Summary
I denne protokollen utviklet vi en kationisk nanoemulsjon-innkapslet retinsyre (RA) som skal brukes som en adjuvans for å fremme antigenspesifikke systemiske og mukosale responser. Ved å legge til FDA-godkjent RA til nanoemulsjonen ble antigen-spesifikk sIgA fremmet i skjeden og tynntarmen etter intramuskulær injeksjon av nanoemulsjonen.
Abstract
Kationiske nanostrukturer har dukket opp som et adjuvans og antigenleveringssystem som forbedrer dendritisk cellemodning, ROS-generering og antigenopptak og fremmer deretter antigenspesifikke immunresponser. I de senere år har retinsyre (RA) fått økende oppmerksomhet på grunn av sin effekt ved å aktivere slimhinneimmunresponsen; For å kunne bruke RA som slimhinneadjuvans, er det imidlertid nødvendig å løse problemet med oppløsning, lasting og levering. Her beskriver vi et kationisk nanoemulsjon-innkapslet retinsyre (CNE-RA) leveringssystem sammensatt av det kationiske lipidet 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOTAP), retinsyre, skvalen som oljefase, polysorbat 80 som overflateaktivt middel og sorbitantrioleat 85 som co-overflateaktivt middel. Dens fysiske og kjemiske egenskaper ble karakterisert ved hjelp av dynamisk lysspredning og et spektrofotometer. Immunisering av mus med blandingen av antigen (ovalbumin, OVA) og CNE-RA økte signifikant nivåene av anti-OVA-sekretorisk immunoglobulin A (sIgA) i vaginal skyllevæske og tynntarmsskyllevæske hos mus sammenlignet med OVA alene. Denne protokollen beskriver en detaljert metode for fremstilling, karakterisering og evaluering av den adjuvante effekten av CNE-RA.
Introduction
Adjuvans brukes ofte til å forbedre effekten av en vaksine ved å stimulere immunsystemet til å reagere sterkere på vaksinen, og dermed øke immuniteten mot et bestemt patogen1. Nanoemulsjon (NE) adjuvans refererer til et kolloidalt dispersjonssystem med termodynamisk stabilitet ved å emulgere en viss andel oljefase og vandig fase for å produsere en emulsjon i form av vann-i-olje (W / O) eller olje-i-vann (O / W) 2. O / W nanoemulsjonsadjuvans kan produsere cytokiner og kjemokiner på injeksjonsstedet, indusere rask aggregering og spredning av viktige immunceller som monocytter, nøytrofiler og eosinofiler, og forbedre immunresponsen og forbedre immunogeniteten til antigener3. For tiden har tre nanoemulsjonsadjuvanser (MF59, AS03 og AF03) blitt lisensiert for bruk i vaksiner og har vist god sikkerhet og effekt4.
Imidlertid har slimhinneimmunitet blitt dårlig ivaretatt av de nåværende godkjente adjuvante formuleringene i konvensjonell parenteral vaksinasjon5. Retinsyre (RA) har blitt rapportert å indusere intestinal homing av immunceller, men dens lave polaritet, dårlig oppløselighet i vann og dårlig lys og termisk stabilitet begrenser bruken til robust enterisk vaksinasjon. Nanoemulsjoner gir muligheter til å øke biotilgjengeligheten av svært lipofile stoffer, og oljekjernen av O / W-emulsjonsadjuvanser er egnet for oppløsning av ikke-polare stoffer som RA6. Derfor kan nanoemulsjoner brukes som bærere for RA for å oppnå den doble responseffekten av systemisk immunitet og slimhinneimmunitet.
Sammenlignet med nøytrale eller anioniske leveringssystemer har kationiske leveringssystemer relativt effektive antigeninnkapslings- og leveringsevner, noe som kan forbedre immunogeniteten til antigener 7,8,9. Den kationiske overflateladningen til en rekke adjuvante systemer er viktig for deres adjuvante effekter 10,11,12. Den kationiske ladningen er en viktig faktor for å forlenge vaksineretensjonen på injeksjonsstedet, øke antigenpresentasjonen og forlenge stimuleringen av cellulær immunitet i kroppen12.
