Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)

Summary

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires en utilisant le dihydroéthidium (DHE) comme sonde de colorant de fluorescence en utilisant une approche de criblage à haut débit. Le protocole décrit les méthodes d’évaluation quantitative des espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires dans les trois lignées cellulaires différentes de carcinome hépatocellulaire.

Abstract

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle clé dans la régulation du métabolisme cellulaire dans les processus physiologiques et pathologiques. La production physiologique de ROS joue un rôle central dans la modulation spatiale et temporelle des fonctions cellulaires normales telles que la prolifération, la signalisation, l’apoptose et la sénescence. En revanche, la surproduction chronique de ROS est responsable d’un large éventail de maladies, telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et le diabète, entre autres. La quantification des niveaux de ROS de manière précise et reproductible est donc essentielle pour comprendre la fonctionnalité cellulaire normale. Les méthodes basées sur l’imagerie de fluorescence pour caractériser les espèces de ROS intracellulaires sont une approche courante. De nombreux protocoles ROS d’imagerie dans la littérature utilisent un colorant au diacétate de 2′-7′-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA). Cependant, ce colorant souffre de limitations importantes dans son utilisation et son interprétabilité. Le protocole actuel démontre l’utilisation d’une sonde fluorescente au dihydroéthidium (DHE) comme méthode alternative pour quantifier la production totale de ROS dans un environnement à haut débit. La plate-forme d’imagerie à haut débit, CX7 Cellomics, a été utilisée pour mesurer et quantifier la production de ROS. Cette étude a été menée sur trois lignées cellulaires de cancer hépatocellulaire – HepG2, JHH4 et HUH-7. Ce protocole fournit une description détaillée des différentes procédures impliquées dans l’évaluation des ROS dans les cellules, y compris la préparation de la solution de DHE, l’incubation des cellules avec une solution de DHE et la mesure de l’intensité de la DHE nécessaire pour caractériser la production de ROS. Ce protocole démontre que le colorant fluorescent DHE est un choix robuste et reproductible pour caractériser la production de ROS intracellulaires à haut débit. Les approches à haut débit pour mesurer la production de ROS sont susceptibles d’être utiles dans diverses études, telles que la toxicologie, le dépistage de médicaments et la biologie du cancer.

Introduction

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont un groupe de radicaux chimiques naturels, hautement réactifs et instables dans le temps, formés dans le cadre du métabolisme cellulaire normal dans les cellules. Les ROS jouent un rôle clé et essentiel dans la modulation des processus physiologiques et biochimiques normaux qui se produisent dans les cellules ^1,2. La principale source de production de ROS dans les cellules provient de la chaîne de transport d’électrons mitochondriale (CTE) dans le cadre du cycle bioénergétique normal. Les réactions enzymatiques telles que les NADPH oxydases cellulaires dans les cellules constituent d’autres sources importantes de production de ROS. Le métabolisme des molécules alimentaires (par exemple, le glucose) se produit via la voie de phosphorylation oxydative dans la matrice mitochondriale. Un niveau de base de production de ROS est essentiel pour réguler les processus physiologiques normaux de signalisation cellulaire. De nombreuses molécules protéiques clés qui font partie des voies de signalisation métabolique du glucose (par exemple, Akt et PTEN) sont connues pour répondre aux niveaux de ROS intracellulaires. De plus, les ROS sont produits par diverses enzymes intracellulaires telles que la xanthine oxydase, l’oxyde nitrique synthase et les constituants peroxysomaux dans le cadre des voies enzymatiques cellulaires ^1,2. Contrairement aux sources naturelles de ROS, certains facteurs environnementaux, tels que les xénobiotiques, les agents infectieux, les rayons UV, la pollution, le tabagisme et les radiations, entraînent également une production excessive de ROS, qui sont un facteur clé du stress oxydatif intracellulaire ^1,3. Un stress oxydatif cellulaire élevé peut endommager les biomolécules natives à l’intérieur d’une cellule, telles que les lipides, les protéines et l’ADN, provoquant diverses maladies telles que le cancer, le diabète, les maladies cardiovasculaires, l’inflammation chronique et les troubles neurodégénératifs ^1,3,4. Par conséquent, des mesures précises des ROS sont essentielles pour comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans la physiopathologie des maladies induites par le stress oxydatif.

En raison des courtes échelles de temps de production et d’élimination des ROS à l’intérieur des cellules, les mesures quantitatives de divers radicaux ROS restent un défi. Des méthodes telles que la résonance paramagnétique électronique (EPR)⁵, la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et l’imagerie par sonde de fluorescence sont utilisées pour mesurer les différents ROS cellulaires⁶. Bien que des méthodes telles que l’EPR et la HPLC donnent des estimations quantitativement précises, ces méthodes impliquent la destruction de la morphologie spatiale cellulaire et se présentent généralement sous la forme de mesures globales et globales d’un échantillon. En revanche, les méthodes basées sur l’imagerie telles que les méthodes basées sur des sondes de fluorescence conservent la morphologie cellulaire et le contexte spatial de la génération de ROS. Cependant, la spécificité de diverses sondes de fluorescence pour différents types de radicaux ROS n’a pas été bien établie ^7,8. Plusieurs sondes fluorescentes telles que le dihydroéthidium (DHE), le diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA), la dihydrorhodamine (DHR), le diméthylanthracène (DMA), la 2,7 dichlorodihydroflurescéine (DCFH), le 1,3-diphénylisobenzofurane (DPBF) et MitoSox sont disponibles dans le commerce pour la détection des ROS. Au cours des dernières décennies, DHE, MitoSox et DCFH-DA sont les colorants fluorescents couramment utilisés pour mesurer les ROS dans les cellules et les tissus ^8,9. DCFH-DA est un colorant largement utilisé pour détecter le H₂O₂ intracellulaire et le stress oxydatif. Malgré la popularité du DCFH-DA, de nombreuses études antérieures ont montré qu’il ne peut pas être utilisé de manière fiable pour mesurer les niveaux intracellulaires de H₂O₂ et d’autres niveaux de ROS 8,9,10,11,12,13,14.

