Screening med hög genomströmning av reaktiva syreradikaler (ROS) med hjälp av dihydroetid (DHE) fluorescensfärgämne
Summary
Detta protokoll beskriver en ny metod för att kvantifiera intracellulära reaktiva syreradikaler (ROS) med hjälp av dihydroetidium (DHE) som en fluorescensfärgsond med hjälp av en screeningmetod med hög genomströmning. Protokollet beskriver metoderna för kvantitativ bedömning av intracellulära reaktiva syreradikaler (ROS) i de tre olika hepatocellulära karcinomcellinjerna.
Abstract
Reaktiva syrearter (ROS) spelar en nyckelroll i regleringen av cellulär metabolism i fysiologiska och patologiska processer. Fysiologisk ROS-produktion spelar en central roll i den rumsliga och tidsmässiga moduleringen av normala cellulära funktioner som proliferation, signalering, apoptos och åldrande. Däremot är kronisk ROS-överproduktion ansvarig för ett brett spektrum av sjukdomar, såsom cancer, hjärt- och kärlsjukdomar och diabetes, bland annat. Att kvantifiera ROS-nivåer på ett exakt och reproducerbart sätt är därför avgörande för att förstå normal cellulär funktionalitet. Fluorescensavbildningsbaserade metoder för att karakterisera intracellulära ROS-arter är ett vanligt tillvägagångssätt. Många av de avbildande ROS-protokollen i litteraturen använder 2′-7′-diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA) färgämne. Detta färgämne lider dock av betydande begränsningar i dess användning och tolkningsbarhet. Det nuvarande protokollet visar användningen av en fluorescerande sond av dihydroetid (DHE) som en alternativ metod för att kvantifiera den totala ROS-produktionen i en miljö med hög genomströmning. Plattformen CX7 Cellomics användes för att mäta och kvantifiera ROS-produktionen. Denna studie genomfördes i tre hepatocellulära cancercellinjer – HepG2, JHH4 och HUH-7. Detta protokoll ger en djupgående beskrivning av de olika procedurer som är involverade i bedömningen av ROS i cellerna, inklusive beredning av DHE-lösning, inkubation av celler med DHE-lösning och mätning av DHE-intensitet som är nödvändig för att karakterisera ROS-produktionen. Detta protokoll visar att DHE-fluorescerande färgämne är ett robust och reproducerbart val för att karakterisera intracellulär ROS-produktion på ett sätt med hög genomströmning. Metoder med hög genomströmning för att mäta ROS-produktion kommer sannolikt att vara till hjälp i en mängd olika studier, såsom toxikologi, läkemedelsscreening och cancerbiologi.
Introduction
Reaktiva syreradikaler (ROS) är en grupp naturligt förekommande, mycket reaktiva och temporalt instabila kemiska radikaler som bildas som en del av den normala cellulära metabolismen i celler. ROS spelar en viktig och väsentlig roll i moduleringen av normala fysiologiska och biokemiska processer som sker i celler 1,2. Den huvudsakliga källan till ROS-produktion i celler är från mitokondriell elektrontransportkedja (ETC) som en del av den normala bioenergetiska cykeln. Betydande ytterligare källor till ROS-produktion inkluderar enzymatiska reaktioner såsom cellulära NADPH-oxidaser i celler. Metabolism av livsmedelsmolekyler (t.ex. glukos) sker via den oxidativa fosforyleringsvägen i mitokondriematrisen. En baslinje för ROS-produktion är avgörande för att reglera normala fysiologiska cellsignaleringsprocesser. Många viktiga proteinmolekyler som ingår i glukosmetaboliska signalvägar (t.ex. Akt och PTEN) är kända för att svara på intracellulära ROS-nivåer. Dessutom produceras ROS av olika intracellulära enzymer såsom xantinoxidas, kväveoxidsyntas och peroxisomala beståndsdelar som en del av de cellulära enzymatiska vägarna 1,2. Till skillnad från de naturliga källorna till ROS leder vissa miljöfaktorer, såsom xenobiotika, smittämnen, UV-ljus, föroreningar, cigarettrökning och strålning, också till överdriven produktion av ROS, som är en viktig drivkraft för intracellulär oxidativ stress 1,3. Förhöjd cellulär oxidativ stress kan orsaka skador på inhemska biomolekyler inuti en cell, såsom lipider, proteiner och DNA, vilket orsakar olika sjukdomar som cancer, diabetes, hjärt-kärlsjukdomar, kronisk inflammation och neurodegenerativa sjukdomar 1,3,4. Därför är noggranna mätningar av ROS avgörande för att förstå de cellulära mekanismer som är involverade i patofysiologi vid oxidativ stressinducerad sjukdom.
