Summary
我们提出了一种在小鼠模型中将荧光标记的氧化铁纳米颗粒递送至胶质母细胞瘤的双光子显微镜的新方法。
Abstract
静脉注射癌症治疗药物对脑肿瘤的递送受到血脑屏障的限制。一种在 体内 直接成像脑肿瘤中大分子积累和分布的方法将大大提高我们在临床前模型中理解和优化药物递送的能力。该协议描述了一种在胶质母细胞瘤(GBM)小鼠模型中使用双光子活体显微镜(2P-IVM)对静脉内施用的荧光标记纳米颗粒进行实时 体内 跟踪的方法。
该协议包含对程序的多步骤描述,包括实验动物的麻醉和镇痛、创建颅窗、GBM 细胞植入、放置头杆、进行 2P-IVM 研究以及长期随访研究的术后护理。我们展示了具有代表性的2P-IVM成像会议和图像分析,研究了该技术的优缺点,并讨论了潜在的应用。
该方法可以很容易地修改和适应 体内 临床前脑成像领域的不同研究问题。
Introduction
双光子活体显微镜 (2P-IVM) 是一种荧光成像技术,可实现活组织1 的可视化。
2P-IVM 于 1990 年代首次开发,已用于视网膜2、肾脏3、小肠4、耳蜗5、心脏6、气管7 和各种临床前模型的大脑的体内分析 8,9。在神经科学领域,2P-IVM 作为一种对清醒动物健康大脑进行实时成像的技术10 以及研究神经系统疾病(如阿尔茨海默氏症11、帕金森氏症12 和胶质母细胞瘤 (GBM)13、14、15、16)的重要性。
2P-IVM为研究GBM发展过程中的肿瘤微环境提供了一种优雅的解决方案。虽然以前的一些研究集中在 体外17 和 离体 模型18,但其他研究则实施了原位19 和异源性20 体内 模型来检查 GBM。Madden 等人在小鼠模型13 中对 CNS-1 大鼠神经胶质瘤细胞系进行了天然成像。Ricard等人使用原位GL261-DsRed小鼠模型,静脉注射荧光基团以增强2P-IVM14中肿瘤区域的血管。
在这里,我们应用 2P-IVM 来跟踪 GBM 原位小鼠模型中荧光标记的氧化铁纳米颗粒 (NP) 的肿瘤递送。使用颅窗,这种方法使我们能够详细研究大脑中NP的实时时空分布。
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Protocol
本协议中描述的动物程序符合实验动物护理管理小组 (APLAC) 的要求。
1. 细胞培养
- 罩子的准备
- 洗手,戴手套和实验室外套。打开生物安全柜并将窗扇水平设置为适当的打开高度。让抽油烟机吹扫 3-5 分钟。用 70% 乙醇喷洒引擎盖区域,然后用纸巾擦拭。
- 用70%乙醇喷洒所有试剂,并用薄纸擦拭。将试剂移入罩中。不要在烤架上放任何物品。如果引擎盖发生溢出,请用湿巾盖住,喷上 70% 乙醇,然后再次擦拭。
- 实验结束后,小心地盖上每件物品的盖子,擦拭所有材料,从抽油烟机中取出任何物品,并将它们转移到原来的位置。在抽油烟机中喷洒 70% 乙醇并擦拭。关闭窗扇并关闭生物安全柜。
- 生长培养基的制备
- 将 50 mL 100% 胎牛血清 (FBS) 加入 500 mL Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中。加入 5 mL 抗生素-抗真菌溶液 (100x)。
- 将所有试剂通过无菌的 500 mL 过滤瓶(0.22 μm 过滤器)。
- 冻存细胞的解冻
- 在层流罩中,向 T75 培养瓶中加入 20 mL 生长培养基。在烧瓶上标上细胞名称、日期和传代号。在这项研究中,使用了贴壁的 C6 神经胶质瘤细胞。
- 在37°C水浴中快速解冻细胞。不要涡旋细胞。解冻并立即使用细胞。
- 使用 1 mL 移液器吸头将解冻的细胞转移到 T75 烧瓶中。注意不要在转移过程中引入任何气泡,并避免在烧瓶颈部留下任何介质残留物。这可能会增加可能的污染风险。
- 更换介质
- 在解冻后的第二天更换培养基以除去任何残留的胰蛋白酶或二甲基亚砜(DMSO)(步骤1.6)。之后,每周至少更换培养基两次或更多次,具体取决于细胞汇合水平。传代后一天必须更换培养基以消除胰蛋白酶。
- 要更换培养基,请打开抽吸装置,连接吸液玻璃移液管,然后吸出所有培养基。
- 加入 20 mL 生长培养基(步骤 1.2)。
- 传代细胞
- 在抽油烟机上装上实验过程中需要的物品。
- 使用抽吸玻璃移液管吸出所有培养基,确保玻璃移液管位于烧瓶的非细胞侧。对于此步骤,垂直放置 T75 烧瓶。
- 在非细胞侧加入 ~10 mL 室温 (RT) 磷酸盐缓冲盐水(不含 PBS、Ca++ 和 Mg++ )或 Hanks 平衡盐溶液(不含 HBSS、Ca++ 和 Mg++ )。通过将T75烧瓶水平放置,细胞面朝下,用PBS短暂洗涤细胞。
