Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi
Summary
Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.
Abstract
Reaktif oksijen türleri (ROS), fizyolojik ve patolojik süreçlerde hücresel metabolizmanın düzenlenmesinde anahtar rol oynar. Fizyolojik ROS üretimi, proliferasyon, sinyalleşme, apoptoz ve yaşlanma gibi normal hücresel fonksiyonların uzamsal ve zamansal modülasyonunda merkezi bir rol oynar. Buna karşılık, kronik ROS aşırı üretimi, diğerlerinin yanı sıra kanser, kardiyovasküler hastalık ve diyabet gibi geniş bir hastalık yelpazesinden sorumludur. ROS seviyelerinin doğru ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesi, normal hücresel işlevselliği anlamak için çok önemlidir. Hücre içi ROS türlerini karakterize etmek için floresan görüntüleme tabanlı yöntemler yaygın bir yaklaşımdır. Literatürdeki görüntüleme ROS protokollerinin çoğunda 2′-7′-diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA) boyası kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu boya, kullanımında ve yorumlanabilirliğinde önemli sınırlamalardan muzdariptir. Mevcut protokol, yüksek verimli bir ortamda toplam ROS üretimini ölçmek için alternatif bir yöntem olarak bir dihidroetidyum (DHE) floresan probunun kullanımını göstermektedir. ROS üretimini ölçmek ve ölçmek için yüksek verimli görüntüleme platformu CX7 Cellomics kullanıldı. Bu çalışma üç hepatoselüler kanser hücre hattında (HepG2, JHH4 ve HUH-7) gerçekleştirildi. Bu protokol, DHE çözeltisinin hazırlanması, hücrelerin DHE çözeltisi ile inkübasyonu ve ROS üretimini karakterize etmek için gerekli DHE yoğunluğunun ölçülmesi dahil olmak üzere, hücreler içindeki ROS’un değerlendirilmesinde yer alan çeşitli prosedürlerin derinlemesine bir tanımını sağlar. Bu protokol, DHE floresan boyanın, hücre içi ROS üretimini yüksek verimli bir şekilde karakterize etmek için sağlam ve tekrarlanabilir bir seçim olduğunu göstermektedir. ROS üretimini ölçmek için yüksek verimli yaklaşımların, toksikoloji, ilaç taraması ve kanser biyolojisi gibi çeşitli çalışmalarda yardımcı olması muhtemeldir.
Introduction
Reaktif oksijen türleri (ROS), hücrelerde normal hücresel metabolizmanın bir parçası olarak oluşan, doğal olarak oluşan, oldukça reaktif ve zamansal olarak kararsız kimyasal radikaller grubudur. ROS,hücrelerde meydana gelen normal fizyolojik ve biyokimyasal süreçlerin modülasyonunda anahtar ve önemli bir rol oynar 1,2. Hücrelerde ROS üretiminin ana kaynağı, normal biyoenerjetik döngünün bir parçası olarak mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC) yolundandır. ROS üretiminin önemli ek kaynakları, hücrelerdeki hücresel NADPH oksidazlar gibi enzimatik reaksiyonları içerir. Gıda moleküllerinin (örneğin glikoz) metabolizması, mitokondriyal matristeki oksidatif fosforilasyon yolu yoluyla gerçekleşir. Normal fizyolojik hücre sinyalleme süreçlerini düzenlemek için temel düzeyde bir ROS üretimi gereklidir. Glikoz metabolik sinyal yollarının bir parçası olan birçok anahtar protein molekülünün (örneğin, Akt ve PTEN) hücre içi ROS seviyelerine yanıt verdiği bilinmektedir. Ek olarak, ROS, hücresel enzimatik yolların bir parçası olarak ksantin oksidaz, nitrik oksit sentaz ve peroksizomal bileşenler gibi çeşitli hücre içi enzimler tarafından üretilir 1,2. ROS’un doğal kaynaklarının aksine, ksenobiyotikler, bulaşıcı ajanlar, UV ışığı, kirlilik, sigara içimi ve radyasyon gibi bazı çevresel faktörler de hücre içi oksidatif stresin önemli bir itici gücü olan aşırı ROS üretimine yol açar 1,3. Yüksek hücresel oksidatif stres, bir hücre içindeki lipitler, proteinler ve DNA gibi doğal biyomoleküllere zarar vererek kanser, diyabet, kardiyovasküler hastalık, kronik inflamasyon ve nörodejeneratif bozukluklar gibi çeşitli hastalıklara neden olabilir 1,3,4. Bu nedenle, oksidatif strese bağlı hastalık patofizyolojisinde yer alan hücresel mekanizmaları anlamak için ROS’un doğru ölçümleri gereklidir.
