Высокопроизводительная скрининговая оценка генерации активных форм кислорода (АФК) с использованием флуоресцентного красителя дигидроэтидия (ДГЭ)
Summary
В этом протоколе описывается новый метод количественного определения внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) с использованием дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве флуоресцентного зонда красителя с использованием высокопроизводительного скринингового подхода. В протоколе описаны методы количественной оценки внутриклеточных активных форм кислорода (АФК) в трех различных клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы.
Abstract
Активные формы кислорода (АФК) играют ключевую роль в регуляции клеточного метаболизма при физиологических и патологических процессах. Физиологическая продукция АФК играет центральную роль в пространственной и временной модуляции нормальных клеточных функций, таких как пролиферация, передача сигналов, апоптоз и старение. Напротив, хроническое перепроизводство АФК ответственно за широкий спектр заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания и диабет. Таким образом, точная и воспроизводимая количественная оценка уровней АФК имеет важное значение для понимания нормальной функциональности клеток. Методы флуоресцентной визуализации для характеристики внутриклеточных видов АФК являются распространенным подходом. Во многих протоколах визуализации АФК, описанных в литературе, используется краситель 2′-7′-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA). Тем не менее, этот краситель страдает от существенных ограничений в его использовании и интерпретируемости. Текущий протокол демонстрирует использование флуоресцентного зонда дигидроэтидия (ДГЭ) в качестве альтернативного метода количественной оценки общего производства АФК в условиях высокой пропускной способности. Высокопроизводительная платформа визуализации CX7 Cellomics использовалась для измерения и количественной оценки производства АФК. Данное исследование проводилось на трех гепатоцеллюлярных клеточных линиях рака – HepG2, JHH4 и HUH-7. Этот протокол содержит подробное описание различных процедур, связанных с оценкой АФК в клетках, включая приготовление раствора ДГЭ, инкубацию клеток с раствором ДГЭ и измерение интенсивности ДГЭ, необходимой для характеристики продукции АФК. Этот протокол демонстрирует, что флуоресцентный краситель DHE является надежным и воспроизводимым выбором для характеристики внутриклеточного производства АФК с высокой пропускной способностью. Высокопроизводительные подходы к измерению продукции АФК, вероятно, будут полезны в различных исследованиях, таких как токсикология, скрининг лекарств и биология рака.
Introduction
Активные формы кислорода (АФК) представляют собой группу встречающихся в природе, высокореакционноспособных и нестабильных во времени химических радикалов, образующихся как часть нормального клеточного метаболизма в клетках. АФК играет ключевую и существенную роль в модуляции нормальных физиологических и биохимических процессов, происходящих в клетках 1,2. Основным источником продукции АФК в клетках является митохондриальная цепь переноса электронов (ETC) как часть нормального биоэнергетического цикла. Важными дополнительными источниками производства АФК являются ферментативные реакции, такие как клеточные НАДФН-оксидазы в клетках. Метаболизм молекул пищи (например, глюкозы) происходит через путь окислительного фосфорилирования в митохондриальном матриксе. Исходный уровень продукции АФК необходим для регуляции нормальных физиологических сигнальных процессов клеток. Известно, что многие ключевые белковые молекулы, которые являются частью метаболических сигнальных путей глюкозы (например, Akt и PTEN), реагируют на внутриклеточные уровни АФК. Кроме того, АФК продуцируются различными внутриклеточными ферментами, такими как ксантиноксидаза, синтаза оксида азота и пероксисомальные компоненты, как часть клеточных ферментативных путей 1,2. В отличие от естественных источников АФК, некоторые факторы окружающей среды, такие как ксенобиотики, инфекционные агенты, ультрафиолетовое излучение, загрязнение, курение сигарет и радиация, также приводят к чрезмерной выработке АФК, которые являются ключевым фактором внутриклеточного окислительного стресса 1,3. Повышенный клеточный окислительный стресс может привести к повреждению нативных биомолекул внутри клетки, таких как липиды, белки и ДНК, вызывая различные заболевания, такие как рак, диабет, сердечно-сосудистые заболевания, хроническое воспаление и нейродегенеративные расстройства 1,3,4. Таким образом, точные измерения АФК необходимы для понимания клеточных механизмов, участвующих в патофизиологии заболеваний, вызванных окислительным стрессом.