Basert på de ovennevnte betraktningene utviklet vi en kationisk nanoemulsjon for effektivt å levere RA og antigener. Partikkelstørrelsen og zetapotensialet til nanoemulsjonen ble bestemt ved bruk av dynamisk lysspredning (DLS), og de systemiske og mukosale immunresponsene til nanoemulsjonen kombinert med OVA ble evaluert ved intramuskulær injeksjon13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøkene ble utført i samsvar med Veiledning til bruk og stell av forsøksdyr og godkjent av Forsøksdyrvelferd og etikkomiteen ved det tredje militære medisinske universitetet.
1. Fremstilling av nanoemulsjoner (NE)
- For vandig fasefremstilling, oppløs 0,15 g polysorbat 80 i 28,2 ml fosfatbufret saltvann (PBS) under omrøring ved 40 °C.
- For oljefasefremstilling, bruk oljefaseformuleringen av nanoemulsjonen vist i tabell 1. Løs opp sornitan trileate 85, DOTAP og RA i skvalen under omrøring ved 40 °C.
- For primær O / W-emulsjonsforberedelse, rør oljefasen magnetisk ved 1400 o / min mens du tilsetter den vandige sakte og dråpevis med en hastighet på 1 ml / min. Pre-emulgere blandingen ved hjelp av en høy skjæremulgator ved 30.000 o / min i 6 minutter.
- For høytrykkshomogenisering (HPH), behandle den primære O / W-emulsjonen fremstilt ovenfor med en høytrykkshomogenisator i 12 sykluser ved 900 bar for å oppnå en homogen nano-emulsjon i 160-190 nm-området.
- På slutten av prosessen samler du emulsjonen i en 50 ml kolbe og filtrersteriliserer emulsjonen gjennom en 0,2 μm PES-filtermembran.
- Koble kolben til Schlenk Line gjennom kateteret, drei treveis stoppekranen for å koble systemet til vakuumrøret og slå på vakuumpumpen for å skape vakuum i kolben. Deretter roterer du treveis stoppekran, kobler systemet til Argon-røret og fyller det med Argon. Gjenta dette trinn 3x for å sikre at kolben er fylt med Argon.
- Bytt kork og forsegl med en parafinfilm, pakk kolben inn i tinnfolie og oppbevar den ved 4 °C.
2. Karakterisering av nanoemulsjonene
- Partikkelstørrelse og zeta potensiell deteksjon
- Slå PÅ instrumentet og vent i 30 minutter til laserlyskilden stabiliserer seg.
- Fortynn NE 50 ganger med ultrarent vann og tilsett 1 ml prøve til den tilsvarende prøvecellen.
- For å måle partikkelstørrelsen, sett temperaturen til 25 °C, velg vann som dispergeringsmedium, og velg engangs plastfat som målecelle. Last inn prøvene og mål automatisk. Rapporter middelverdien av tre gjentatte målinger for hver prøve som det endelige resultatet.
- For måling av zetapotensial, sett temperaturen til 25 °C. På grunn av valget av den vandige fase som dispersjonsmedium, velg Smoluchowsi-modellen og den brettede kapillærcellen som målecelle. Last inn prøvene og mål automatisk. Rapporter gjennomsnittet av tre replikerte målinger for hver prøve som det endelige resultatet.
- Bestemmelse av innkapslingshastighet og legemiddelbelastningshastighet
- For å bestemme mengden RA lastet i NE, bruk absolutt etanol for å demulgere og trekke ut RA fra NE. Til 5 μL prøve, tilsett 995 μL etanol og bestem RA-innholdet i løsningen ved hjelp av et spektrofotometer ved 355 nm. Sammenlign absorbansen med en standardkurve. Bruk følgende formel:
Innkapsling = faktisk RA-belastning / vekt av tilsatt legemiddel
Medikamentbelastningshastighet = faktisk RA-belastning / prøvens kvalitet
- For å bestemme mengden RA lastet i NE, bruk absolutt etanol for å demulgere og trekke ut RA fra NE. Til 5 μL prøve, tilsett 995 μL etanol og bestem RA-innholdet i løsningen ved hjelp av et spektrofotometer ved 355 nm. Sammenlign absorbansen med en standardkurve. Bruk følgende formel:
3. Immuniseringsprosedyrer og prøveinnsamling
- Immuniseringsprosedyre og gruppering
- Gruppe kvinnelige Balb / C-mus i alderen 6-8 uker og veier ca. 18-21 g i sett med 5 for immunisering på dag 0, dag 14, dag 28 i henhold til følgende eksperimentelle grupper: (1) PBS-gruppe, (2) ovalbumin (OVA) gruppe, (3) OVA+ NE-RA (OVA / NE-RA) gruppe, (4) OVA+CNE-RA(OVA/CNE-RA) gruppe.