- 立即垂直放置烧瓶并吸出 PBS/HBSS。重复洗涤和吸气 3 次。
- 在细胞侧加入 2 mL 胰蛋白酶(重组或动物来源)(T75 烧瓶水平,细胞侧朝下)。在标准组织培养箱(37°C,5%CO2)中孵育4分钟。2 分钟后使用 5 mL 移液管研磨一次。
- 总孵育 4 分钟后,将溶液转移到 15 mL 锥形管中。向锥形管中加入 8 mL 生长溶液(2 mL 胰蛋白酶化细胞 + 8 mL 培养基 = 总共 10 mL)。
- 使用另一个带有过滤器的空 15 mL 锥形管,并通过 25 mL 移液管转移细胞以获得单个细胞。
- 将 1/10 (1 mL) 溶液(细胞 + 培养基 + Tryp-LE)转移到装有 20 mL 培养基的 T75 培养瓶中。或者,对单元格进行计数(步骤1.7)。第二天更换培养基以获得非胰蛋白酶培养基溶液。
- 冷冻培养基和细胞
- 在4°C冰箱中解冻100%FBS。不要使用水浴或加热,因为这可能会损害FBS中的蛋白质。
- 要制备 50 mL 冷冻培养基,请混合 45 mL DMEM、5 mL FBS 和 5 mL DMSO。将其等分到 1-2 mL 容器中,以防止间歇性解冻和蛋白质损伤。将它们储存在-20°或-80°C冰箱中。
- 对于剩余的 9 mL 溶液(步骤 1.5),加入 1 mL 培养基,共达到 10 mL。以300× g 离心4分钟。
- 除去上清液并重悬于1mL冷冻培养基中(见上文)。将细胞置于-80°C冰箱中的冷冻容器中。1 或 2 天后将细胞移至液体 N2 中长期储存。
- 计数细胞
- 对于剩余的 9 mL(步骤 1.5),加入 1 mL 培养基以达到总共 10 mL。以300× g 离心4分钟。
- 取出上清液并重悬于4 mL HBSS中。将 10 μL 细胞重悬于 80 μL HBSS + 10 μL 0.4% 台盼蓝中,稀释因子 = 10。
- 取 17 μL 溶液,在血细胞计数器中计数 4 个 4 x 4 方块。四个 4 x 4 正方形的平均计数乘以 104x 稀释因子得到细胞/mL。
2. 手术
注意:建议由两名研究人员进行手术,其中一人负责准备细胞、混合牙水泥并通常协助手术,而第二人则专注于保持无菌。拥有第二个机械手来协助外科手术,大大降低了发生污染的可能性。遵循最佳手术实践将减少术后并发症的机会。 图1A 概述了颅窗的组成部分。
- 一般准备工作
- 在开始之前,请确认该程序已获得当地动物福利机构指南的批准。
注:本研究使用了 5 个月大的雌性 NSG 小鼠 (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5)。 - 手术前,高压灭菌所有手术器械,并确保所有必要的用品都可用。打印麻醉和手术记录。
- 确保动物在抵达后至少有 1 周的适应动物饲养室,以减少额外的术后痛苦。
- 在手术当天,确保所有设备(显微镜、加热垫、灭菌器、钻头、真空吸尘器等)都准备好使用。确认麻醉机含有足够的异氟醚,必要时重新填充。对于新用户,每只动物的颅窗手术最多可能需要 2 小时;因此,拥有足够的异氟醚至关重要。
- 将玻璃窗和头杆放入酒精中,并准备一个装有盐水的容器。这将确保工作流程顺利进行,而不会出现任何重大的无菌问题,并尽可能缩短每只动物的麻醉时间。
- 在工作站的无菌表面上打开所有手术材料。例如,无菌纱布包装的内部可用于此目的。使用仅提示技术。不使用手术器械时,将尖端放在无菌表面上,例如无菌纱布包装的内部。
- 进行多次手术时,在两次手术之间将所有手术器械放入消毒器中进行消毒。在对超过 5 只动物进行手术时,请使用一套新的高压灭菌器械。当钻头变钝时,换上新的钻头,以避免组织创伤。
- 在开始之前,请确认该程序已获得当地动物福利机构指南的批准。
- 麻醉和手术准备
注意:手术和成像的麻醉设置是相同的。- 在麻醉室中使用异氟醚(3%-5%用于诱导)麻醉小鼠。在通过测试踏板退缩反射(双脚捏脚垫)确保足够的麻醉深度后,将动物转移到准备工作站。在鼻锥上维持麻醉 (1%-2%)。在这里,涂抹眼药膏以防止角膜损伤。通过检查爪子反射来定期控制手术过程中反射的丧失。
- 如果需要对动物进行任何识别,请使用打耳工具或剪刀在耳朵上做标记,或使用记号笔在尾巴上做标记。
- 用脱毛膏去除覆盖耳朵和眼睛之间头骨的皮毛。将面霜放置在制造商指示的时间内(30-60 秒),以避免刺激皮肤。确保乳霜与发根接触,方法是逆着头发生长的方向涂抹。避免脱毛霜与眼睛接触。用生理盐水清洁该区域,去除任何乳霜和头发残留物。或者,使用理发器。