ROS üretiminin ve hücrelerin içindeki eliminasyonun kısa zaman çizelgeleri nedeniyle, çeşitli ROS radikallerinin kantitatif ölçümleri bir zorluk olmaya devam etmektedir. Çeşitli hücresel ROS6’yı ölçmek için elektron paramanyetik rezonans (EPR)5, yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve floresan prob tabanlı görüntüleme gibi yöntemler kullanılır. EPR ve HPLC gibi yöntemler nicel olarak doğru tahminler verirken, bu yöntemler hücresel uzamsal morfolojinin yok edilmesini içerir ve genellikle bir numunenin küresel ve toplu ölçümleri şeklindedir. Buna karşılık, floresan probu tabanlı yöntemler gibi görüntüleme tabanlı yöntemler, ROS neslinin hücresel morfolojisini ve uzamsal bağlamını korur. Bununla birlikte, farklı ROS radikalleri için çeşitli floresan problarının özgüllüğü iyi belirlenmemiştir 7,8. Dihidroetidyum (DHE), diklorodihidrofloresein diasetat (DCFH-DA), dihidrorodamin (DHR), dimetil antrasen (DMA), 2,7 diklorodihidroflurescein (DCFH), 1,3-Difenilizobenzofuran (DPBF) ve MitoSox gibi çeşitli floresan problar ticari olarak ROS tespiti için mevcuttur. Geçtiğimiz yıllarda, DHE, MitoSox ve DCFH-DA, hücrelerde ve dokulardaROS’u ölçmek için yaygın olarak kullanılan floresan boyalardır 8,9. DCFH-DA, hücre içiH2O2ve oksidatif stresi tespit etmek için yaygın olarak kullanılan bir boyadır. DCFH-DA’nın popülaritesine rağmen, önceki birçok çalışma, hücre içiH2O2ve diğer ROS seviyelerini 8,9,10,11,12,13,14 ölçmek için güvenilir bir şekilde kullanılamayacağını göstermiştir.
Buna karşılık, floresan prob dihidroetidyum (DHE), hücre içi süperoksit radikaline (O2–) spesifik bir yanıt gösterir. Süperoksit radikali, hücrelerde gözlenen birçok ROS türünden biri olmakla birlikte, diğer hücre içi etkilerin yanı sıra geçiş metallerinin indirgenmesinde, peroksinitrata dönüştürülmesinde ve hidroperoksitlerin oluşumunda rol oynayan önemli bir radikaldir. DHE, hücreler tarafından hızla alınır ve kırmızı dalga boyu aralığında15 floresan emisyonuna sahiptir. Spesifik olarak süperoksit radikali ile reaksiyona girdiğinde, DHE kırmızı bir floresan ürün, 2-hidroksi etidyum (2-OH-E +) oluşturur. Bu nedenle, DHE, süperoksit tespiti için spesifik bir prob olarak düşünülebilir. Bununla birlikte, DHE, ölçülen 2-OH-E + seviyelerine müdahale edebilen ikinci bir floresan ürünü olan etidyum E+ oluşturmak için ONOO– veya OH.,H2O2ve sitokrom c ile spesifik olmayan oksidasyona da uğrayabilir. Bununla birlikte, bu 2-OH E + ve E + ürünleri, kombinasyon halinde, DHE ile boyandığında bir hücre içinde gözlenen toplam hücresel ROS türlerinin büyük bir bölümünü temsil eder. E+ DNA’ya interkalasyon yaparve floresansını büyük ölçüde arttırır 8,9,10,11,13,14,15,16. Etidyum ve 2-hidroksi etidyumun floresan spektrumları sadece biraz farklılık gösterdiğinden, süperoksit üretimine ikincil bir hücrede görülen ROS seviyelerinin çoğu, DHE floresan ürünleri kullanılarak tespit edilebilir ve ölçülebilir. Bu ROS türleri, 480 nm dalga boyu uyarımı ve 610 nm dalga boyu emisyonu 15,16,17 kullanılarak tanımlanır.
