸素種(ROS)生成のハイスループットスクリーニング評価
Summary
このプロトコルはハイスループットのスクリーニングのアプローチを使用して蛍光性の染料の調査としてdihydroethidium (DHE)を使用して細胞内の活性酸素種(ROS)を量化する新しい方法を記述する。プロトコルは3つのhepatocellular癌腫のセルラインの細胞内の活性酸素種(ROS)の量的な査定のための方法を記述する。
Abstract
活性酸素種(ROS)は、生理学的および病理学的プロセスにおける細胞代謝の調節において重要な役割を果たします。生理学的ROS産生は、増殖、シグナル伝達、アポトーシス、老化などの正常な細胞機能の空間的および時間的調節において中心的な役割を果たします。対照的に、慢性的なROSの過剰産生は、がん、心血管疾患、糖尿病など、幅広い疾患の原因となっています。したがって、正確で再現性のある方法でROSレベルを定量化することは、正常な細胞機能を理解するために不可欠です。細胞内のROS種を特徴付けるための蛍光イメージングベースの方法は、一般的なアプローチです。文献のイメージングROSプロトコルの多くは、2′-7′-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)色素を使用しています。しかし、この染料は、その使用法と解釈可能性に大きな制限があります。現在のプロトコルでは、ハイスループット設定で総ROS産生を定量化するための代替方法として、ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光プローブの使用が実証されています。ハイスループットイメージングプラットフォームであるCX7 Cellomicsを使用して、ROS産生を測定および定量化しました。この研究は、HepG2、JHH4、およびHUH-7の3つの肝細胞がん細胞株で実施されました。このプロトコルはを含む細胞内のROSの評価にかかわるさまざまなプロシージャの詳細な記述を、含んでいる-DHEの解決の準備、DHEの解決が付いている細胞のインキュベーション、およびROSの生産を特徴付けるのに必要なDHEの強度の測定を提供する。このプロトコルは、DHE蛍光色素がハイスループット方式で細胞内ROS産生を特徴付けるための堅牢で再現性のある選択肢であることを示しています。ROS産生を測定するためのハイスループットアプローチは、毒物学、薬物スクリーニング、がん生物学など、さまざまな研究に役立つ可能性があります。
Introduction
活性酸素種(ROS)は、細胞内の正常な細胞代謝の一部として形成される、天然に存在する反応性が高く、時間的に不安定な化学ラジカルのグループです。ROSは、細胞で発生する正常な生理学的および生化学的プロセスの調節において重要かつ不可欠な役割を果たします1,2。細胞内のROS産生の主な原因は、正常な生体エネルギーサイクルの一部としてのミトコンドリア電子伝達鎖(ETC)経路からのものです。ROS産生の重要な追加源には、細胞内の細胞NADPHオキシダーゼなどの酵素反応が含まれます。食物分子(グルコースなど)の代謝は、ミトコンドリアマトリックスの酸化的リン酸化経路を介して起こります。ROS産生のベースラインレベルは、正常な生理学的細胞シグナル伝達プロセスを調節するために不可欠です。グルコース代謝シグナル伝達経路の一部である多くの重要なタンパク質分子(AktやPTENなど)は、細胞内のROSレベルに応答することが知られています。さらに、活性酸素は、キサンチンオキシダーゼ、一酸化窒素合成酵素、ペルオキシソーム成分などのさまざまな細胞内酵素によって、細胞酵素経路の一部として産生されます1,2。天然のROSの発生源とは対照的に、生体異物、感染性病原体、紫外線、汚染、喫煙、放射線などの特定の環境要因も、細胞内の酸化ストレスの主要な要因であるROSの過剰産生につながります1,3。細胞の酸化ストレスが高まると、脂質、タンパク質、DNAなどの細胞内の天然生体分子が損傷し、がん、糖尿病、心血管疾患、慢性炎症、神経変性疾患などのさまざまな疾患を引き起こす可能性があります1,3,4。したがって、酸化ストレス誘発性疾患の病態生理に関与する細胞メカニズムを理解するためには、ROSの正確な測定が不可欠です。
細胞内でのROSの産生と除去の時間スケールが短いため、さまざまなROSラジカルの定量測定は依然として課題です。電子常磁性共鳴(EPR)5、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)、蛍光プローブベースのイメージングなどの方法を使用して、さまざまな細胞ROS6を測定します。ESRやHPLCなどの方法では定量的に正確な推定値が得られますが、これらの方法は細胞の空間形態の破壊を伴い、通常はサンプルの全体的およびバルク測定の形式になります。対照的に、蛍光プローブベースの方法などのイメージングベースの方法では、ROS生成の細胞形態と空間的コンテキストが保持されます。しかし、異なる種類のROSラジカルに対する様々な蛍光プローブの特異性は十分に確立されていない7,8。ジヒドロエチジウム(DHE)、ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFH-DA)、ジヒドロロダミン(DHR)、ジメチルアントラセン(DMA)、2,7ジクロロジヒドロフルレセイン(DCFH)、1,3-ジフェニルイソベンゾフラン(DPBF)、MitoSoxなどの蛍光プローブが市販されています。過去数十年にわたり、DHE、MitoSox、およびDCFH-DAは、細胞および組織内のROSを測定するために一般的に使用されている蛍光色素です8,9。DCFH−DAは、細胞内のH2O2および酸化ストレスを検出するために広く使用されている色素である。DCFH−DAの人気にもかかわらず、複数の先行研究は、細胞内H2O2および他のROSレベル8,9,10,11,12,13,14を測定するために確実に使用することができないことを示している。
