High Throughput Screening Vurdering av reaktive oksygenarter (ROS) generasjon ved bruk av Dihydroethidium (DHE) fluorescens fargestoff
Summary
Denne protokollen beskriver en ny metode for å kvantifisere intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) ved bruk av dihydroethidium (DHE) som en fluorescensfargestoffsonde ved hjelp av en screening-tilnærming med høy gjennomstrømning. Protokollen beskriver metodene for kvantitativ vurdering av intracellulære reaktive oksygenarter (ROS) i de tre forskjellige hepatocellulære karsinomcellelinjene.
Abstract
Reaktive oksygenarter (ROS) spiller en nøkkelrolle i reguleringen av cellulær metabolisme i fysiologiske og patologiske prosesser. Fysiologisk ROS-produksjon spiller en sentral rolle i romlig og tidsmessig modulering av normale cellulære funksjoner som spredning, signalering, apoptose og aldring. I motsetning til dette er kronisk ROS-overproduksjon ansvarlig for et bredt spekter av sykdommer, som blant annet kreft, kardiovaskulær sykdom og diabetes. Kvantifisering av ROS-nivåer på en nøyaktig og reproduserbar måte er derfor avgjørende for å forstå normal cellulær funksjonalitet. Fluorescensavbildningsbaserte metoder for å karakterisere intracellulære ROS-arter er en vanlig tilnærming. Mange av bildebehandlings-ROS-protokollene i litteraturen bruker 2′-7′-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) fargestoff. Imidlertid lider dette fargestoffet av betydelige begrensninger i bruk og tolkbarhet. Den nåværende protokollen demonstrerer bruken av en dihydroethidium (DHE) fluorescerende sonde som en alternativ metode for å kvantifisere total ROS-produksjon i en høy gjennomstrømningsinnstilling. Bildeplattformen CX7 Cellomics ble brukt til å måle og kvantifisere ROS-produksjonen. Denne studien ble utført i tre hepatocellulære kreftcellelinjer – HepG2, JHH4 og HUH-7. Denne protokollen gir en grundig beskrivelse av de ulike prosedyrene som er involvert i vurderingen av ROS i cellene, inkludert – fremstilling av DHE-løsning, inkubasjon av celler med DHE-løsning og måling av DHE-intensitet som er nødvendig for å karakterisere ROS-produksjonen. Denne protokollen demonstrerer at DHE fluorescerende fargestoff er et robust og reproduserbart valg for å karakterisere intracellulær ROS-produksjon på en høy gjennomstrømningsmåte. Tilnærminger med høy gjennomstrømning for å måle ROS-produksjon vil sannsynligvis være nyttige i en rekke studier, for eksempel toksikologi, legemiddelscreening og kreftbiologi.
Introduction
Reaktive oksygenarter (ROS) er en gruppe naturlig forekommende, svært reaktive og temporalt ustabile kjemiske radikaler dannet som en del av den normale cellulære metabolismen i celler. ROS spiller en viktig og viktig rolle i moduleringen av normale fysiologiske og biokjemiske prosesser som forekommer i celler 1,2. Hovedkilden til ROS-produksjon i celler er fra mitokondriell elektrontransportkjede (ETC) -banen som en del av den normale bioenergetiske syklusen. Signifikante tilleggskilder til ROS-produksjon inkluderer enzymatiske reaksjoner som cellulære NADPH-oksidaser i celler. Metabolisme av matmolekyler (f.eks. glukose) skjer via den oksidative fosforyleringsveien i mitokondriematrisen. Et basisnivå av ROS-produksjon er avgjørende for å regulere normale fysiologiske cellesignaleringsprosesser. Mange viktige proteinmolekyler som er en del av glukosemetabolske signalveier (f.eks. Akt og PTEN) er kjent for å reagere på intracellulære ROS-nivåer. I tillegg produseres ROS av forskjellige intracellulære enzymer som xantinoksidase, nitrogenoksidsyntase og peroksisomale bestanddeler som en del av de cellulære enzymatiske veiene 1,2. I motsetning til de naturlige kildene til ROS, fører visse miljøfaktorer, som xenobiotika, smittsomme stoffer, UV-lys, forurensning, sigarettrøyking og stråling, også til overdreven produksjon av ROS, som er en nøkkeldriver for intracellulært oksidativt stress 1,3. Forhøyet cellulært oksidativt stress kan forårsake skade på innfødte biomolekyler inne i en celle, som lipider, proteiner og DNA, forårsaker forskjellige sykdommer som kreft, diabetes, kardiovaskulær sykdom, kronisk betennelse og nevrodegenerative lidelser 1,3,4. Derfor er nøyaktige målinger av ROS avgjørende for å forstå de cellulære mekanismene som er involvert i oksidativ stressindusert sykdomspatofysiologi.