Spesifik bir floresan ROS algılama probu seçmeye ek olarak, hücre içi ROS’u ölçmek için hassas bir algılama yöntemi seçmek önemlidir. Bu nedenle, hücre içi ROS seviyelerinin doğru değerlendirilmesi, hastalıklı hücrelerde veya radyasyon, toksikolojik bileşikler ve genotoksik ajanlar gibi çeşitli çevresel stres faktörlerine maruz kalmış hücrelerde meydana gelen bozulmuş redoks dengesi durumlarını belirlemenin anahtarıdır18. ROS, çeşitli hücre sinyal aktivitelerinin düzenlenmesinden sorumlu olan hücrelerde yaygın olarak meydana gelen bir fenomen olduğundan, ROS’un saptanması için sağlam yöntemler gereklidir. Hücreler içindeki ROS üretiminin bu kadar yüksek verimli bir şekilde değerlendirilmesini sağlamak için bu protokol, ROS türlerini ölçmek için yüksek içerikli bir tarama (HCS) platformu kullanır. Mevcut protokol, birçok toksikoloji çalışmasında kritik öneme sahip olan hücre içi ROS üretiminin yüksek verimli analizine izin vermektedir19. Bu protokol, yapışık hepatosellüler karsinom hücrelerinde hücre içi ROS’u saptamak ve ölçmek için kolay ve çok yönlü bir çözüm sağlamayı amaçlamaktadır. H2O2ve menadionun kimyasal reaktifleri, kontrollü ve yüksek verimli bir ortamda ROS üretiminin nispi seviyelerini ölçmek için güçlü ROS stimülatörleri olarak kullanılır. Bu protokol, gerektiğinde uygun koşullar altında yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde ROS üretimini ölçmek için ince ayar yapılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, yüksek içerikli bir tarama sistemi üzerinde dihidroetidyum (DHE) floresan boyası kullanılarak süperoksit kaynaklı hücre içi reaktif oksijen türleri (ROS) üretimini değerlendirmek için bir protokol oluşturulmuştur. Literatürde mevcut olan mevcut protokollerin çoğu, ROS türlerini ölçmek için bir floresan görüntüleme probu olarak DCFH-DA’yı kullanır. Bununla birlikte, çok sayıda çalışma, DCFH-DA’nın hücre içi ROS ölçümü için ideal bir prob olmadığını göstermişti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RK ve RRG, UNM Biyoloji ve Tıpta Metaller Merkezi’nden (CMBM) NIH NIGMS hibesi P20 GM130422 aracılığıyla bir hibe ile desteklenmiştir. RRG, NM-INSPIRES P30 hibesi 1P30ES032755’ten bir pilot ödülle desteklendi. CX7 Cellomics cihazı için görüntüleme çekirdeği desteği, NIH hibe P20GM121176 tarafından finanse edilen AIM merkez çekirdekleri aracılığıyla sağlandı. CX7 Cellomics görüntüleme platformunun kullanımıyla ilgili teknik konulardaki paha biçilmez yardımları için Dr. Sharina Desai ve Dr. Li Chen’e teşekkür ederiz.