- 为避免任何术中和术后疼痛、感染或肿胀,请使用非甾体抗炎药 (NSAID)、阿片类药物、抗炎药和抗生素。术前给予卡洛芬(5-20 mg/kg,皮下 [SQ])、丁丙诺啡缓释剂(1 mg/kg SQ)、头孢唑林(20 mg/kg SQ)和地塞米松(0.2 mg/kg SQ)。给予约 0.3 mL 0.9% 生理盐水 SQ 以避免脱水。
- 之后,从颅骨中部到外围,交替擦拭聚维酮碘和异丙醇三次,擦洗该区域。
- 开颅手术
- 将动物转移到手术台上,并将其腹侧卧放在加热垫(~37°C)上,以确保手术过程中的等温条件。啮齿动物体温过低会显着降低存活率并延长术后恢复阶段。
- 通过定位耳杆和门牙杆,将头部置于立体定向框架中。对于耳杆,找到颧弓并将耳杆插入耳弓后面。首先用惯用手固定对侧杠铃(例如,如果您是右撇子,则用右手固定左杠铃),然后固定另一侧。如果需要,通过转动螺钉来调整耳和门牙的位置。
- 如有必要,重新涂抹眼药膏,并用一块铝箔覆盖眼睛。这将防止明亮的显微镜光和紫外线在以后固化氰基丙烯酸酯胶水时造成的任何损坏(步骤2.5)。
- 切口前,再次检查脚趾捏反射;如有必要,相应地调整麻醉。通过将传感器放置在后爪上,将动物连接到麻醉监测设备。测量心率和血氧浓度将有助于降低死亡率并改善术后恢复。此外,通过目视检查胸部运动来获取呼吸频率。
- 用窗帘盖住动物的身体,以避免体温过低和污染。在开始手术之前进行最后一次聚维酮碘拭子。
- 戴上手套和干净的实验室外套。
注意:由于手术的侵入性,鼓励使用无菌手套,并降低任何术后感染和炎症的风险,从而导致 2P-IVM 发病率和图像质量下降(第 5 节)。 - 抬起颅骨上的皮肤,将剪刀放在右眼和耳朵之间,沿着切口痕迹向颅骨左侧切割,形成切口。取下产生的圆形皮瓣。
注意:根据大脑中感兴趣的区域和窗口大小,切口部位和直径可能会有所不同。切口的尺寸需要大于头部的直径,以适应安装空间(步骤2.5)。如果需要,可以轻轻解剖切口周围的皮肤以创造更多空间。 - 用手术刀刀片或微卷曲器轻轻刮擦颅骨表面,取出骨膜。移除颅缝周围的骨膜时要小心,因为这些区域很脆弱,更容易出血。使用生理盐水和真空吸尘器保持手术区域清洁,没有碎屑。划伤骨膜以确保更好地粘附在氰基丙烯酸酯胶水和牙科粘接剂上(步骤2.5)
- 确定进行细胞注射的大脑区域。为此,请使用小鼠大脑立体定向坐标图谱。根据大脑坐标,使用与窗口直径相同的活检打孔器、手术笔或高压灭菌铅笔标记颅窗的位置。
- 用惯用手握住钻头,用非惯用手握住任何其他器械(注射器、镊子)。避免在同一地点长时间钻孔。钻头应连续使用,以免过热。在这些休息期间,将冷盐水涂抹在颅骨上,以保持手术视野清洁并防止过热。使用钻尖的感觉反馈来检测颅骨何时完全穿孔。
- 使用冷盐水和真空吸尘器清洁颅骨表面。打开颅骨后,请勿使用纱布或棉尖涂抹器,因为棉线的残留物可能会在密封脑窗时导致异物反应。
- 钻孔时,确保轨迹和直径与玻璃盖玻片的尺寸相同。为此,将玻璃盖玻片放置在颅骨顶部,并确认玻璃盖玻片正好适合颅窗内。
- 一旦可以通过轻轻按压颅骨瓣来压下颅骨皮瓣,使用镊子小心地从手术区域取出碎片(图1B,左)。如果还不能压下颅骨,请继续在颅窗仍与颅骨其余部分相连的区域钻孔并重新评估。
- 如果发生轻微出血,请使用止血海绵联合轻压或冰冷盐水,以帮助减少失血。
- 细胞植入
- 如(步骤1.7)所述准备并计数要植入的细胞。确保细胞数为 200,000 个细胞/μL。
注意:建议将细胞悬浮在室温下凝固的膜基质中。这将提高植入脑实质细胞的成功率。 - 将装有冰块的容器中的细胞转移到手术室。使用气密微升注射器。抽吸前,将注射器放在冰上以避免温差。
- 吸出 1 μL 后,将注射器放置在立体定向框架内。
注意: 可以使用自动立体定向坐标设备显示 X、Y 和 Z 轴中的位置以节省时间。也可以根据 lambda 手动计算仓位。不建议注射超过 1.5 μL。这将确保注射区域不会过度填充,导致植入不成功、脑实质外生长或转移。 - 在大脑的 V2MM 区域(视觉皮层 2,内侧部分)进行植入,该区域对应于大约内侧到外侧 (M-L):-1.2 至 -1.6 毫米,背侧到腹侧 (D-V):-2.6 至 -3.5 毫米坐标。
- 对于双光子成像(步骤4.6),将细胞植入大脑浅表区域,以便以后可以通过颅窗观察肿瘤肿块。在前后 (A-P) 进样 0.5 μL(100,000 个细胞):0.8 mm 深度。进入大脑时,以逐步方式缓慢移动针头,并在注射后等待30秒(图1B,中列)。
- 在缩回针头并离开脑组织时使用相同的方法。避免在心室附近注射,因为脑脊液可能会促进中枢和周围神经系统的转移。
- 如(步骤1.7)所述准备并计数要植入的细胞。确保细胞数为 200,000 个细胞/μL。
- 颅窗闭合