På grunn av de korte tidsskalaene for ROS-produksjon og eliminering inne i celler, er kvantitative målinger av forskjellige ROS-radikaler fortsatt en utfordring. Metoder som elektronparamagnetisk resonans (EPR)5, høytrykksvæskekromatografi (HPLC) og fluorescensprobebasert avbildning brukes til å måle de forskjellige cellulære ROS6. Mens metoder som EPR og HPLC gir kvantitativt nøyaktige estimater, involverer disse metodene ødeleggelsen av den cellulære romlige morfologien og er vanligvis i form av globale og bulkmålinger av en prøve. I motsetning til dette beholder bildebaserte metoder som fluorescensprobebaserte metoder den cellulære morfologien og romlige konteksten til ROS-generasjonen. Imidlertid har spesifisiteten til forskjellige fluorescensprober for forskjellige typer ROS-radikaler ikke blitt godt etablert 7,8. Flere fluorescerende prober som dihydroethidium (DHE), diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), dihydrorhodamin (DHR), dimetylantracen (DMA), 2,7 diklordihydroflurescein (DCFH), 1,3-difenylisobenzofuran (DPBF) og MitoSox er tilgjengelige for ROS-deteksjon kommersielt. I de siste tiårene er DHE, MitoSox og DCFH-DA de vanlige fluorescerende fargestoffene for å måle ROS i celler og vev 8,9. DCFH-DA er et mye brukt fargestoff for å oppdage intracellulærH2O2og oksidativt stress. Til tross for populariteten til DCFH-DA, har flere tidligere studier vist at det ikke kan brukes pålitelig til å måle intracellulær H2O2 og andre ROS-nivåer 8,9,10,11,12,13,14.
I motsetning til dette viser fluorescerende sonde dihydroethidium (DHE) en spesifikk respons på det intracellulære superoksydradikalet (O2–). Mens superoksydradikalet er en av mange av ROS-artene som observeres i celler, er det et viktig radikal involvert i reduksjon av overgangsmetaller, omdannelse til peroksynitrat og dannelse av hydroperoksider, blant andre intracellulære effekter. DHE blir raskt tatt opp av cellene og har en fluorescensutslipp i det røde bølgelengdeområdet15. Ved reaksjon med superoksidradikal spesifikt danner DHE et rødt fluorescerende produkt, 2-hydroksyethidium (2-OH-E +). Dermed kan DHE betraktes som en spesifikk sonde for superoksiddeteksjon. Imidlertid kan DHE også gjennomgå uspesifikk oksidasjon med ONOO– eller OH.,H2O2og cytokrom c for å danne et andre fluorescensprodukt, ethidium E +, som kan forstyrre de målte 2-OH-E + -nivåene. Imidlertid representerer disse 2-OH E + og E + -produktene i kombinasjon en stor del av de totale cellulære ROS-artene som observeres inne i en celle når de er farget med DHE. E + interkalerer til DNA, og forbedrer fluorescensen 8,9,10,11,13,14,15,16. Siden fluorescensspektrene til ethidium og 2-hydroksyethidium bare er litt forskjellige, kan flertallet av ROS-nivåene sett i en celle sekundært til superoksidproduksjon detekteres og måles ved hjelp av DHE-fluorescensprodukter. Disse ROS-artene identifiseres ved hjelp av 480 nm bølgelengdeeksitasjon og 610 nm bølgelengdeutslipp 15,16,17.
I tillegg til å velge en spesifikk fluorescerende ROS-deteksjonssonde, er det viktig å velge en sensitiv deteksjonsmetode for å måle intracellulær ROS. Nøyaktig vurdering av intracellulære ROS-nivåer er derfor nøkkelen til å identifisere forstyrrede redoksbalansetilstander som forekommer i syke celler eller celler som har vært utsatt for ulike miljøstressorer som stråling, toksikologiske forbindelser og genotoksiske midler18. Siden ROS er et vanlig forekommende fenomen i celler som er ansvarlig for å regulere en rekke cellesignaleringsaktiviteter, er robuste metoder for deteksjon av ROS avgjørende. For å muliggjøre en slik høy gjennomstrømningsevaluering av ROS-produksjon i celler, bruker denne protokollen en HCS-plattform (High Content Screening) for å måle ROS-artene. Den nåværende protokollen tillater høy gjennomstrømningsanalyse av intracellulær ROS-produksjon, noe som er av kritisk betydning i mange toksikologiske studier19. Denne protokollen tar sikte på å gi en enkel og allsidig løsning for å oppdage og måle intracellulær ROS i adherente hepatocellulære karsinomceller. De kjemiske reagensene til H2O2 og menadion brukes som potente ROS-stimulatorer for å måle de relative nivåene av ROS-produksjon i en kontrollert og høy gjennomstrømningsinnstilling. Denne protokollen kan finjusteres for å måle ROS-produksjon i adherente og ikke-adherente celler under passende forhold, etter behov.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien ble en protokoll for å vurdere superoksiddrevet intracellulær reaktiv oksygenart (ROS) produksjon ved bruk av dihydroethidium (DHE) fluorescensfargestoff etablert på et screeningssystem med høyt innhold. Et flertall av de nåværende protokollene som er tilgjengelige i litteraturen, bruker DCFH-DA som en fluorescensavbildningssonde for å kvantifisere ROS-arter. Imidlertid har flere studier vist at DCFH-DA ikke er en ideell sonde for måling av intracellulær ROS. Ulike årsaker postulert for uegnethe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RK og RRG ble støttet av et tilskudd fra UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) gjennom NIH NIGMS grant P20 GM130422. RRG ble støttet av en pilotpris fra NM-INSPIRES P30 grant 1P30ES032755. Bildekjernestøtten for CX7 Cellomics-instrumentet ble gitt gjennom AIM-senterkjernene finansiert av NIH-tilskudd P20GM121176. Vi vil gjerne takke Dr. Sharina Desai og Dr. Li Chen for deres uvurderlige hjelp med tekniske problemer knyttet til bruken av CX7 Cellomics bildebehandlingsplattform.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
