Summary
我们为青少年 C57BL/6 小鼠开发了一种加速社交失败压力模型，该模型对男性和女性都有效，并允许在离散的青春期进行暴露。暴露于这种模型会引起社会回避，但仅在被击败的雄性和雌性小鼠的子集中。
Abstract
青春期的社会逆境很普遍，会对心理健康轨迹产生负面影响。需要对青少年雄性和雌性啮齿动物的社会压力进行建模，以了解其对持续大脑发育和行为结果的影响。慢性社会失败应激范式 （CSDS） 已被广泛用于模拟成年 C57BL/6 雄性小鼠的社会压力，方法是利用成年雄性啮齿动物对入侵其领土的入侵者表现出的攻击行为。这种范式的一个优点是，它允许根据它们在最后一次失败后 24 小时的社会行为的个体差异，将被击败的小鼠分为有弹性的组和易感组。在青少年C57BL / 6小鼠中实施该模型一直具有挑战性，因为成年或青少年小鼠通常不会攻击早期的青春期雄性或雌性小鼠，并且因为青春期是生命的短暂时期，包括谨慎的脆弱性时间窗口。通过调整CSDS的加速版本以用于青少年雄性和雌性小鼠，克服了这一限制。这种为期 4 天的压力范式，每天进行 2 次物理攻击，使用 C57BL/6 雄性成年小鼠来激发 CD-1 小鼠的攻击性，使其很容易攻击雄性或雌性青少年小鼠。这种模型被称为青春期小鼠的加速社会失败压力（AcSD）。青少年暴露于AcSD在男性和女性24小时后都会诱导社交回避，但仅在被击败的小鼠子集中引起。尽管在有弹性的组和易受攻击的组之间的会话中，攻击数量是一致的，但仍会发生此漏洞。AcSD模型足够短，允许在青春期的离散时期进行暴露，允许根据社会回避行为的存在与否对小鼠进行隔离，并且是第一个可用于研究青少年C57BL / 6雌性小鼠社会失败压力的模型。
Introduction
慢性社会失败压力范式被广泛用于模拟成年产后日 （PND） >65 雄性啮齿动物的社会压力。这种范式是基于成年雄性啮齿动物在入侵者入侵其领土时的自然攻击行为。该模型用于多种啮齿动物物种，包括大鼠、仓鼠和小鼠 1,2,3,4,5,6,7,8,9，包括持续约 10 天的身体攻击和心理压力的组合，在此期间，入侵啮齿动物实验几分钟的身体攻击来自常驻啮齿动物。这两只啮齿动物留在居民的家中笼子里，由一个隔板隔开，允许感官接触，但不允许身体接触7.在小鼠实验中，最常用的常驻/侵略小鼠是退休的育种瑞士CD-1小鼠，它们对入侵小鼠表现出强大的领土行为6,7。对于入侵小鼠，最典型的品系是近交系C57BL / 6品系2,4,5。被打败的老鼠每天都会暴露在新的侵略者面前，以防止对侵略者产生习惯。对照小鼠每天饲养不同的同种小鼠。在最后一次失败会话后24小时，在社会互动测试（SIT）中测试实验小鼠，其中它们可以在没有（无目标）或存在新型CD-1小鼠（目标）的情况下探索开放领域。对照组小鼠在与目标的交互区花费更多时间，而不是在任务的非目标部分花费更多时间。根据社会互动比率（在侵略者在场的互动区花费的时间/在侵略者不存在的互动区花费的时间），被击败的小鼠被分类为易感（比率<1）或弹性（比率>1）。该程序提供了一个有用的工具来研究对压力反应的个体差异。
直到最近几年，慢性社会失败压力模型主要用于成年雄性小鼠，因为强调的雄性优势等级涉及与雄性战斗，而不是与雌性战斗 6,7。此外，雄性啮齿动物通常不会攻击雌性;相反，它们从事交配行为10.尽管存在这些障碍，但已经开发出不同的策略来适应成年雌性小鼠的慢性社会失败压力范式。例如，加利福尼亚老鼠的社会失败模型是基于这种一夫一妻制物种在保卫自己的领土时来自两性的自然侵略性 9,11。其他方法侧重于通过刺激其腹内侧下丘脑具有一致的攻击行为10,12 或在实验成年雌性小鼠中应用雄性尿液以接受 CD-1 侵略者的攻击13 来诱导 CD-1 小鼠的攻击行为。CD-1 小鼠的这种高度和一致的攻击性对于实验入侵小鼠在相互作用期间表现出对侵略者的反复攻击的明显从属行为迹象至关重要6.