- 将头杆和玻璃盖玻片从酒精移至盐水溶液中。使用真空吸头或镊子将这些组件导航到手术部位。
- 将玻璃盖玻片放置在颅窗内,并在颅骨和玻璃盖玻片之间放置少量氰基丙烯酸酯胶。UV活化氰基丙烯酸酯胶水可缩短固化时间,避免意外位移。如果有任何胶水溅到玻璃盖玻片上,请用棉尖涂抹器将其去除,或在完全固化之前用手术刀的钝面轻轻刮掉。
注意:紫外线对眼睛和皮肤有害。固化胶水时避免眼睛和皮肤接触。 - 将玻璃盖玻片固定在颅窗中后,应用头杆。混合双组分牙科骨水泥,定位头杆,并将骨水泥涂抹在周围区域,确保头骨和头杆之间的接触。用注射器、手术刀或钻头的尖端仔细清洁任何多余的水泥。
注意: 牙科水泥固化得非常快,因此建议及时涂抹。 - 密封颅窗后,确定牙水泥和皮肤之间的颅骨区域是否仍然暴露在外。如果是这种情况,请涂上手术胶水,通过闭合皮肤来掩盖颅骨。或者,使用可吸收的缝合材料进行单次缝合。
3.术后恢复和肿瘤生长
- 恢复
- 在恢复笼中的加热垫上监测动物,直到它恢复完全意识。手术后将动物分开饲养,以降低受伤风险。
- 进行恢复饮食,例如含有电解质或糖的市售水凝胶。或者,提供湿润的标准实验室食物,以确保易于营养并避免脱水和低血糖。
- 监测
- 恢复后,每天监测动物是否有疼痛、痛苦或感染的迹象。必要时,给予镇痛药、消炎药或抗生素。如果动物达到研究终点,请人道地对其进行安乐死。在最后一次成像后,通过二氧化碳窒息对小鼠实施安乐死,然后进行颈椎脱位。
注意:早期安乐死标准的例子包括但不限于体重显着减轻 (>20%)、神经系统疾病、呼吸困难、手术期间出血过多或明显的刻板行为。检查颅窗,必要时用生理盐水或酒精清洁。 - 为了跟踪肿瘤生长并计划成像时间点,请进行全身生物发光成像 (BLI)。为此,腹膜内注射150mg / kg D-荧光素,并在5-15分钟后对动物进行成像。
- 恢复后,每天监测动物是否有疼痛、痛苦或感染的迹象。必要时,给予镇痛药、消炎药或抗生素。如果动物达到研究终点,请人道地对其进行安乐死。在最后一次成像后,通过二氧化碳窒息对小鼠实施安乐死,然后进行颈椎脱位。
4. 纳米颗粒合成
- 颗粒制备
- 将 11.17 mL Ferumoxytol(共 6 mmol Fe)加入含有 50 mL 5 M NaOH、20 mL 去离子水(去离子水)和 20 mL 环氧氯丙烷的溶液中。在此阶段观察相偏析。将混合物在室温下轻轻振动孵育24小时。
- 24小时后,溶液变得均匀。使用透析管(12,000-14,000 Da 临界值)对水去除多余的环氧氯丙烷 3 天。
- 透析后,将管中剩余的溶液转移到玻璃瓶中(总体积~110mL)。加入30mL氢氧化氨,并在37°C下搅拌混合物18-20小时。
- 搅拌后,用水重复透析 3 天。将透析管中剩余的溶液转移到总体积~110mL的新玻璃瓶中。
- 异硫氰酸荧光素 (FITC) 偶联
- 取出 27.5 mL 胺官能团化颗粒进行 FITC 偶联。使用10kDa超速离心过滤器浓缩颗粒,并在25°C下用pH 9(Na2CO3 / NaHCO3)缓冲液在5752× g 下洗涤10分钟。
- 将4mL溶液加入过滤器中,并在25°C下以5752× g 超速离心管10分钟。丢弃滤液并用缓冲液重新填充过滤器,以相同的方案进行第二轮洗涤。
- 弃去滤液,用移液管将溶液收集在过滤器中。假设每个颗粒的直径为 5 nm,假设每个颗粒的直径为 5 nm,用 Ferumoxytol 的质量浓度估计颗粒的摩尔浓度。
- 将 FITC 溶解在无水二甲基亚砜 (DMSO) 中以 10 mg/mL 溶解。缓慢加入 1.4 mL DMSO 溶解的 FITC 到浓缩胺官能团化颗粒中。FITC的摩尔比:颗粒为20:1。之后,将溶液在4°C下在黑暗中孵育8小时。
- 通过加入过量的NH3来淬灭反应。H2O(NH3.H2O为50 mM),然后让溶液在黑暗中保持在4°C2小时。使用Na2CO3 / NaHCO3 (pH 9)缓冲液在25°C下通过5752× g 的10kDa过滤器洗去多余的FITC 10分钟。使用HCl水溶液将溶液的最终pH值调节至7.4。
5. 2P-IVM型
注意:对于2P-IVM会话,使用了带有定制载物台(图2 和 补充编码文件1)的Prairie Ultima IV显微镜,该显微镜允许水平和垂直调整颅窗的位置。斐济软件用于后处理和图像分析。这样,可以调整激光束以90°角撞击玻璃,从而减少伪影并提高成像质量。
- 成像会话
- 打开 Ti-Sapphire 激光器。打开主系统开关和 Prairie View 软件。
- 如上所述麻醉动物(步骤2.2)。每只动物进行长达 2 小时的成像会议。将成像时间保持在最低限度,以降低麻醉并发症和相关发病率或死亡率的风险。