- Immuniser alle mus ved intramuskulær injeksjon i de øvre quadriceps-musklene med 200 μL forskjellige vaksineformuleringer: 100 μL emulsjon og 15 μg OVA absorbert i 100 μL PBS, blandet før administrering. Injiser 100 μL/bakben. For mus i kontrollgruppen administreres PBS alene.
- Eutanasi: Avliving av alle mus ved en intraperitoneal injeksjon på 100 mg/kg med 1 % natriumpentobarbital 2 uker etter fullført tre vaksinasjoner.
- Prøveinnsamling og behandling: Etter eutanasi, bruk saks til å kutte opp brystet til mus og sett en sprøyte direkte inn i hjertet for å aspirere ca. 0,5 ml fullblod. La blodet stå i 2 timer ved romtemperatur og deretter sentrifugere ved 1800 x g i 5 minutter ved 4 °C. Samle serum, alikot og oppbevar ved -80 °C for videre analyse.
- Samle fullblod, milt, vaginal skyllevæske (VLF), bronkoalveolær skyllevæske (BALF), neseskyllevæske (NLF) og tynntarmskyllevæske (SILF).
- Isolering av milt lymfocytter
- Bløtlegg mus i etanol 75% (v / v) for en kort sterilisering, overfør musene til en ren benk. Klipp huden på venstre underliv med saks, utsett og fjern milten.
- Plasser milten i en petriskål som inneholder 3 ml PBS, slip og filtrer i et 15 ml sentrifugerør ved hjelp av en sil (200 mesh, 70 μm) og slipestang.
- Sentrifuger cellene ved 650 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og suspender bunnfallet med 3 ml rødblodcellelyseoppløsning, inkuber ved romtemperatur i 5 minutter.
- Tilsett 10 ml PBS til røret og rist godt for å avslutte reaksjonen, sentrifuge den deretter ved 650 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
- Kast supernatanten og resuspender cellene i 10 ml PBS, tilsett 20 μL av cellefortynningen til den automatiserte celletelleren for celletelling.
- Sentrifuger cellene ved 650 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Kast supernatanten og fortynn cellene til 1 x 106 celler/ml med 1640 komplett medium (1% penicillin-streptomycin, 10% føtal bovint serum).
- VLF-oppsamling: Skyll skjeden 4x med 75 μL 1 % BSA/PBST, kombiner skylleløsningen og samle i 1,5 ml sentrifugerør, sentrifuger ved 5000 x g ved 4 °C i 20 minutter og samle supernatanten med en pipette og oppbevar ved -80 °C.
- BALF og NLF samling
- Desinfiser musene etter ofring med 75% (v / v) etanol. Hold musen magen opp og rett nakken. Bruk saks til å lage et langsgående snitt i musehalsens hud og bruk tang for å skille musklene og eksponere luftrøret tilstrekkelig.
- Skjær luftrøret gjennom en liten tverrgående åpning og sett slangen mot lungene, fest sprøyten til slangen og injiser 0,5 ml PBS i lungene og trekk den ut, gjenta skyllingen 3x og sentrifugen ved 650 x g ved 4 °C i 5 minutter, oppbevar supernatanten (BALF) ved -80 °C.
- Omvendt slangen til nesehulen, fest sprøyten til slangen og injiser 0,5 ml PBS, væsken vil strømme gjennom nesehulen inn i 1,5 ml sentrifugerøret. Aspirer vasken fra sentrifugerøret og gjenta skyllet 2x, deretter sentrifuge ved 650 x g ved 4 °C i 5 minutter, oppbevar supernatanten (NLF) ved -80 °C.
