Vurdering af screening med høj kapacitet af generering af reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af dihydroethidium (DHE) fluorescensfarvestof
Summary
Denne protokol beskriver en ny metode til kvantificering af intracellulære reaktive iltarter (ROS) ved hjælp af dihydroethidium (DHE) som en fluorescensfarvestofsonde ved hjælp af en screeningsmetode med høj kapacitet. Protokollen beskriver metoderne til kvantitativ vurdering af intracellulære reaktive iltarter (ROS) i de tre forskellige hepatocellulære carcinomcellelinjer.
Abstract
Reaktive iltarter (ROS) spiller en central rolle i reguleringen af cellulær metabolisme i fysiologiske og patologiske processer. Fysiologisk ROS-produktion spiller en central rolle i den rumlige og tidsmæssige modulering af normale cellulære funktioner såsom proliferation, signalering, apoptose og ældning. I modsætning hertil er kronisk ROS-overproduktion ansvarlig for et bredt spektrum af sygdomme, såsom kræft, hjerte-kar-sygdomme og diabetes, blandt andre. Kvantificering af ROS-niveauer på en nøjagtig og reproducerbar måde er således afgørende for at forstå normal cellulær funktionalitet. Fluorescensbilleddannelsesbaserede metoder til karakterisering af intracellulære ROS-arter er en almindelig tilgang. Mange af billeddannelsesprotokollerne i litteraturen bruger 2′-7′-dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA) farvestof. Dette farvestof lider imidlertid af betydelige begrænsninger i dets anvendelse og fortolkningsevne. Den nuværende protokol demonstrerer brugen af en dihydroethidium (DHE) fluorescerende sonde som en alternativ metode til at kvantificere den samlede ROS-produktion i en høj gennemstrømningsindstilling. Den billeddannende platform med høj kapacitet, CX7 Cellomics, blev brugt til at måle og kvantificere ROS-produktionen. Denne undersøgelse blev udført i tre hepatocellulære kræftcellelinjer – HepG2, JHH4 og HUH-7. Denne protokol giver en dybtgående beskrivelse af de forskellige procedurer, der er involveret i vurderingen af ROS i cellerne, herunder – forberedelse af DHE-opløsning, inkubation af celler med DHE-opløsning og måling af DHE-intensitet, der er nødvendig for at karakterisere ROS-produktionen. Denne protokol viser, at DHE fluorescerende farvestof er et robust og reproducerbart valg til at karakterisere intracellulær ROS-produktion på en høj gennemstrømningsmåde. Metoder med høj kapacitet til måling af ROS-produktion vil sandsynligvis være nyttige i en række undersøgelser, såsom toksikologi, lægemiddelscreening og kræftbiologi.
Introduction
Reaktive iltarter (ROS) er en gruppe af naturligt forekommende, meget reaktive og tidsmæssigt ustabile kemiske radikaler dannet som en del af den normale cellulære metabolisme i celler. ROS spiller en central og væsentlig rolle i moduleringen af normale fysiologiske og biokemiske processer, der forekommer i cellerne 1,2. Den vigtigste kilde til ROS-produktion i celler er fra mitokondrieelektrontransportkæden (ETC) vej som en del af den normale bioenergetiske cyklus. Væsentlige yderligere kilder til ROS-produktion omfatter enzymatiske reaktioner såsom cellulære NADPH-oxidaser i celler. Metabolisme af fødevaremolekyler (fx glucose) sker via den oxidative phosphoryleringsvej i mitokondriematrixen. Et basisniveau for ROS-produktion er afgørende for at regulere normale fysiologiske cellesignalprocesser. Mange vigtige proteinmolekyler, der er en del af de glukosemetaboliske signalveje (fx Akt og PTEN), er kendt for at reagere på intracellulære ROS-niveauer. Derudover produceres ROS af forskellige intracellulære enzymer, såsom xanthinoxidase, nitrogenoxidsyntase og peroxisomale bestanddele som en del af de cellulære enzymatiske veje 1,2. I modsætning til de naturlige kilder til ROS fører visse miljøfaktorer, såsom xenobiotika, infektiøse stoffer, UV-lys, forurening, cigaretrygning og stråling, også til overdreven produktion af ROS, som er en vigtig drivkraft for intracellulær oxidativ stress 1,3. Forhøjet cellulær oxidativ stress kan forårsage skade på indfødte biomolekyler inde i en celle, såsom lipider, proteiner og DNA, hvilket forårsager forskellige sygdomme som kræft, diabetes, hjerte-kar-sygdomme, kronisk inflammation og neurodegenerative lidelser 1,3,4. Derfor er nøjagtige målinger af ROS afgørende for at forstå de cellulære mekanismer, der er involveret i oxidativ stressinduceret sygdomspatofysiologi.