- 使用定制载物台将小鼠固定在双光子显微镜下(图1B,右列)。将动物俯卧放在专为啮齿动物手术设计的加热垫上,并用胶带轻轻固定,同时注意不要收缩胸部。将一滴水滴在颅窗上并调整焦点。
- 获取心率和血氧以监测动物的生命参数。将传感器放在后爪上,并将监控设备保持在双光子成像室外。
- 一旦动物进入显微镜载物台,调整头部位置。使用双筒望远镜和宽视场荧光照明,设置红色荧光蛋白(RFP)滤光片并找到所需的成像视野(图1B,右列)。
- 确定样品方向和视场后,将显微镜从宽场模式切换到光扫描显微镜模式(LSM)。
- 确保 Ti-Sapphire 激光器在 920 nm 处锁定模式,并且所有快门都打开。将 GaAsP 光电倍增管探测器 (PMT) 电压提高到 500-600 V,使用两个带有带通为 595/50 (RFP) 和 525/50 的滤波器组的 PMT。
- 按 实时图像 并缓慢修改 pockel 细胞以增加样品处的激光功率,直到图像可见。
- 获得清晰图像后,使用软件和电动载物台将图像堆栈的顶部和底部设置在所需的样品区域内。注意步长,并考虑到 Z 轴会调整镜头的深度。
- 随着深度的增加,图像会变得更暗。缓慢增加 pockels/PMT 增益以保持图像明亮。注意不要使用过多的功率,因为它会导致光毒性和组织损伤。
- 设置保存路径并启动 Z 系列。它将使用设置的 pockel/PMT 设置自动遍历到起始和结束位置。堆栈完成后,使用回放查看堆栈的质量。完成采集必要图像后,关闭 Ti-Sapphire 激光器。
- 如上所述,将动物移至恢复笼中(步骤3.1)。
- 退出 Prairie 视图并确保保存/传输所有数据。关闭计算机并关闭所有硬件。
- 斐济的后处理
注:Fiji 是一个专注于生物图像分析的开源软件21.- 下载FIJI的操作系统。解压缩文件夹内容并运行.exe文件。
- 将从双光子成像收集的 .env 文件拖到对话框中。将通道拆分为不同的图像框。这将创建两个具有不同通道的不同图像,一个包含细胞信号,另一个包含粒子信号。
- 复制其中一个图像,然后单击 “文件”>“新建>内部剪贴板 ”以创建另一个图像。将其中一个图像重命名为 “源 ”,将另一个图像重命名为 “复制”。
- 使用复制图像,然后单击对话框中的 “处理”>“增强 对比度”。单击 “规范化 并 确定 ”,然后单击 “平滑处理>”。此图像用于创建掩码,而不是用于分析。单击对话框中的图像 >调整>阈值 。使用适合提取的滑动比例和方法,然后单击 应用。
- 使用 “处理”>“二进制>侵蚀 ”侵蚀背景中的单个像素,然后单击“ 处理”>“二进制>”扩张 “以将后像素添加到图像中。
- 单击对话框中的 “处理>图像计算器 ”,选择源图像作为第一个图像,然后选择第二个图像作为 “复制”。使用 AND 创建两个图像的交集。对其他通道映像重复相同的步骤。
- 对于血管区域外的信号分析,请打开未更改的复制图像,并使用 手绘 ROI 工具删除信号的血管区域。
- 通过转到 “分析”>“设置测量值”来设置所需的参数。确保选中 “面积”、“积分密度”和 “平均灰度值 ”。
- 现在通过 “分析”>“测量”进行分析。将弹出一个包含测量值的窗口。将数据复制到电子表格中。
- 现在选择图像中没有荧光的一小块区域。这将是背景。
- 单击该区域的 分析>测量 。将数据复制到电子表格中。
- 将生成的图像另存为 文件>另存为 > 分析文件类型以进行重新测量或发布。
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Representative Results
在这里,我们进行了颅窗手术,并将C6细胞移植到GBM的NSG小鼠模型中(n = 5)。在创建窗口(图1A)的所有组件之间建立适当的密封将确保窗口的长期成像的耐用性,并进一步降低发病率。使用适用于 体内 2P-IVM的载物台(图2),我们可以在麻醉下对动物进行长达2小时的成像,而不会出现任何重大运动伪影。在携带GBM的小鼠中静脉内施用纳米颗粒约10分钟后,2P-IVM显示肿瘤区域血管的绿色荧光信号,与FITC标记的纳米颗粒的血管内定位一致。在血管外仅观察到少量绿色荧光信号,表明NP开始外渗(图3A)。观察到来自血管外空间的 FITC 信号增加,这与晚期外渗一致(图 3B)。
