डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) प्रतिदीप्ति डाई का उपयोग करके प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) पीढ़ी का उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग आकलन
Summary
यह प्रोटोकॉल एक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग दृष्टिकोण का उपयोग करके प्रतिदीप्ति डाई जांच के रूप में डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) को निर्धारित करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा सेल लाइनों में इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के मात्रात्मक मूल्यांकन के तरीकों का वर्णन करता है।
Abstract
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं में सेलुलर चयापचय के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। शारीरिक आरओएस उत्पादन सामान्य सेलुलर कार्यों जैसे प्रसार, सिग्नलिंग, एपोप्टोसिस और जीर्णता के स्थानिक और लौकिक मॉड्यूलेशन में एक केंद्रीय भूमिका निभाता है। इसके विपरीत, क्रोनिक आरओएस ओवरप्रोडक्शन कैंसर, हृदय रोग और मधुमेह जैसी बीमारियों के व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए जिम्मेदार है। एक सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से आरओएस के स्तर की मात्रा निर्धारित करना इस प्रकार सामान्य सेलुलर कार्यक्षमता को समझने के लिए आवश्यक है। इंट्रा-सेलुलर आरओएस प्रजातियों को चिह्नित करने के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग-आधारित तरीके एक सामान्य दृष्टिकोण है। साहित्य में इमेजिंग आरओएस प्रोटोकॉल में से कई 2′-7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) डाई का उपयोग करते हैं। हालांकि, यह डाई इसके उपयोग और व्याख्या में महत्वपूर्ण सीमाओं से ग्रस्त है। वर्तमान प्रोटोकॉल एक उच्च थ्रूपुट सेटिंग में कुल आरओएस उत्पादन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में एक डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) फ्लोरोसेंट जांच के उपयोग को दर्शाता है। उच्च थ्रूपुट इमेजिंग प्लेटफॉर्म, सीएक्स 7 सेलोमिक्स, का उपयोग आरओएस उत्पादन को मापने और मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था। यह अध्ययन तीन हेपेटोसेलुलर कैंसर सेल लाइनों – हेपजी 2, जेएचएच 4 और एचयूएच -7 में आयोजित किया गया था। यह प्रोटोकॉल कोशिकाओं के भीतर आरओएस के मूल्यांकन में शामिल विभिन्न प्रक्रियाओं का गहन विवरण प्रदान करता है, जिसमें शामिल हैं – डीएचई समाधान की तैयारी, डीएचई समाधान के साथ कोशिकाओं का इनक्यूबेशन, और आरओएस उत्पादन को चिह्नित करने के लिए आवश्यक डीएचई तीव्रता का माप। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि डीएचई फ्लोरोसेंट डाई एक उच्च-थ्रूपुट तरीके से इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन को चिह्नित करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विकल्प है। आरओएस उत्पादन को मापने के लिए उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोण विभिन्न प्रकार के अध्ययनों में सहायक होने की संभावना है, जैसे कि विष विज्ञान, दवा स्क्रीनिंग और कैंसर जीव विज्ञान।
Introduction
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) कोशिकाओं में सामान्य सेलुलर चयापचय के एक भाग के रूप में गठित स्वाभाविक रूप से होने वाली, अत्यधिक प्रतिक्रियाशील और अस्थायी रूप से अस्थिर रासायनिक कणों का एक समूह है। आरओएस कोशिकाओं 1,2 में होने वाली सामान्य शारीरिक और जैव रासायनिक प्रक्रियाओं के मॉडुलन में एक महत्वपूर्ण और आवश्यक भूमिका निभाता है. कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन का मुख्य स्रोत सामान्य बायोएनेरजेटिक चक्र के एक भाग के रूप में माइटोकॉन्ड्रियल इलेक्ट्रॉन ट्रांसपोर्ट चेन (ईटीसी) मार्ग से है। आरओएस उत्पादन के महत्वपूर्ण अतिरिक्त स्रोतों में कोशिकाओं में सेलुलर एनएडीपीएच ऑक्सीडेस जैसे एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाएं शामिल हैं। खाद्य अणुओं (जैसे, ग्लूकोज) का चयापचय माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स में ऑक्सीडेटिव फास्फारिलीकरण मार्ग के माध्यम से होता