Из-за коротких временных рамок производства и элиминации АФК внутри клеток количественные измерения различных радикалов АФК остаются сложной задачей. Такие методы, как электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)5, жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и визуализация на основе флуоресцентного зонда, используются для измерения различных клеточных АФК6. В то время как такие методы, как ЭПР и ВЭЖХ, дают количественно точные оценки, эти методы включают в себя разрушение пространственной морфологии клеток и обычно проводятся в форме глобальных и массовых измерений образца. В отличие от этого, методы, основанные на визуализации, такие как методы на основе флуоресцентных зондов, сохраняют клеточную морфологию и пространственный контекст генерации АФК. Однако специфичность различных флуоресцентных зондов для различных типов радикалов АФК не была хорошо установлена 7,8. Несколько флуоресцентных зондов, таких как дигидроэтидий (ДГЭ), дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA), дигидрородамин (DHR), диметилантрацен (DMA), 2,7-дихлордигидрофлуресцеин (DCFH), 1,3-дифенилизобензофуран (DPBF) и MitoSox, доступны для коммерческого обнаружения АФК. В последние десятилетия DHE, MitoSox и DCFH-DA являются широко используемыми флуоресцентными красителями для измерения АФК в клетках и тканях 8,9. DCFH-DA является широко используемым красителем для обнаружения внутриклеточногоH2O2и окислительного стресса. Несмотря на популярность DCFH-DA, многочисленные предыдущие исследования показали, что он не может быть надежно использован для измерения внутриклеточного уровняH2O2и других уровней АФК 8,9,10,11,12,13,14.
Напротив, флуоресцентный зонд дигидроэтидий (ДГЭ) проявляет специфическую реакцию на внутриклеточный супероксидный радикал (O2–). В то время как супероксидный радикал является одним из многих видов АФК, наблюдаемых в клетках, он является важным радикалом, участвующим в восстановлении переходных металлов, превращении в пероксинитрат и образовании гидропероксидов, а также в других внутриклеточных эффектах. ДГЭ быстро поглощается клетками и имеет флуоресцентное излучение в красном диапазоне длин волн15. При реакции с супероксидным радикалом ДГЭ образует красный флуоресцентный продукт, 2-гидроксиэтидий (2-OH-E+). Таким образом, ДГЭ можно рассматривать как специфический зонд для детектирования супероксида. Однако ДГЭ также может подвергаться неспецифическому окислению ONOO- или OH, H2O2и цитохромом C с образованием второго продукта флуоресценции, этидия E+, который может влиять на измеренные уровни 2-OH-E+. Тем не менее, эти продукты 2-OH E+ и E+ в сочетании представляют собой основную часть общего количества клеточных видов АФК, наблюдаемых внутри клетки при окрашивании ДГЭ. E+ интеркалируется в ДНК, значительно усиливая ее флуоресценцию 8,9,10,11,13,14,15,16. Поскольку спектры флуоресценции этидия и 2-гидроксиэтидия различаются лишь незначительно, большинство уровней АФК, наблюдаемых в клетке, вторичной по отношению к производству супероксида, могут быть обнаружены и измерены с помощью продуктов флуоресценции ДГЭ. Эти виды АФК идентифицированы с помощью возбуждения с длиной волны 480 нм и излучения с длиной волны 610 нм 15,16,17.
В дополнение к выбору конкретного флуоресцентного датчика для обнаружения АФК, важно выбрать чувствительный метод обнаружения для измерения внутриклеточных АФК. Таким образом, точная оценка внутриклеточных уровней АФК является ключом к выявлению нарушений окислительно-восстановительного баланса, возникающих в больных клетках или клетках, подвергшихся воздействию различных стрессоров окружающей среды, таких как радиация, токсикологические соединения и генотоксическиеагенты. Поскольку АФК является часто встречающимся явлением в клетках, которое отвечает за регуляцию различных сигнальных активностей клеток, надежные методы обнаружения АФК имеют важное значение. Чтобы обеспечить такую высокопроизводительную оценку продукции АФК в клетках, этот протокол использует платформу скрининга с высоким содержанием (HCS) для измерения видов АФК. Существующий протокол позволяет проводить высокопроизводительный анализ внутриклеточной продукции АФК, что имеет решающее значение во многих токсикологических исследованиях19. Этот протокол направлен на предоставление простого и универсального решения для обнаружения и измерения внутриклеточных АФК в адгезивных клетках гепатоцеллюлярной карциномы. Химические реагенты H2O2 и менадион используются в качестве мощных стимуляторов АФК для измерения относительных уровней продукции АФК в контролируемых и высокопроизводительных условиях. Этот протокол может быть точно настроен для измерения продукции АФК в адгезивных и неадгезивных клетках при соответствующих условиях, если это необходимо.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании был разработан протокол оценки внутриклеточной продукции активных форм кислорода (АФК), управляемых супероксидом, с использованием флуоресцентного красителя дигидроэтидия (ДГЭ) на системе скрининга с высоким содержанием. Большинство современных протоколов, досту…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
РК и RRG были поддержаны грантом Центра металлов в биологии и медицине UNM (CMBM) через грант NIH NIGMS P20 GM130422. RRG была поддержана пилотной премией из гранта NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Поддержка ядра визуализации для инструмента CX7 Cellomics была обеспечена через ядра центра AIM, финансируемые грантом NIH P20GM121176. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Шарину Десаи и д-ра Ли Чена за их неоценимую помощь в решении технических вопросов, связанных с использованием платформы визуализации CX7 Cellomics.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