调整慢性社会失败模型以用于青少年 C57BL/6 小鼠
青春期是一个以社会心理高度成熟为标志的时期，它与大脑微观和宏观结构的变化同时展开，尤其是前额叶皮层的变化。在人类和啮齿动物中，关于青春期的具体开始和结束几乎没有共识14,15。此外，在青春期存在关键的脆弱性窗口，即经验引起的对正在进行的大脑和认知发展的破坏16,17,18,19。青春期和青春期同时发生，但这些术语不是同义词。青春期标志着性成熟的开始，而青春期则代表着一个更广泛的阶段，其特征是从少年状态逐渐转变为实现独立20.不同的研究小组认为，小鼠的青春期从断奶（PND 21）到成年期（PND 60）21。特别是，青春期早期可称为断奶后第一周和第二周（PND 21-34），青春期中期称为PND 35-48期。这些范围包括离散的发育期，例如多巴胺系统的发育 22,23,24，对发育中的神经元网络的药物影响的脆弱性 17,25,26,27，以及不同的行为特征 16,20,28,29,30。
社交失败协议需要常驻老鼠的战斗行为。然而，与雌性小鼠一样，雄性小鼠通常不会与早期青春期小鼠进行攻击性互动，可能是因为它们不认为它们是威胁。大多数探索青少年C57BL / 6小鼠慢性社交失败影响的研究都是在青春期中期进行的31,32,33,34,35;其他人没有指定青少年暴露的产后日36,37，或将失败的日子延长到成年早期38 或不允许感官接触39;对青少年小鼠的其他研究使用不同的菌株40,41。表1总结了这些研究使用青春期雄性小鼠慢性社交失败压力的特征。
我们的研究小组对针对 C57BL/6 小鼠的特定青少年暴露窗口（包括青春期早期）感兴趣。由于不同青春期的持续时间较短，因此设计了慢性社会失败压力范式的加速版本的修改版本42。这种模型被称为青春期小鼠的加速社会失败压力（AcSD）。先前的研究表明，大鼠在青春期对社会压力的敏感性方面存在显着的性别差异 8,26,43,44,45，以及社会压力对人类心理健康轨迹的有害影响 46,47,48,49,50,51,52， 53,54,55,56.AcSD模型对青春期雌性小鼠也有效，使它们能够研究潜在的性别特异性后果，并探索神经生物学基础。
表1：在青春期雄性小鼠中使用社交失败压力范式的研究。 品系和物种：加利福尼亚小鼠： Peromyscus californicus。 C57BL/6： Mus musculus black 6 近交系小鼠品系。C57BL/6J：杰克逊实验室提供的M . musculus black 6近交小鼠模型。CD-1：来自瑞士近交白化小鼠品系的 肌肉分枝 杆菌。ICR： M. musculus 癌症研究所的白化小鼠品系优于近交系。OF1： M. musculus Oncins France 1 超过白化小鼠品系。
缩写：wk = 周;PND = 产后日;res = 弹性;SUS = 易感;UNSUS = 不易受影响。 请按此下载此表格。
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Protocol
实验程序按照加拿大动物护理委员会的指导方针进行，并得到麦吉尔大学和道格拉斯医院动物护理委员会的批准（动物实验批准号：2005-5084）。所有小鼠被饲养在温度和湿度控制（21-22°C;60%）的菌落室中，并在道格拉斯心理健康大学研究所的神经表型中心进行12小时的明暗循环（8：00小时开光）。在整个实验过程中，小鼠可以 随意 获取食物和水。小鼠被随机分配到每个实验条件。实验动物是从商业来源获得的（见 材料表）。 表2 总结了每个实验阶段的动物特征。总共在20个实验队列中使用了489只青少年C57BL / 6J小鼠（259只雄性;230只雌性）。