En revanche, la sonde fluorescente dihydroéthidium (DHE) montre une réponse spécifique au radical superoxyde intracellulaire (O₂^–). Bien que le radical superoxyde soit l’une des nombreuses espèces de ROS observées dans les cellules, c’est un radical important impliqué dans la réduction des métaux de transition, la conversion en peroxynitrate et la formation d’hydroperoxydes, entre autres effets intracellulaires. La DHE est rapidement absorbée par les cellules et a une émission de fluorescence dans la gamme de longueurs d’onde rouges¹⁵. En réagissant spécifiquement avec le radical superoxyde, la DHE forme un produit fluorescent rouge, le 2-hydroxy éthidium (2-OH-E⁺). Ainsi, la DHE peut être considérée comme une sonde spécifique pour la détection des superoxydes. Cependant, la DHE peut également subir une oxydation non spécifique avec ^ONOO- ou OH^., H₂O₂ et cytochrome c pour former un deuxième produit de fluorescence, l’éthidium E^+, qui peut interférer avec les niveaux mesurés de 2-OH-E⁺. Cependant, ces produits 2-OH E⁺ et E⁺, en combinaison, représentent une partie importante des espèces de ROS cellulaires totales observées à l’intérieur d’une cellule lorsqu’elles sont colorées à la DHE. E⁺ s’intercale dans l’ADN, améliorant considérablement sa fluorescence 8,9,10,11,13,14,15,16. Étant donné que les spectres de fluorescence de l’éthidium et du 2-hydroxy éthidium ne diffèrent que légèrement, la majorité des niveaux de ROS observés dans une cellule secondaire à la production de superoxyde peuvent être détectés et mesurés à l’aide de produits de fluorescence DHE. Ces espèces de ROS sont identifiées à l’aide d’une excitation de longueur d’onde de 480 nm et d’une émission de longueur d’onde de 610 nm 15,16,17.

En plus de choisir une sonde de détection de ROS fluorescente spécifique, il est important de choisir une méthode de détection sensible pour mesurer les ROS intracellulaires. Une évaluation précise des niveaux de ROS intracellulaires est donc essentielle pour identifier les états d’équilibre redox perturbés qui se produisent dans les cellules malades ou les cellules qui ont été exposées à divers facteurs de stress environnementaux tels que les radiations, les composés toxicologiques et les agents génotoxiques¹⁸. Étant donné que les ROS sont un phénomène courant dans les cellules qui est responsable de la régulation d’une variété d’activités de signalisation cellulaire, des méthodes robustes de détection des ROS sont essentielles. Pour permettre une telle évaluation à haut débit de la production de ROS dans les cellules, ce protocole utilise une plateforme de criblage à haut contenu (HCS) pour mesurer les espèces de ROS. Le protocole actuel permet l’analyse à haut débit de la production intracellulaire de ROS, ce qui est d’une importance cruciale dans de nombreuses études toxicologiques¹⁹. Ce protocole vise à fournir une solution simple et polyvalente pour détecter et mesurer les ROS intracellulaires dans les cellules de carcinome hépatocellulaire adhérent. Les réactifs chimiques de_H2,_O2 et de ménadione sont utilisés comme puissants stimulateurs de ROS pour mesurer les niveaux relatifs de production de ROS dans un environnement contrôlé et à haut débit. Ce protocole peut être affiné pour mesurer la production de ROS dans les cellules adhérentes et non adhérentes dans des conditions appropriées, si nécessaire.

Protocol

1. Culture cellulaire Ensemencer les cellules d’essai (cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2, HUH7 et JHH4) dans une plaque de 96 puits à une densité d’ensemencement de 10 000 cellules/puits dans un volume d’ensemencement final de 200 μL par puits.Avant de cultiver les cellules HepG2, enduire les 96 puits de plaques de collagène de type IV (50 μg/mL) pendant 2 h à température ambiante (RT). Pour éviter la solidification du collagène stock, placez la solution mère…

Representative Results

Le dihydroéthidium (DHE) est un colorant de fluorescence sensible aux superoxydes qui fournit des informations spécifiques sur les états des ROS intracellulaires. Le colorant DHE émet intrinsèquement une fluorescence bleue dans le cytoplasme. Cependant, lors de l’interaction avec les radicaux superoxydes, il se transforme en 2-hydroxyéthidium, qui émet une fluorescence dans les longueurs d’onde rouges (>550 nm) (Figure 1). Le colorant DHE est facilement transporté dans les cellul…

Discussion

Dans cette étude, un protocole permettant d’évaluer la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires induites par les superoxydes à l’aide d’un colorant de fluorescence dihydroéthidium (DHE) a été établi sur un système de criblage à haut contenu. La majorité des protocoles actuels disponibles dans la littérature utilisent le DCFH-DA comme sonde d’imagerie de fluorescence pour quantifier les espèces de ROS. Cependant, de nombreuses études ont montré que le DCFH-DA n’est …

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625