है। सामान्य शारीरिक सेल सिग्नलिंग प्रक्रियाओं को विनियमित करने के लिए आरओएस उत्पादन का आधारभूत स्तर आवश्यक है। कई प्रमुख प्रोटीन अणु जो ग्लूकोज चयापचय सिग्नलिंग मार्ग (जैसे, एटीटी और पीटीईएन) का हिस्सा हैं, इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों का जवाब देने के लिए जाने जाते हैं। इसके अतिरिक्त, आरओएस सेलुलर एंजाइमी एंजाइमों जैसे ज़ैंथिन ऑक्सीडेज, नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ और पेरोक्सिसोमल घटकों द्वारा सेलुलर एंजाइमी मार्ग 1,2 के एक भाग के रूप में निर्मित होते हैं। आरओएस के प्राकृतिक स्रोतों के विपरीत, कुछ पर्यावरणीय कारक, जैसे कि ज़ेनोबायोटिक्स, संक्रामक एजेंट, यूवी प्रकाश, प्रदूषण, सिगरेट धूम्रपान, और विकिरण, आरओएस के अत्यधिक उत्पादन का कारण बनते हैं, जो इंट्रा-सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव 1,3 का एक प्रमुख चालक हैं। ऊंचा सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव ऐसे लिपिड, प्रोटीन, और डीएनए के रूप में एक सेल के अंदर देशी biomolecules को नुकसान हो सकता है, कैंसर, मधुमेह, हृदय रोग, पुरानी सूजन, और neurodegenerative विकारों 1,3,4 के रूप में विभिन्न रोगों के कारण. इसलिए, ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित रोग पैथोफिज़ियोलॉजी में शामिल सेलुलर तंत्र को समझने के लिए आरओएस का सटीक माप आवश्यक है।
आरओएस उत्पादन और कोशिकाओं के अंदर उन्मूलन के कम समय के कारण, विभिन्न आरओएस रेडिकल की मात्रात्मक माप एक चुनौती बनी हुई है। इलेक्ट्रॉन पैरामैग्नेटिक रेजोनेंस (ईपीआर)5, हाई-प्रेशर लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी), और फ्लोरेसेंस प्रोब-आधारित इमेजिंग जैसे तरीकों का उपयोग विभिन्न सेलुलर आरओएस6को मापने के लिए किया जाता है। जबकि ईपीआर और एचपीएलसी जैसे तरीके मात्रात्मक रूप से सटीक अनुमान देते हैं, इन विधियों में सेलुलर स्थानिक आकृति विज्ञान का विनाश शामिल है और आमतौर पर एक नमूने के वैश्विक और थोक माप के रूप में होते हैं। इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति जांच-आधारित विधियों जैसे इमेजिंग-आधारित विधियां सेलुलर आकृति विज्ञान और आरओएस पीढ़ी के स्थानिक संदर्भ को बनाए रखती हैं। हालांकि, आरओएस कट्टरपंथियों के विभिन्न प्रकार के लिए विभिन्न प्रतिदीप्ति जांच की विशिष्टता अच्छी तरह से 7,8 स्थापित नहीं किया गया है. डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई), डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए), डायहाइड्रोरोडामाइन (डीएचआर), डाइमिथाइल एन्थ्रेसीन (डीएमए), 2,7 डाइक्लोरोडिहाइड्रोफ्लोरेसिन (डीसीएफएच), 1,3-डिफेनिलिसोबेंजोफुरन (डीपीबीएफ), और मिटोसॉक्स जैसे कई फ्लोरोसेंट जांच व्यावसायिक रूप से आरओएस का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं। पिछले दशकों में, डीएचई, मिटोसॉक्स और डीसीएफएच-डीए कोशिकाओं और ऊतकों 8,9में आरओएस को मापने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले फ्लोरोसेंट रंजक हैं। डीसीएफएच-डीए इंट्रासेल्युलर एच2ओ2 और ऑक्सीडेटिव तनाव का पता लगाने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली डाई है। डीसीएफएच-डीए की लोकप्रियता के बावजूद, पिछले कई अध्ययनों से पता चला है कि इसका उपयोग इंट्रासेल्युलरएच 2ओ2 और अन्य आरओएस स्तरों 8,9,10,11,12,13,14को मापने के लिए मज़बूती से नहीं किया जा सकता है।
इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट जांच डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) इंट्रा-सेलुलर सुपरऑक्साइड रेडिकल (ओ2–) के लिए एक विशिष्ट प्रतिक्रिया दिखाती है। जबकि सुपरऑक्साइड रेडिकल कोशिकाओं में देखी जाने वाली कई आरओएस प्रजातियों में से एक है, यह अन्य इंट्रासेल्युलर प्रभावों के बीच संक्रमण धातुओं की कमी, पेरोक्सीनाइट्रेट में रूपांतरण और हाइड्रोपरॉक्साइड के गठन में शामिल एक महत्वपूर्ण कट्टरपंथी है। डीएचई जल्दी से कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है और लाल तरंग दैर्ध्य रेंज15 में एक प्रतिदीप्ति उत्सर्जन है. विशेष रूप से सुपरऑक्साइड रेडिकल के साथ प्रतिक्रिया करने पर, डीएचई एक लाल