表2：每个实验阶段的动物受试者。 †如果这些动物没有受到严重伤害，它们可以重新用于启动。 ‡如果这些动物没有受到严重伤害，它们可以在AcSD期间重新用于启动， §道格拉斯心理健康大学研究所的神经表型中心。 ¶对于男性的实验， #对于女性的实验，如果失败是混合的，请使用女性进行启动。 ††不能用于 AcSD。缩写：AcSD = 加速的社会失败压力;PND = 产后日 请点击这里下载此表格。
1. 适应
注意：此阶段应至少持续 1 周。
- 购买年龄超过4个月的雄性CD-1退休种小鼠（见 材料表），其数量是青少年C57BL / 6J小鼠的两倍（即，如果10只小鼠将暴露于压力下，则购买20只CD-1小鼠）。
注意：建议获取此数量的CD-1小鼠，因为只有一小部分CD-1小鼠对青少年小鼠表现出攻击性行为。 - 让CD-1雄性小鼠在筛选和启动前1周内用食物和水 随意 适应家庭笼中的新设施。
- 在 PND >65（成人）和 PND 25 ± 3（青少年）（表 2）使用 C57BL/6 进行筛选和启动疗程。每天启动时获得每个年龄的4只C 57BL / 6小鼠（即，启动3天，获取12 PND >65和12 PND 25±3）以降低受伤的风险，因为这些动物将被重复用于筛选和启动过程。
2. CD-1 筛选和启动
注意：此阶段的持续时间为3天的筛选（雌性小鼠为1天）和3-4天的启动期（对于雌性小鼠，这可能会增加，并且取决于CD-1小鼠的攻击性行为。
- 使用攻击的操作定义来注册 CD-1 的攻击，如下所述。
- 一次攻击定义为 CD-1 小鼠咬伤 C57BL/6J 小鼠，而 C57BL/6J 小鼠响应咬伤而移开。咬伤定义为 CD-1 小鼠将其牙齿放在 C57BL/6J 小鼠身体的任何部位。移开定义为当 C57BL/6J 鼠标将其后爪从 CD-1 接合之前的位置移动时。
- 确保单独的攻击之间至少相差 ~2 秒。如果发生不止一次咬伤<间隔 2 秒，则计为一次攻击。
- 如果CD-1小鼠连续多次咬伤而没有中断（相隔<~2秒），则用塑料尺轻轻分开动物。如果CD-1小鼠咬人并且不放手，请轻轻地将动物分开。如果 C57BL/6J 鼠标被困在角落或被 CD-1 鼠标压住并且无法因咬伤而移开，请用尺子轻轻地将动物分开。将所有这些算作一次攻击（直至分离）。
- 筛分
- 使用丁腈检查手套处理所有动物，避免使用香水或香料。
- 仅在CD-1小鼠家庭笼中将成年C 57BL / 6雄性小鼠作为入侵者（PND >65）进行筛选的第一天 。在进行新的实验之前，始终筛选CD-1小鼠。
- 将成年雄性C57BL / 6小鼠PND >65引入CD-1雄性小鼠的家庭笼中3分钟。记录第一次攻击的延迟以及执行的攻击次数（请参阅 补充表 1）。
- 从筛选的第 2 天 到最后一天，引入成年男性 C57BL/6 PND>65 1 分钟（如果 CD-1 非常具有攻击性，则限制为 30 秒），然后将其与青少年 C57BL/6 PND 25 ± 3 交换 5 分钟。
注意：对青少年小鼠进行筛选很重要，因为并非所有攻击成年C57BL / 6雄性小鼠的小鼠都会攻击青少年C57BL / 6。事实上，攻击青春期小鼠的CD-1小鼠并不总是攻击成年C57BL / 6雄性。 - 如果实验是为了对雌性小鼠的攻击性，则对青春期雌性小鼠进行筛选和启动，即使实验小鼠包括两性。
- 记录所有C57BL / 6小鼠的第一次攻击的潜伏期，攻击次数和受到的伤口（参见 补充表2）。
- 记录任何类型的互动：追逐、安装行为、嗅探、梳理或咬人。如果 CD-1 不接近青少年 C57BL/6 小鼠，请注册;如果此行为重复 2 天，请不要在启动中包含 CD-1。