- SILF-kolleksjon
- Klargjør PBS-oppløsning inneholdende 0,1 mg/ml trypsinhemmer, 50 mM/L EDTA-2Na, 1 mM/L fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) som tynntarmsskylleløsning. Rør i romtemperatur for å løse opp og oppbevar ved 4 °C.
- Klipp tynntarmen åpen langs tarmrøret og senk ned i 3 ml tynntarmsvæske. Bland ved vertikal risting ved 15 o / min i 30 minutter ved 4 ° C. Sentrifuge ved 1440 x g ved 4 °C i 20 minutter og samle supernatanten med en pipette, deretter sentrifugere ved 5000 x g ved 4 °C i 20 minutter. Oppbevar supernatanten (SILF) ved -80 °C.
4. Evaluering av OVA-spesifikk antistoffrespons etter intramuskulær administrering
- Bestemme serumnivåer av IgG, subklasser av IgG1, IgG2a og nivåene av spesifikk sIgA i VLF, BALF, NLF og SILF ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA).
- For antigenbelegg, fortynn OVA til 5 μg/ml med beleggbuffer, og belegg 96-brønns ELISA-plater over natten ved 4 °C med 100 μL OVA-løsning per brønn.
- Vask ELISA-platene 5x med PBST og blokk ved inkubasjon med 250 μL 1%BSA/PBST ved 37 °C i 2 timer.
- Vask ELISA-platene 5x med PBST, tilsett deretter 100 μL av prøven fortynnet som beskrevet nedenfor for å bli testet og inkuber ved 37 ° C i 1 time. Fortynnet serum, VLF, BALF, NLF med 0,5 % BSA/PBST, fortynnet SILF med 20 % kalveserum (FCS)/PBST.
- Start med å fortynne serumet 1000x ved hjelp av en to-trinns fortynningsprosedyre: fortynn 20 μL serum til 1 ml, fortynn deretter 25 μL av dette fortynnede serumet til 500 μL. Bruk denne fortynningen av serum for påvisning av IgG1, IgG2a.
- Tilsett 200 μL av serumet fortynnet ved 1000x til den første raden av den belagte platen og tilsett 100 μL 0,5 % BSA/PBST til alle brønnene unntatt den første raden. Overfør 100 μL fra første rad til andre rad og bland 10x med pipetten. Gjenta dette trinnet opp til rad 8 og kast 100 μL væske, serumet med forskjellige konsentrasjoner er oppnådd for påvisning av IgG.
- Utfør en 1:1-fortynning av BALF, NLF og SILF for å oppdage IgA. Bruk samme fortynningsprosedyre for VLF som for serum.
- Vask ELISA-platene 5x med PBST. Tilsett 100 μL HRP-konjugert geitantimus IgG/IgG1/IgG2a/IgA (fortynnet 1:10000 med PBST) til passende brønner og inkuber ved 37 °C i 40 minutter.
- Vask ELISA-platene 5x med PBST, tilsett 100 μL TMB ELISA-substrat (svært følsomt), og overfør platen til et sted som er beskyttet mot lys i 5 minutter. Tilsett umiddelbart 100 μL av 450 nm stoppløsning for TMB-substrat for å stoppe reaksjonen.
- Mål absorbansen (OD) ved 450 nm for hver brønn og beregn antistofftiteren ved å ta 2,1 ganger serumverdien til den tomme gruppemusen som positiv responsverdi.
5. ELISpot-analyse
- Følg retningslinjene for ELISpot Plus, bruk Mouse IFN-γ (ALP) fra settet for å utføre analysene.
- Ta platen ut av den forseglede pakningen og vask 4x med steril PBS (200 μL/brønn). Kondisjoner platen med 1640 komplett medium (200 μL / brønn) og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fjern mediet og tilsett den justerte konsentrasjonen av lymfocyttsuspensjonen tilberedt i trinn 3.2.2 (100 μL/brønn) på platen, og tilsett deretter 100 μL av stimulansen, dvs. 1640 komplett medium inneholdende 20 μg/ml OVA257~264 eller OVA323~339 eller 1640 komplett medium. Legg platen i en fuktet inkubator ved 37 °C med 5 % CO2 i 48 timer. Pakk platen med aluminiumsfolie for å unngå fordampning.
