Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

Summary

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Abstract

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) juegan un papel clave en la regulación del metabolismo celular en procesos fisiológicos y patológicos. La producción fisiológica de ROS desempeña un papel central en la modulación espacial y temporal de las funciones celulares normales, como la proliferación, la señalización, la apoptosis y la senescencia. Por el contrario, la sobreproducción crónica de ROS es responsable de un amplio espectro de enfermedades, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la diabetes, entre otras. Por lo tanto, cuantificar los niveles de ROS de una manera precisa y reproducible es esencial para comprender la funcionalidad celular normal. Los métodos basados en imágenes de fluorescencia para caracterizar las especies de ROS intracelulares son un enfoque común. Muchos de los protocolos de ROS por imágenes en la literatura utilizan el colorante de diacetato de 2′-7′-diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA). Sin embargo, este colorante adolece de importantes limitaciones en su uso e interpretabilidad. El protocolo actual demuestra el uso de una sonda fluorescente de dihidroetidio (DHE) como método alternativo para cuantificar la producción total de ROS en un entorno de alto rendimiento. La plataforma de imágenes de alto rendimiento, CX7 Cellomics, se utilizó para medir y cuantificar la producción de ROS. Este estudio se llevó a cabo en tres líneas celulares de cáncer hepatocelular: HepG2, JHH4 y HUH-7. Este protocolo proporciona una descripción detallada de los diversos procedimientos involucrados en la evaluación de ROS dentro de las células, que incluyen: preparación de la solución de DHE, incubación de células con solución de DHE y medición de la intensidad de DHE necesaria para caracterizar la producción de ROS. Este protocolo demuestra que el colorante fluorescente DHE es una opción robusta y reproducible para caracterizar la producción intracelular de ROS de una manera de alto rendimiento. Es probable que los enfoques de alto rendimiento para medir la producción de ROS sean útiles en una variedad de estudios, como toxicología, detección de fármacos y biología del cáncer.

Introduction

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son un grupo de radicales químicos naturales, altamente reactivos y temporalmente inestables que se forman como parte del metabolismo celular normal de las células. Las ROS juegan un papel clave y esencial en la modulación de los procesos fisiológicos y bioquímicos normales que ocurren en las células ^1,2. La principal fuente de producción de ROS en las células proviene de la vía de la cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) como parte del ciclo bioenergético normal. Las fuentes adicionales significativas de producción de ROS incluyen reacciones enzimáticas como las NADPH oxidasas celulares en las células. El metabolismo de las moléculas de los alimentos (por ejemplo, la glucosa) se produce a través de la vía de fosforilación oxidativa en la matriz mitocondrial. Un nivel basal de producción de ROS es esencial para regular los procesos normales de señalización celular fisiológica. Se sabe que muchas moléculas proteicas clave que forman parte de las vías de señalización metabólica de la glucosa (por ejemplo, Akt y PTEN) responden a los niveles intracelulares de ROS. Además, las ROS son producidas por varias enzimas intracelulares como la xantina oxidasa, la óxido nítrico sintasa y los constituyentes peroxisomales como parte de las vías enzimáticas celulares ^1,2. A diferencia de las fuentes naturales de ROS, ciertos factores ambientales, como los xenobióticos, los agentes infecciosos, la luz ultravioleta, la contaminación, el tabaquismo y la radiación, también conducen a una producción excesiva de ROS, que son un factor clave del estrés oxidativo intracelular ^1,3. El estrés oxidativo celular elevado puede causar daño a las biomoléculas nativas dentro de una célula, como los lípidos, las proteínas y el ADN, causando diversas enfermedades como cáncer, diabetes, enfermedades cardiovasculares, inflamación crónica y trastornos neurodegenerativos ^1,3,4. Por lo tanto, las mediciones precisas de ROS son esenciales para comprender los mecanismos celulares involucrados en la fisiopatología de la enfermedad inducida por el estrés oxidativo.

Debido a las cortas escalas de tiempo de producción y eliminación de ROS dentro de las células, las mediciones cuantitativas de varios radicales ROS siguen siendo un desafío. Se utilizan métodos como la resonancia paramagnética electrónica (EPR)⁵, la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) y las imágenes basadas en sondas de fluorescencia para medir las diversas ROS⁶ celulares. Si bien métodos como la EPR y la HPLC proporcionan estimaciones cuantitativamente precisas, estos métodos implican la destrucción de la morfología espacial celular y suelen presentarse en forma de mediciones globales y masivas de una muestra. Por el contrario, los métodos basados en imágenes, como los métodos basados en sondas de fluorescencia, conservan la morfología celular y el contexto espacial de la generación de ROS. Sin embargo, la especificidad de varias sondas de fluorescencia para diferentes tipos de radicales ROS no ha sido bien establecida ^7,8. Varias sondas fluorescentes como el dihidroetidio (DHE), el diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFH-DA), la dihidrorodamina (DHR), el dimetilantraceno (DMA), la 2,7 diclorodihidrofluresceína (DCFH), el 1,3-difenilisobenzofurano (DPBF) y MitoSox están disponibles para la detección de ROS comercialmente. En las últimas décadas, DHE, MitoSox y DCFH-DA son los colorantes fluorescentes comúnmente utilizados para medir ROS en células y tejidos ^8,9. El DCFH-DA es un colorante ampliamente utilizado para la detección de_H2O2intracelular y estrés oxidativo. A pesar de la popularidad del DCFH-DA, múltiples estudios previos han demostrado que no se puede utilizar de manera confiable para medir los niveles intracelulares de_H2O2y otras ROS ^{8,9,10,11,12,13,14}.