फ्लोरोसेंट उत्पाद, 2-हाइड्रॉक्सी एथिडियम (2-ओएच-ई +) बनाता है। इस प्रकार, डीएचई को सुपरऑक्साइड का पता लगाने के लिए एक विशिष्ट जांच के रूप में माना जा सकता है। हालांकि, डीएचई ओएनओओ– या ओएच, एच2ओ2, और साइटोक्रोम सी के साथ एक दूसरे प्रतिदीप्ति उत्पाद, एथिडियम ई + बनाने के लिए गैर-विशिष्ट ऑक्सीकरण से भी गुजर सकता है, जो मापा 2-ओएच-ई + स्तरों में हस्तक्षेप कर सकता है। हालांकि, ये 2-ओएच ई + और ई + उत्पाद, संयोजन में, डीएचई के साथ दाग होने पर सेल के अंदर देखी गई कुल सेलुलर आरओएस प्रजातियों के एक प्रमुख हिस्से का प्रतिनिधित्व करते हैं। ई + डीएनए में intercalates, बहुत इसकी प्रतिदीप्ति 8,9,10,11,13,14,15,16 बढ़ाने. चूंकि एथिडियम और 2-हाइड्रॉक्सी एथिडियम के प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा केवल थोड़ा भिन्न होते हैं, इसलिए सुपरऑक्साइड उत्पादन के लिए सेल माध्यमिक में देखे गए आरओएस स्तरों के बहुमत का पता लगाया जा सकता है और डीएचई प्रतिदीप्ति उत्पादों का उपयोग करके मापा जा सकता है। इन आरओएस प्रजातियों की पहचान 480 एनएम तरंग दैर्ध्य उत्तेजना और 610 एनएम तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन 15,16,17का उपयोग करके की जाती है।
एक विशिष्ट फ्लोरोसेंट आरओएस डिटेक्शन जांच चुनने के अलावा, इंट्रासेल्युलर आरओएस को मापने के लिए पता लगाने की एक संवेदनशील विधि चुनना महत्वपूर्ण है। इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तरों का सटीक मूल्यांकन इस प्रकार रोगग्रस्त कोशिकाओं या कोशिकाओं में होने वाली परेशान रेडॉक्स संतुलन राज्यों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है जो विकिरण, विषैले यौगिकों और जीनोटॉक्सिक एजेंटों जैसे विभिन्न पर्यावरणीय तनावों के संपर्क मेंहैं18. चूंकि आरओएस कोशिकाओं में आमतौर पर होने वाली घटना है जो विभिन्न प्रकार की सेल सिग्नलिंग गतिविधियों को विनियमित करने के लिए जिम्मेदार है, आरओएस का पता लगाने के मजबूत तरीके आवश्यक हैं। कोशिकाओं के भीतर आरओएस उत्पादन के इस तरह के उच्च-थ्रूपुट मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए, यह प्रोटोकॉल आरओएस प्रजातियों को मापने के लिए एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) मंच का उपयोग करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल इंट्रासेल्युलर आरओएस उत्पादन के उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण की अनुमति देता है, जो कई विष विज्ञानअध्ययनों19में महत्वपूर्ण महत्व का है। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य पक्षपाती हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर आरओएस का पता लगाने और मापने के लिए एक आसान और बहुमुखी समाधान प्रदान करना है। एच2ओ2 और मेनाडियोन के रासायनिक अभिकर्मकों को नियंत्रित और उच्च थ्रूपुट सेटिंग में आरओएस उत्पादन के सापेक्ष स्तर को मापने के लिए शक्तिशाली आरओएस उत्तेजक के रूप में उपयोग किया जाता है। इस प्रोटोकॉल को आवश्यकतानुसार उपयुक्त परिस्थितियों में पक्षपाती और गैर-पक्षपाती कोशिकाओं में आरओएस उत्पादन को मापने के लिए ठीक किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, डायहाइड्रोएथिडियम (डीएचई) प्रतिदीप्ति डाई का उपयोग करके सुपरऑक्साइड-संचालित इंट्रासेल्युलर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पादन का आकलन करने के लिए एक प्रोटोकॉल एक उच्च…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RK और RRG को NIH NIGMS अनुदान P20 GM130422 के माध्यम से UNM सेंटर फॉर मेटल्स इन बायोलॉजी एंड मेडिसिन (CMBM) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। RRG को NM-INSPIRES P30 अनुदान 1P30ES032755 से एक पायलट पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। सीएक्स 7 सेलोमिक्स उपकरण के लिए इमेजिंग कोर समर्थन एनआईएच अनुदान P20GM121176 द्वारा वित्त पोषित एआईएम केंद्र कोर के माध्यम से प्रदान किया गया था। हम सीएक्स 7 सेलोमिक्स इमेजिंग प्लेटफॉर्म के उपयोग से संबंधित तकनीकी मुद्दों के साथ उनकी अमूल्य सहायता के लिए डॉ शरीना देसाई और डॉ ली चेन को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