- Kast cellesuspensjonen og vask platen 5x med PBS (200 μL / brønn). Fortynn deteksjonsantistoffet (R4-6A2-biotin) til 1 μg / ml i PBS inneholdende 0,5% føtal kalveserum (PBS-0,5% FCS). Tilsett 100 μL/brønn og inkuber i 2 timer ved romtemperatur.
- Vask platen som i trinn 5.2. Fortynn streptavidin-ALP (1:1000) i PBS-0,5 %FCS og tilsett 100 μL/brønn, inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Vask platen som i trinn 5.2. Filtrer den bruksklare substratløsningen (BCIP/NBT-plus) gjennom et 0,45 μm filter og tilsett 100 μL/brønn. Utvikle til forskjellige flekker dukker opp.
- Stopp fargeutviklingen ved å vaske mye i vann fra springen, fjern mykplasten og la platen tørke.
- Inspiser og tell flekker i en ELISpot-leser.
6. Statistisk analyse
- Analyser forskjellene mellom data fra 4 grupper ved enveis ANOVA etterfulgt av Tukey flere sammenligninger etter test. Uttrykk alle resultatene som gjennomsnitt ± SD. P-verdi mindre enn 0,05 ble ansett som signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Totalt ble fire nanoemulsjonsformuleringer fremstilt og karakterisert ved deres partikkelstørrelse (figur 1), deres zetapotensial og deres innkapslingseffektivitet som presentert i tabell 2. Partikkelstørrelsen ble konsentrert rundt 160-190 nm, og tilsetningen av DOTAP reverserte Zeta-potensialet for nanoemulsjon. OVA-spesifikt serum-IgG og dets subgruppeantistoffnivå i serum ble påvist 2 uker etter tredje immunisering. Nanoemulsjonsadjuvansvaksinen økte signifikant OVA-spesifikke IgG-, IgG1- og IgG 2a-antistofftitere i serum (figur 2). Enda viktigere var det at nivåene av spesifikk sIgA i vaginalskyllevæske og tynntarmskyllevæske ble signifikant forsterket når OVA ble adjuvansert med CNE-RA (figur 3). I ELISpot-analysen ble det ikke funnet noen signifikante flekker.
Figur 1: Størrelse, diameter og fordeling. (A) Størrelse, diameter og fordeling av NE-RA. (B) Størrelse, diameter og fordeling av CNE-RA. D.nm er den gjennomsnittlige diameteren av partiklene i nm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: OVA-spesifikt serum IgG og dets subgruppeantistoffnivåer i serum. OVA-spesifikt serum IgG og dets subgruppeantistoffnivåer i serum 2 uker etter at de tre immuniseringene ble fullført. (A) Log2-verdien til IgG-titerne. (B) IgG1 optisk tetthet ved 450 nm. (C) IgG2a optisk tetthet ved 450 nm. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n=5), ***: P<0,001. Sammenligninger av forskjellene mellom gruppene og PBS-gruppen er vist rett over kolonnene i figuren og er angitt som følger: ns: ingen signifikans, #p<0.05, ###p<0.001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: OVA-spesifikk sIgA. OVA-spesifikk sIgA i vaginal skyllevæske, bronkoalveolær skyllevæske, neseskyllevæske, liten tarmskyllevæske. (A) Vaginal skyllevæske, (B) bronkoalveolær skyllevæske, (C) neseskyllevæske og (D) tynntarmskyllevæske. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SD (n=5), ns: ingen signifikans, *p<0,05; s<0.001. Sammenligninger av forskjellene mellom gruppene og PBS-gruppen er vist rett over kolonnene i figuren og er angitt som følger: ns: ingen signifikans, ###p<0.001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Eksempel | Squalene | Sorbitan trioleat 85 | DOTAP | RA |
| NE-RA | 1,5 g | 0,15 g | 0 | 60 mg |
| CNE-RA | 1,5 g | 0,15 g | 45 mg | 60 mg |
Tabell 1: Oljefaseformuleringen av NE.