対照的に、蛍光プローブジヒドロエチジウム(DHE)は、細胞内スーパーオキシドラジカル(O2–)に対して特異的な応答を示します。スーパーオキシドラジカルは、細胞内で観察される多くの活性酸素種の1つですが、遷移金属の還元、ペルオキシ硝酸塩への変換、ヒドロペルオキシドの形成などの細胞内効果に関与する重要なラジカルです。DHEは細胞に素早く取り込まれ、赤色の波長範囲15で蛍光を発します。特にスーパーオキシドラジカルと反応すると、DHEは赤色蛍光生成物である2-ヒドロキシエチジウム(2-OH-E+)を形成します。したがって、DHEはスーパーオキシド検出のための特異的なプローブと見なすことができます。しかしながら、DHEは、ONOO-またはOH.、H2O2、およびシトクロムcによる非特異的酸化を受けて、第2の蛍光生成物であるエチジウムE+を形成することもでき、これは測定された2-OH-E+レベルに干渉する可能性があります。しかし、これらの2-OH E+およびE+産物は、DHEで染色されたときに細胞内で観察される全細胞ROS種の大部分を占めています。E +はDNAにインターカレートし、その蛍光性を大幅に増強します8,9,10,11,13,14,15,16。エチジウムと2-ヒドロキシエチジウムの蛍光スペクトルはわずかに異なるだけであるため、スーパーオキシド産生に続発する細胞に見られるROSレベルの大部分は、DHE蛍光製品を使用して検出および測定できます。これらのROS種は、480 nmの波長励起と610 nmの波長発光を用いて同定される15,16,17。
特定の蛍光ROS検出プローブを選択することに加えて、細胞内ROSを測定するための高感度検出方法を選択することが重要です。したがって、細胞内ROSレベルの正確な評価は、罹患細胞または放射線、毒性化合物、遺伝毒性物質などのさまざまな環境ストレス要因にさらされた細胞で発生する酸化還元平衡の乱れ状態を特定するための鍵となります18。ROSは細胞内でよく発生する現象であり、さまざまな細胞シグナル伝達活性の調節に関与するため、ROSの堅牢な検出法が不可欠です。細胞内のROS産生のこのようなハイスループット評価を可能にするために、このプロトコルではハイコンテントスクリーニング(HCS)プラットフォームを使用してROS種を測定します。現在のプロトコルは、多くの毒物学研究において決定的に重要な細胞内ROS産生のハイスループット分析を可能にします19。このプロトコルは付着したhepatocellular癌腫のセルの細胞内ROSを検出し、測定するために容易で、多目的な解決を提供することを向ける。H2O2 およびメナジオンの化学試薬は、制御された高スループット設定におけるROS産生の相対レベルを測定するための強力なROS刺激剤として使用される。このプロトコルは、必要に応じて、適切な条件下で接着細胞および非接着細胞のROS産生を測定するように微調整できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、ジヒドロエチジウム(DHE)蛍光色素を用いたスーパーオキシド駆動の細胞内活性酸素種(ROS)産生を評価するプロトコルをハイコンテントスクリーニングシステム上に確立しました。文献で入手可能な現在のプロトコルの大部分は、ROS種を定量するための蛍光イメージングプローブとしてDCFH-DAを使用しています。しかし、複数の研究により、DCFH-DAは細胞内ROSの測定に理想的なプロー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RKとRRGは、NIH NIGMS助成金P20 GM130422を通じて、UNM Center for Metals in Biology and Medicine(CMBM)からの助成金の支援を受けました。RRGは、NM-INSPIRES P30助成金1P30ES032755からのパイロット賞の支援を受けました。CX7 Cellomics装置のイメージング・コア・サポートは、NIHの助成金P20GM121176から資金提供を受けたAIMセンター・コアを通じて提供されました。シャリーナ・デサイ博士とリー・チェン博士には、CX7 Celomicsイメージング・プラットフォームの使用に関する技術的な問題について貴重なご支援をいただき、感謝いたします。
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
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