På grund af de korte tidshorisonter for ROS-produktion og eliminering inde i celler er kvantitative målinger af forskellige ROS-radikaler fortsat en udfordring. Metoder som elektron paramagnetisk resonans (EPR)5, højtryksvæskekromatografi (HPLC) og fluorescenssondebaseret billeddannelse anvendes til at måle de forskellige cellulære ROS6. Mens metoder som EPR og HPLC giver kvantitativt nøjagtige estimater, involverer disse metoder ødelæggelse af den cellulære rumlige morfologi og er normalt i form af globale målinger og bulkmålinger af en prøve. I modsætning hertil bevarer billeddannelsesbaserede metoder såsom fluorescenssondebaserede metoder den cellulære morfologi og rumlige kontekst af ROS-generationen. Imidlertid er specificiteten af forskellige fluorescensprober for forskellige typer ROS-radikaler ikke veletableret 7,8. Flere fluorescerende sonder såsom dihydroethidium (DHE), dichlordihydrofluorescein diacetat (DCFH-DA), dihydrorhodamin (DHR), dimethylanthracen (DMA), 2,7 dichlordihydroflurescein (DCFH), 1,3-Diphenylisobenzofuran (DPBF) og MitoSox er tilgængelige til ROS-påvisning kommercielt. I de sidste årtier er DHE, MitoSox og DCFH-DA de almindeligt anvendte fluorescerende farvestoffer til måling af ROS i celler og væv 8,9. DCFH-DA er et meget anvendt farvestof til påvisning af intracellulærH2O2og oxidativ stress. På trods af populariteten af DCFH-DA har flere tidligere undersøgelser vist, at det ikke pålideligt kan bruges til at måle intracellulærH2O2og andre ROS-niveauer 8,9,10,11,12,13,14.
I modsætning hertil viser den fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) et specifikt svar på det intracellulære superoxidradikal (O2–). Mens superoxidradikalet er en af mange af de ROS-arter, der observeres i celler, er det et vigtigt radikal involveret i reduktionen af overgangsmetaller, omdannelse til peroxynitrat og dannelse af hydroperoxider, blandt andre intracellulære virkninger. DHE optages hurtigt af cellerne og har en fluorescensemission i det røde bølgelængdeområde15. Ved reaktion med superoxidradikal specifikt danner DHE et rødt fluorescerende produkt, 2-hydroxyethidium (2-OH-E +). Således, DHE kan betragtes som en specifik sonde for superoxid detektion. DHE kan dog også gennemgå uspecifik oxidation med ONOO– eller OH.,H2O2og cytokrom c for at danne et andet fluorescensprodukt, ethidium E +, som kan forstyrre de målte 2-OH-E + niveauer. Imidlertid repræsenterer disse 2-OH E + og E + produkter i kombination en stor del af de samlede cellulære ROS-arter, der observeres inde i en celle, når de farves med DHE. E + interkalerer i DNA, hvilket i høj grad forbedrer dets fluorescens 8,9,10,11,13,14,15,16. Da fluorescensspektrene for ethidium og 2-hydroxyethidium kun adskiller sig lidt, kan størstedelen af ROS-niveauer, der ses i en celle sekundært til superoxidproduktion, detekteres og måles ved hjælp af DHE-fluorescensprodukter. Disse ROS-arter identificeres ved hjælp af 480 nm bølgelængdeexcitation og 610 nm bølgelængdeemission 15,16,17.
Ud over at vælge en specifik fluorescerende ROS-detektionssonde er det vigtigt at vælge en følsom detektionsmetode til måling af intracellulær ROS. Nøjagtig vurdering af intracellulære ROS-niveauer er således nøglen til at identificere forstyrrede redoxbalancetilstande, der forekommer i syge celler eller celler, der har været udsat for forskellige miljømæssige stressfaktorer såsom stråling, toksikologiske forbindelser og genotoksiske stoffer18. Da ROS er et almindeligt forekommende fænomen i celler, der er ansvarlig for at regulere en række cellesignalaktiviteter, er robuste metoder til påvisning af ROS afgørende. For at muliggøre en sådan evaluering med høj kapacitet af ROS-produktion i celler bruger denne protokol en HCS-platform (high-content screening) til at måle ROS-arterne. Den nuværende protokol tillader analyse med høj kapacitet af intracellulær ROS-produktion, hvilket er af afgørende betydning i mange toksikologiundersøgelser19. Denne protokol har til formål at give en nem og alsidig løsning til at detektere og måle intracellulær ROS i klæbende hepatocellulære carcinomceller. De kemiske reagenser afH2O2og menadion anvendes som potente ROS-stimulatorer til at måle de relative niveauer af ROS-produktion i en kontrolleret og høj gennemstrømningsindstilling. Denne protokol kan finjusteres til at måle ROS-produktionen i vedhængende og ikke-fasthængende celler under passende betingelser, hvis det er nødvendigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne undersøgelse blev der etableret en protokol til vurdering af superoxiddrevet intracellulær reaktive iltarter (ROS) produktion ved hjælp af dihydroethidium (DHE) fluorescensfarvestof på et screeningssystem med højt indhold. Et flertal af de nuværende protokoller, der er tilgængelige i litteraturen, bruger DCFH-DA som en fluorescensbilleddannelsessonde til at kvantificere ROS-arter. Flere undersøgelser har imidlertid vist, at DCFH-DA ikke er en ideel sonde til måling af intracellulær ROS. Forskellige grun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RK og RRG blev støttet af et tilskud fra UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) gennem NIH NIGMS bevilling P20 GM130422. RRG blev støttet af en pilotpris fra NM-INSPIRES P30 bevillingen 1P30ES032755. Den billeddannende kernestøtte til CX7 Cellomics-instrumentet blev leveret gennem AIM-centerkernerne finansieret af NIH-tilskud P20GM121176. Vi vil gerne takke Dr. Sharina Desai og Dr. Li Chen for deres uvurderlige hjælp med tekniske problemer i forbindelse med brugen af CX7 Cellomics billedbehandlingsplatform.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