| Eksempel | Partikkelmiddelstørrelse (nm) | Polydispersitetsindeks | Zeta-potensial (mV) | Innkapsling effektivitet (%) | Medikamentell belastningshastighet (mg / ml) |
| NE-RA | 182.9±3.4 | 0,18±0,02 | -23.0±0.2 | 40 | 0.8 |
| CNE-RA | 162.7±4.2 | 0,16±0,01 | 42,2±0,5 | 40 | 0.8 |
Tabell 2: Fysisk-kjemiske egenskaper ved NE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen utviklet vi en kationisk nanoemulsjon-innkapslet retinsyre som skal brukes som en adjuvans for å fremme antigenspesifikke systemiske og mukosale responser. Sammenlignet med tradisjonelle NE-adjuvanser har den følgende to fordeler. For det første har overflaten av O / W NE generelt en høy negativ ladning, noe som gjør det vanskelig å laste antigener direkte. Kationiske NØ kan effektivt adsorbere peptid- eller proteinantigener og forbedre den spesifikke immunogenisiteten. For det andre har erfaring fra tradisjonell vaksineforskning vist at det er vanskelig å stimulere slimhinneresponsen ved subkutan eller intramuskulær injeksjon5. Ved å legge til FDA-godkjent RA til nanoemulsjonen 14,15,16, ble OVA-spesifikk sIgA fremmet i skjeden og tynntarmen ved intramuskulær injeksjon. Denne protokollen er ikke validert i andre antigener bortsett fra OVA. I fremtidige studier kan dyremodeller av tarmrelaterte sykdommer brukes til å evaluere effekten og mekanismen til CNE-RA for å forbedre vaksinebeskyttelsen.
Høytrykkshomogenisering, skjærblanding og ultralydbehandling er de vanligste høy-energi emulgeringsmetodene som brukes til å fremstille NE, med høytrykkshomogenisering som gir den beste homogeniteten17. Imidlertid krever høytrykkshomogeniseringsmetoder ofte dyrt spesialutstyr, med høye forberedelseskostnader og ikke-ubetydelige kjøleproblemer18. I våre tidligere eksperimenter ble det funnet at homogeniseringstrykket og antall sykluser hadde en effekt på partikkelstørrelsen til NE, og innenfor et visst område, jo høyere homogeniseringstrykk og jo høyere antall sykluser, desto mindre hadde partikkelstørrelsen en tendens til å være. Fremstillingen av olje-i-vann-emulsjonskolostrum omdanner effektivt olje- og vannfasene til store dråper og reduserer antall homogeniseringssykluser. Hvis dette trinnet utelates, kan økning av antall homogeniseringssykluser til slutt resultere i nano-emulsjoner med samme partikkelstørrelse og dispersjon. Erstatning av PBS i vannfasen med 0,9 % saltvann eller natriumcitratbuffer hadde ingen effekt på partikkelstørrelsen og dispersjonen av NE.
Flere kationiske lipider brukes bredt i vaksinedesign19, DOTAP ble valgt for at den er godkjent for klinisk bruk, viser god sikkerhet og tolereres godt. Overdreven positiv ladning på NØ-overflaten kan føre til cytotoksisitet. Av sikkerhetsmessige årsaker må typen og mengden kationiske lipider tas i betraktning ved utarbeidelse av kationiske NE. Andre kationiske lipider som ofte brukes i vaksinestudier er DLin-MC3-DMA ((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraen-19-yl4-(dimetylamino)butanoat)20, DMG-PEG2000 (1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000), DOTMA (N,N,N-trimetyl-2,3-bis(octadec-9-en-1-yloxy)propan-1-aminiumklorid)21, DC-Chol (3β- [N-(N′,N′-dimetylaminoetan)-karbamoyl]kolesterolhydroklorid)22, og om de kan brukes til å forberede kationiske NEer må undersøkes nærmere.
I de senere år har RA tiltrukket seg oppmerksomhet på grunn av sin evne til å indusere immuncellehoming til tarmslimhinnen gjennom ulike veier, men RA er ikke bare dårlig vannløselig, men også ustabil til lys og oksygen. Under forberedelse og lagring av NE, bør det tas konstant hensyn til beskyttelse av RA fra lys og oksygen. RA vil raskt bli oksidert og dekomponert når den utsettes for lys og oksygen, og til slutt miste sin adjuvante effekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter i dette arbeidet.