På grund av de korta tidsskalorna för ROS-produktion och eliminering inuti celler är kvantitativa mätningar av olika ROS-radikaler fortfarande en utmaning. Metoder som elektronparamagnetisk resonans (EPR)5, högtrycksvätskekromatografi (HPLC) och fluorescenssondbaserad avbildning används för att mäta de olika cellulära ROS6. Medan metoder som EPR och HPLC ger kvantitativt korrekta uppskattningar, innebär dessa metoder förstörelse av den cellulära rumsliga morfologin och är vanligtvis i form av globala och bulkmätningar av ett prov. Däremot behåller avbildningsbaserade metoder som fluorescenssondbaserade metoder den cellulära morfologin och det rumsliga sammanhanget för ROS-generationen. Specificiteten hos olika fluorescensprober för olika typer av ROS-radikaler har dock inte varit väletablerad 7,8. Flera fluorescerande sonder såsom dihydroetidium (DHE), diklordihydrofluoresceindiacetat (DCFH-DA), dihydrorhodamin (DHR), dimetylantracen (DMA), 2,7-diklordihydroflurescein (DCFH), 1,3-difenylisobensofuran (DPBF) och MitoSox är tillgängliga för ROS-detektion kommersiellt. Under de senaste decennierna är DHE, MitoSox och DCFH-DA de vanligaste fluorescerande färgämnena för att mäta ROS i celler och vävnader 8,9. DCFH-DA är ett allmänt använt färgämne för att detektera intracellulärH2O2och oxidativ stress. Trots DCFH-DA:s popularitet har flera tidigare studier visat att det inte kan användas på ett tillförlitligt sätt för att mäta intracelluläraH2O2 och andra ROS-nivåer 8,9,10,11,12,13,14.
Däremot visar den fluorescerande sonden dihydroetidium (DHE) ett specifikt svar på den intracellulära superoxidradikalen (O2–). Medan superoxidradikalen är en av många av de ROS-arter som observerats i celler, är det en viktig radikal som är involverad i minskningen av övergångsmetaller, omvandling till peroxynitrat och bildning av hydroperoxider, bland andra intracellulära effekter. DHE tas snabbt upp av cellerna och har en fluorescensemission i det röda våglängdsområdet15. Vid reaktion med superoxidradikal specifikt bildar DHE en röd fluorescerande produkt, 2-hydroxietidium (2-OH-E+). DHE kan därför betraktas som en specifik sond för superoxiddetektion. DHE kan dock också genomgå ospecifik oxidation med ONOO– eller OH.,H2O2och cytokrom c för att bilda en andra fluorescensprodukt, etidium E+, som kan interferera med de uppmätta 2-OH-E+-nivåerna. Dessa 2-OH E+ och E+ produkter, i kombination, representerar dock en stor del av de totala cellulära ROS-arterna som observeras inuti en cell när de färgas med DHE. E+ interkalerar in i DNA, vilket kraftigt förbättrar dess fluorescens 8,9,10,11,13,14,15,16. Eftersom fluorescensspektra för etidium och 2-hydroxietidium endast skiljer sig något, kan majoriteten av ROS-nivåerna som ses i en cell sekundär till superoxidproduktion detekteras och mätas med hjälp av DHE-fluorescensprodukter. Dessa ROS-arter identifieras med hjälp av 480 nm våglängdsexcitation och 610 nm våglängd emission 15,16,17.
Förutom att välja en specifik fluorescerande ROS-detektionssond är det viktigt att välja en känslig detektionsmetod för att mäta intracellulär ROS. Noggrann bedömning av intracellulära ROS-nivåer är därför nyckeln till att identifiera störda redoxbalanstillstånd som uppstår i sjuka celler eller celler som har utsatts för olika miljöstressorer såsom strålning, toxikologiska föreningar och genotoxiska ämnen18. Eftersom ROS är ett vanligt förekommande fenomen i celler som ansvarar för att reglera en mängd olika cellsignaleringsaktiviteter, är robusta metoder för detektion av ROS nödvändiga. För att möjliggöra en sådan utvärdering av ROS-produktionen i celler med hög genomströmning använder detta protokoll en plattform för screening med högt innehåll (HCS) för att mäta ROS-arterna. Det nuvarande protokollet möjliggör storskalig analys av intracellulär ROS-produktion, vilket är av avgörande betydelse i många toxikologiska studier19. Detta protokoll syftar till att tillhandahålla en enkel och mångsidig lösning för att detektera och mäta intracellulär ROS i vidhäftande hepatocellulära karcinomceller. De kemiska reagenserna iH2O2och menadion används som potenta ROS-stimulatorer för att mäta de relativa nivåerna av ROS-produktion i en kontrollerad och hög genomströmningsmiljö. Detta protokoll kan vid behov finjusteras för att mäta ROS-produktionen i vidhäftande och icke-vidhäftande celler under lämpliga förhållanden.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie etablerades ett protokoll för att bedöma produktionen av superoxiddrivna intracellulära reaktiva syreradikaler (ROS) med hjälp av dihydroetid (DHE) fluorescensfärgämne på ett screeningsystem med högt innehåll. En majoritet av de nuvarande protokollen som finns tillgängliga i litteraturen använder DCFH-DA som en fluorescensavbildningssond för att kvantifiera ROS-arter. Flera studier har dock visat att DCFH-DA inte är en idealisk sond för mätning av intracellulär ROS. Olika orsaker som postul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RK och RRG fick stöd av ett anslag från UNM Center for Metals in Biology and Medicine (CMBM) genom NIH NIGMS anslag P20 GM130422. RRG fick stöd av ett pilotpris från NM-INSPIRES P30-anslag 1P30ES032755. Stödet för bildkärnan för CX7 Cellomics-instrumentet tillhandahölls genom AIM-centrets kärnor som finansierades av NIH-anslag P20GM121176. Vi vill tacka Dr. Sharina Desai och Dr. Li Chen för deras ovärderliga hjälp med tekniska frågor relaterade till användningen av CX7 Cellomics-bildplattformen.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