图 1.颅窗放置、开颅手术、植入和影像学检查。 (A) 颅窗解剖位置的横截面。由于头杆不含金属,因此除了双光子活体显微镜外,还可以进行磁共振成像或磁粒子成像。(B) 开颅手术(左)、细胞植入(中)和 2 光子活体显微镜(右)的概述(上行)和详细视图(下行)。打开颅骨后,会出现浅表出血(左图),并迅速被重新吸收(中图)。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2.舞台的计算机辅助设计(CAD)。 用于 体内 2 光子活体显微镜的载物台的 CAD,包括咬杆、头杆稳定以及用于高度和角度调整的螺钉。3D CAD 文件可以在 补充编码文件 1 中找到。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3. 体内 2 光子活体显微镜图像。 静脉注射纳米颗粒给药后 (A) 10 分钟和 (B) 24 小时获得的图像。当GBM细胞在红色光谱中发出荧光信号(左)时,脑组织中的纳米颗粒以绿色(右)显示。 # 表示外渗的 NP, * 表示血管。只有有限数量的颗粒经历了外渗,并且在NP给药后10分钟在肿瘤细胞附近可见。在 GBM 细胞区域可见大量颗粒,表明 NP 给药后 24 小时外渗。纳米颗粒由异硫氰酸荧光素(FITC)和氧化铁纳米颗粒(Ferumoxytol)组成。比例尺表示 100 μm。缩写:2P-IVM:2光子活体显微镜,RFP:红色荧光蛋白,GBM:胶质母细胞瘤,FITC:异硫氰酸荧光素,NP:纳米颗粒。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充编码文件1:舞台的3D CAD文件。请点击此处下载此文件。
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Discussion
我们提出了一种使用 2P-IVM 通过颅窗进行实时 体内 NP 跟踪的方法,以评估荧光标记的氧化铁 NP 的肿瘤递送。该手术的手术技术需要稳定的手和先进的实验手术技能。建议在继续体验活体动物之前练习使用尸体或幻影。作为替代方案,Hoeferlin等人实施了机器人钻头,以减少热损伤,最大限度地减少手术技术的可变性,并使手术标准化22。
窗口的大小表示另一个关键参数。更大的窗口将能够使用 2P-IVM 对肿瘤的更大部分进行成像。在文献中,已经描述了 3-7 毫米之间的尺寸23.然而,较大的窗户无法容纳大脑曲率,这可能导致区域压力增加24.为了克服这种限制,可以使用所谓的“玻璃头骨”来代替25。与传统的玻璃窗相比,这种方法使用弯曲玻璃,适应大脑曲率,从而允许创建更大的窗户,同时减少皮层的焦点压力。这种类型的曲面玻璃没有市售,它在2P-IVM中的应用有限,因为曲面会导致反射伪影,限制了可以成像的窗口面积。另一种选择是硅基窗口24。一方面,此方法在要创建的窗口的大小和形式方面提供了更大的灵活性。此外,据报道,在窗户故障和炎症率方面的结果与经典玻璃窗相当。另一方面,聚合物窗口的 2 光子成像质量已被证明比玻璃窗口下降得更快,因此对于长期应用来说不可行26。变薄的颅骨窗代表了另一种选择。虽然比经典玻璃窗的侵入性更小,但它不允许使用与此处描述的相同技术进行GBM细胞植入。此外,很难实现一致的头骨厚度,因此,这可能会导致 2P-IVM27 出现明显的伪影。
在规划研究时间表时,植入的细胞系和GBM细胞的数量是其他重要的考虑因素。C6大鼠神经胶质瘤细胞系是GBM研究中应用最广泛的细胞系之一。在大鼠和小鼠中,据报道颅内植入的细胞数量在 5 x 104 和 5 x 106 之间 27,28,29,30,31。一般来说,当植入更多数量的细胞时,预计肿瘤生长会更快。在该方案中,植入 1 x 105 个细胞,并在植入后第 11 天和第 12 天进行成像。Xin 等人在 BALB/c 裸鼠中植入了 1 x 105 个 C6 细胞,并报告了植入后第 7 天在 MRI 中检测到晚期 GBM,并在 15 天后增加了死亡率30。相比之下,Jia 等人使用更多数量的细胞 (1 x 106) 和相同的小鼠品系,并在 MRI 中在第 7 天检测到一个小肿瘤肿块,血脑屏障 (BBB) 轻微破坏,如 GBM 组织中的淡埃文斯蓝染色剂所示 32。在第 14 天,Evans 蓝染色比第 7 天更强,表明 BBB 受到高度破坏。反过来,肿瘤的生长也会影响动物在实验中可以保存多长时间。这是纵向成像研究对动物福利的重要考虑因素。据报道,慢性颅窗适合在植入后长达 6 个月进行成像26。
该协议中使用的纳米颗粒由氧化铁和荧光团组分组成。可能的应用包括研究新型治疗药物、细胞疗法的肿瘤递送以及对肿瘤脉管系统和肿瘤微环境的干预。可以在细胞和分子水平上评估不同的候选药物和联合疗法。NP 的氧化铁成分允许使用 MRI 或磁粉成像进行多模态成像,以及 2P-IVM。虽然 MRI 代表了一种临床相关的成像方式,但其解剖分辨率不如活体显微镜33。