Acknowledgments
Denne studien ble finansiert av Key Program of Chongqing Natural Science Foundation (nr. cstc2020jcyj-zdxmX0027) og Chinese National Natural Science Foundation Project (nr. 32270988).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
| Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
| DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
| ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
| Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
| Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
| Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
| High pressure homogenizer | ATS | ||
| MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
| MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
| OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
| Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
| retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
| Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
| T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
| TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
| trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
References
- Pulendran, B., Arunachalam, P. S., O'Hagan, D. T. Emerging concepts in the science of vaccine adjuvants. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 454-475 (2021).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: A novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Pat Nanotech. 14 (4), 276-293 (2020).
- Chen, W. L., et al. Disintegration and cancer immunotherapy efficacy of a squalane-in-water delivery system emulsified by bioresorbable poly(ethylene glycol)-block-polylactide. Biomaterials. 35 (5), 1686-1695 (2014).
- Iwasaki, A., Omer, S. B. Why and how vaccines work. Cell. 183 (2), 290-295 (2020).
- Spadoni, I., Fornasa, G., Rescigno, M. Organ-specific protection mediated by cooperation between vascular and epithelial barriers. Nat Rev Immunol. 17 (12), 761-773 (2017).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. J Cont Release. 252, 28-49 (2017).
- Yan, W. L., Chen, W. S., Huang, L. Mechanism of adjuvant activity of cationic liposome: Phosphorylation of a MAP kinase, ERK and induction of chemokines. Mol Immunol. 44 (15), 3672-3681 (2007).
- Korsholm, K. S., et al. The adjuvant mechanism of cationic dimethyldioctadecylammonium liposomes. Immunology. 121 (2), 216-226 (2007).
- Agger, E. M., et al. Cationic liposomes formulated with synthetic mycobacterial cordfactor (CAF01): A versatile ddjuvant for vaccines with different immunological requirements. Plos One. 3 (9), e3116 (2008).
- Slutter, B., et al. Nasal vaccination with N-trimethyl chitosan and PLGA based nanoparticles: Nanoparticle characteristics determine quality and strength of the antibody response in mice against the encapsulated antigen. Vaccine. 28 (38), 6282-6291 (2010).
- Nochi, T., et al. Nanogel antigenic protein-delivery system for adjuvant-free intranasal vaccines. Nat Mater. 9 (8), 685-685 (2010).
- Henriksen-Lacey, M., et al. Liposomal cationic charge and antigen adsorption are important properties for the efficient deposition of antigen at the injection site and ability of the vaccine to induce a CMI response. J Control Release. 145 (2), 102-108 (2010).
- Zhong, X. F., et al. Nanovaccines mediated subcutis-to-intestine cascade for improved protection against intestinal infections. Small. 18 (1), e2105530 (2022).
- Mora, J. R., et al. Generation of gut-homing IgA-secreting B cells by intestinal dendritic cells. Science. 314 (5802), 1157-1160 (2006).
- Iwata, M., et al. Retinoic acid imprints gut-homing specificity on T cells. Immunity. 21 (4), 527-538 (2004).
- Hammerschmidt, S. I., et al. Retinoic acid induces homing of protective T and B cells to the gut after subcutaneous immunization in mice. J Clin Invest. 121 (8), 3051-3061 (2011).
- Burger, C., Shahzad, Y., Brümmer, A., Gerber, M., du Plessis, J.
- Lodaya, R. N., et al. Formulation design, optimization and evaluations of an α-tocopherol-containing self-emulsified adjuvant system using inactivated influenza vaccine. J Cont Release. 316, 12-21 (2019).
- Carmona-Ribeiro, A. M., Pérez-Betancourt, Y. Cationic nanostructures for vaccines design. Biomimetics. 5 (3), 32 (2020).
- Lam, K., et al. trialkyl ionizable lipids are versatile lipid-nanoparticle components for therapeutic and vaccine applications. Adv Mater. 35 (15), e2209624 (2023).
- Nie, T. Q., et al. Surface coating approach to overcome mucosal entrapment of DNA nanoparticles for oral gene delivery of glucagon-like peptide 1. Acs Appl Mater Inter. 11 (33), 29593-29603 (2019).
- Lou, G., et al. Delivery of self-amplifying mRNA vaccines by cationic lipid nanoparticles: The impact of cationic lipid selection. J Cont Release. 325, 370-379 (2020).