Por el contrario, la sonda fluorescente dihidroetidio (DHE) muestra una respuesta específica al radical superóxido intracelular (_O2^–). Si bien el radical superóxido es una de las muchas especies de ROS observadas en las células, es un radical importante involucrado en la reducción de metales de transición, la conversión en peroxinitrato y la formación de hidroperóxidos, entre otros efectos intracelulares. El DHE es absorbido rápidamente por las células y tiene una emisión de fluorescencia en el rango de longitud de onda roja¹⁵. Al reaccionar específicamente con el radical superóxido, el DHE forma un producto fluorescente rojo, 2-hidroxietidio (2-OH-E⁺). Por lo tanto, el DHE puede considerarse como una sonda específica para la detección de superóxido. Sin embargo, el DHE también puede sufrir oxidación inespecífica con ^ONOO- u ^OH., H₂O₂ y citocromo c para formar un segundo producto de fluorescencia, etidio E^+, que puede interferir con los niveles medidos de 2-OH-E⁺. Sin embargo, estos productos 2-OH E⁺ y E⁺, en combinación, representan una parte importante del total de especies celulares de ROS observadas dentro de una célula cuando se tiñe con DHE. E⁺ se intercala en el ADN, mejorando en gran medida su fluorescencia 8,9,10,11,13,14,15,16. Dado que los espectros de fluorescencia del etidio y el 2-hidroxietidio solo difieren ligeramente, la mayoría de los niveles de ROS observados en una célula secundaria a la producción de superóxido pueden detectarse y medirse utilizando productos de fluorescencia DHE. Estas especies de ROS se identifican utilizando la excitación de longitud de onda de 480 nm y la emisión de longitud de onda de 610 nm 15,16,17.

Además de elegir una sonda de detección de ROS fluorescente específica, es importante elegir un método de detección sensible para medir las ROS intracelulares. Por lo tanto, la evaluación precisa de los niveles intracelulares de ROS es clave para identificar los estados de equilibrio redox alterados que ocurren en células enfermas o células que han estado expuestas a diversos factores estresantes ambientales, como radiación, compuestos toxicológicos y agentes genotóxicos¹⁸. Dado que las ROS son un fenómeno común en las células que es responsable de regular una variedad de actividades de señalización celular, los métodos robustos de detección de ROS son esenciales. Para permitir una evaluación de alto rendimiento de la producción de ROS dentro de las células, este protocolo utiliza una plataforma de cribado de alto contenido (HCS) para medir las especies de ROS. El protocolo actual permite el análisis de alto rendimiento de la producción intracelular de ROS, que es de vital importancia en muchos estudios toxicológicos¹⁹. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una solución fácil y versátil para detectar y medir ROS intracelulares en células de carcinoma hepatocelular adherente. Los reactivos químicos de_H2,_O2 y menadiona se utilizan como potentes estimuladores de ROS para medir los niveles relativos de producción de ROS en un entorno controlado y de alto rendimiento. Este protocolo puede ajustarse para medir la producción de ROS en células adherentes y no adherentes en condiciones apropiadas, según sea necesario.

Protocol

1. Cultivo celular Siembre las células de prueba (células de carcinoma hepatocelular HepG2, HUH7 y JHH4) en una placa de 96 pocillos con una densidad de siembra de 10.000 células/pocillo en un volumen de siembra final de 200 μL por pocillo.Antes de cultivar las células HepG2, cubra los 96 pocillos de la placa con colágeno tipo IV (50 μg/mL) durante 2 h a temperatura ambiente (RT). Para evitar la solidificación del colágeno madre, coloque la solución madre en hielo y, posterior…

Representative Results

El dihidroetidio (DHE) es un colorante de fluorescencia sensible al superóxido que proporciona información específica sobre los estados ROS intracelulares. El colorante DHE emite intrínsecamente fluorescencia azul en el citoplasma. Sin embargo, al interactuar con los radicales superóxido, se transforma en 2-hidroxietidio, que emite fluorescencia en las longitudes de onda rojas (>550 nm) (Figura 1). El colorante DHE se transporta fácilmente a las células y al núcleo. La fluorescencia …

Discussion

En este estudio, se estableció un protocolo para evaluar la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares impulsadas por superóxido utilizando colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE) en un sistema de cribado de alto contenido. La mayoría de los protocolos actuales disponibles en la literatura utilizan el DCFH-DA como sonda de imagen de fluorescencia para cuantificar las especies de ROS. Sin embargo, múltiples estudios han demostrado que el DCFH-DA no es una sonda ideal para la medición…

Materials

1.5 mL centrifuge tubes	VWR	20170-038
96- well plate	Corning Costar	07-200-90
Cellomics Cx7	ThermoFisher	HCSDCX7LEDPRO
Collagen	Advanced Biomatrix	5056
DHE (Dihydroethidium)	ThermoFisher	D1168
DMEM	Sigma	6046
FBS	VWR	97068-085
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
HepG2 cell line	ATCC
Hoechst	ThermoFisher	33342
HUH7 cell line	ATCC
Hydrogen Peroxide	Sigma	88597
JHH4 cell line	ATCC
Menadione	Sigma	M5625