Materials
| 1.5 mL centrifuge tubes | VWR | 20170-038 | |
| 96- well plate | Corning Costar | 07-200-90 | |
| Cellomics Cx7 | ThermoFisher | HCSDCX7LEDPRO | |
| Collagen | Advanced Biomatrix | 5056 | |
| DHE (Dihydroethidium) | ThermoFisher | D1168 | |
| DMEM | Sigma | 6046 | |
| FBS | VWR | 97068-085 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | Version 6.0 | |
| HepG2 cell line | ATCC | ||
| Hoechst | ThermoFisher | 33342 | |
| HUH7 cell line | ATCC | ||
| Hydrogen Peroxide | Sigma | 88597 | |
| JHH4 cell line | ATCC | ||
| Menadione | Sigma | M5625 |
References
- Juan, C. A., et al. The chemistry of reactive oxygen species (ros) revisited: Outlining their role in biological macromolecules (DNA, Lipids and Proteins) and induced pathologies. Int J Mol Sci. 22 (9), 4642 (2021).
- Magnani, F., et al. Structure and mechanisms of ROS generation by NADPH oxidases. Curr Opin Struct Biol. 59, 91-97 (2019).
- Collin, F. Chemical basis of reactive oxygen species reactivity and involvement in neurodegenerative diseases. Int J Mol Sci. 20 (10), 2407 (2019).
- Uttara, B., et al. Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options. Curr Neuropharmacol. 7 (1), 65-74 (2009).
- Dikalov, S. I., et al. Electron paramagnetic resonance measurements of reactive oxygen species by cyclic hydroxylamine spin probes. Antioxid Redox Signal. 28 (15), 1433-1443 (2018).
- Wang, Q., et al. Measurement of reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial ROS in AMPK knockout mice blood vessels. Methods Mol Biol. 1732, 507-517 (2018).
- Griendling, K. K., et al. Measurement of reactive oxygen species, reactive nitrogen species, and redox-dependent signaling in the cardiovascular system: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 119 (5), e39-e75 (2016).
- Kalyanaraman, B., et al. Measuring reactive oxygen and nitrogen species with fluorescent probes: challenges and limitations. Free Radic Biol Med. 52 (1), 1-6 (2012).
- Gomes, A., et al. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).
- Halliwell, B., et al. . Free radicals in biology and medicine. , (2015).
- Cho, S., et al. Fluorescence-based detection and quantification of features of cellular senescence. Methods Cell Biol. 103, 149-188 (2011).
- Dikalov, S. I., et al. Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species. Antioxid Redox Signal. 20 (2), 372-382 (2014).
- Kalyanaraman, B., et al. Recent developments in detection of superoxide radical anion and hydrogen peroxide: Opportunities, challenges, and implications in redox signaling. Arch Biochem Biophys. 617, 38-47 (2017).
- Robinson, K. M., et al. Selective fluorescent imaging of superoxide in vivo using ethidium-based probes. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (41), 15038-15043 (2006).
- Zielonka, J., et al. Detection of 2-hydroxyethidium in cellular systems: a unique marker product of superoxide and hydroethidine. Nat Protoc. 3 (1), 8-21 (2008).
- Nazarewicz, R. R., et al. Rapid and specific measurements of superoxide using fluorescence spectroscopy. J Biomol Screen. 18 (4), 498-503 (2013).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nat Metab. 4 (6), 651-662 (2022).
- Ameziane-El-Hassani, R., et al. Detection of reactive oxygen species in cells undergoing oncogene-induced senescence. Oncogene-Induced Senescence: Methods Protoc. 1534, 139-145 (2017).
- Abraham, , et al. High content screening applied to large-scale cell biology. Trends Biotechnol. 22 (1), 15-22 (2004).
- Criddle, D. N., et al. Menadione-induced reactive oxygen species generation via redox cycling promotes apoptosis of murine pancreatic acinar cells. J Biol Chem. 281 (52), 40485-40492 (2006).
- Goffart, S., et al. The type and source of reactive oxygen species influences the outcome of oxidative stress in cultured cells. Cells. 10 (5), 1075 (2021).
- Kurutas, E. B. The importance of antioxidants which play the role in cellular response against oxidative/nitrosative stress: current state. Nutr J. 15 (1), 71 (2015).
- Shad, K. F., Das, T. K. Introductory Chapter: Role of Fenton and Haber-Weiss Reaction in Epilepsy. Epilepsy-Seizures without Triggers. IntechOpen. , (2023).