这种方法也有一定的局限性。根据小鼠脑图谱的大脑坐标是针对 C57BL/6J 小鼠标准化的,必须根据小鼠品系、性别和年龄进行调整。此外,使用双光子成像,只能访问大约 450 μm 的有限深度9。 因此,2P-IVM只能对肿瘤进行部分表征,并且可能会遗漏肿瘤特征的区域差异。此外,仅包括 NP 给药后的两个时间点。未来的研究,包括静脉给药后的更多时间点,将允许更详细地分析肿瘤微环境中NP的时空行为。
总之,我们在GBM小鼠模型中使用2P-IVM评估了荧光标记的氧化铁纳米颗粒的肿瘤递送。这种方法可以很容易地进行修改以适应各种研究领域,并且是神经科学领域 体内 脑成像的重要工具。
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Disclosures
作者声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
我们要感谢斯坦福大学Wu Tsai神经科学显微镜服务中心,斯坦福大学体内成像创新中心(SCi3) - 小动物成像中心,NIH S10共享仪器资助(S10RR026917-01,PI Michael Moseley博士)和斯坦福大学临床前成像设施为该项目提供设备和基础设施。这项工作得到了国家儿童健康与人类发展研究所的资助,资助编号为R01HD103638。我们要感谢斯坦福大学的Schnitzer集团;圣克鲁斯大学左实验室;以及波士顿大学波士顿光子中心神经血管成像实验室,就双光子成像和颅窗模型进行教育讨论。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium |
Invitrogen | 11965-092 | |
1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
Styrofoam box | N/A | N/A | |
Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
References
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina. J Vis Exp. 168, 61970 (2021).
- Zhang, K., et al. In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment. J Biol Chem. 295 (34), 12203 (2020).
- Jang, W. H., et al. Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice. Sci Rep. 8 (1), 14174 (2018).
- Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo. Biomed Res Int. 2015, 154272 (2015).
- Matsuura, R., et al. Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart. Sci Rep. 8 (1), 15991 (2018).
- Veres, T. Z., et al. Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy. Sci Rep. 7 (1), 694 (2017).
- Zong, W., et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).
- Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain. eNeuro. 17 (1), (2019).
- Birkner, A., Konnerth, A. Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator. Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).
- Busche, M. A. In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models. Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).
- Li, L., et al. A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models. Nat Commun. 5, 3276 (2014).
- Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).
- Ricard, C., et al. Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice. Sci Rep. 6, 26381 (2016).
- Soubéran, A., et al. Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice. J Neuroinflammation. 16 (1), 191 (2019).
- Zhang, W., et al. Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model. Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).
- Wartchow, K. M., et al. Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy. Cells. 10 (3), 556 (2021).
- Jiang, L. W., et al. Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy. J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).
- Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).
- Zhang, Y. S., et al. Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy. Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice. J Vis Exp. 189, 64188 (2022).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Sci Rep. 6, 27818 (2016).
- Kim, T. H., et al. Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex. Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).
- Kılıç, K., et al. Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice. Front Physiol. 11, 612678 (2021).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration. Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).
- Zhang, B., et al. LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma. Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).
- Xin, H., et al. Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation. Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).
- Valable, S., et al. In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma. Neuroimage. 40 (2), 972 (2008).
- Jia, Y., et al. Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles. ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).
- Asan, L., et al. Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy. Sci Rep. 11, 4234 (2021).