- 对于启动阶段，选择所有表现出追逐、安装行为、嗅探、跟随、梳理或咬青少年 C57BL/6 等行为的 CD-1 小鼠。
- 保留未选择的CD-1小鼠，并将它们用于社交互动测试（SIT）。
注意：领土行为随着时间的推移而增加;因此，在下一次实验中，未选择的CD-1小鼠可能会对青少年小鼠具有攻击性。
- 启动 CD-1 攻击性行为
- 将选择用于启动的CD-1小鼠饲养在其家庭笼中，直到启动的最后一天。
- 将成年雄性C57BL / 6J小鼠PND >65引入CD-1家庭笼中30秒，然后将其与青少年C 57BL / 6 PND 25±3小鼠交换5分钟。
- 记录第一次攻击的延迟、攻击次数和任何交互（请参阅 补充表 3）。
- 每天进行 2 次启动，持续 3-4 天，同时安排失败（上午 9：00 和下午 2：00）。
注意：并非所有的CD-1小鼠都会在第一天攻击青春期小鼠，特别是如果启动是针对雌性小鼠。启动的天数可以增加或减少，具体取决于CD-1小鼠表现出的攻击性行为。 - 为了减少启动天数，重复使用已经经历过雄性小鼠社会失败实验的CD-1小鼠。如果CD-1小鼠没有表现出增加的攻击性，则延长启动天数，直到达到标准。
- 如果CD-1小鼠表现出极端的攻击性行为（C57BL / 6小鼠表现出过度伤害），则减少启动天数，以防止在社交失败期间造成严重伤害。
- 对于实验的下一阶段，选择连续2天至少10次（雄性）或5次（雌性）攻击青少年小鼠的CD-1小鼠。
3. AcSD协议
注意：此阶段包括 3 天的习惯和 4 天的 AcSD 暴露。
- 习惯
- 设置社会失败的老鼠笼（图1A-F）。使用适当的丙烯酸玻璃隔板将大鼠笼分成2个隔室（图1B，D;参见材料表）。
- 在笼子的两侧添加硬木屑垫料，每侧添加一个棉方作为垫料（图1D）。确保电线顶部用活页夹固定（图 1E）。确保老鼠笼被盖子盖住，没有保护棉（图1F）。
- 将每个笼子的 CD-1 鼠标放在笼子的一侧。放置一个标签 在笼子的外面，以便于识别每只老鼠。
- 在AcSD协议开始前2或3天将选定的CD-1小鼠饲养在社交失败装置（图1F）中（以增强CD-1领土行为）。
- 在实验前 1 天进行启动疗程;这对于保持攻击性的一致性很重要。
- 击败会话
- 每天进行 2 个疗程（第一次疗程：上午 9 点，第二次疗程：下午 2 点），持续 4 天，共 8 个疗程。制定一个时间表，以确保攻击者在每次会话中都不同（见 补充表 4 和 补充表 5）。
- 称重C57BL / 6青少年小鼠，然后将其引入笼子的CD-1侧。将成年雄性 C57BL/6 小鼠 >65 引入失败笼的 CD-1 侧 30 秒，然后将其与青少年 C57BL/6 PND 24-28 小鼠交换，进行 10 分钟长的失败发作或每次最多 10 次攻击。
- 每次攻击后用塑料尺将动物分开。每次失败后，检查是否有受伤，并用止痛膏治疗。登记受伤人数。
- 将青少年 C57BL/6J 小鼠放在不熟悉的侵略者旁边的空闲隔间中，直到下一次治疗。每个会话对不同的侵略者重复该过程。
- 从上一次会话中未配对的实验小鼠和侵略小鼠开始会话。监测用于启动的成年C57BL / 6J雄性小鼠的损伤（参见 补充表6）。
- 请遵循以下关于动物福利和人道终点的建议。
- 遵循相应机构审查委员会的标准操作程序，以应对社会失败，并确保持续的兽医评估。
- 在整个研究过程中监测小鼠的健康状况，以避免动物的痛苦和死亡。
- 确认穿孔分隔器设置正确，以防止老鼠穿越到另一个隔间。
- 当动物有伤口时，通知兽医护理人员进行适当的监测，并每天涂抹止痛霜，直到伤口完全愈合。
- 如果损伤恶化（伤口增大），在下一次治疗中将攻击次数限制为 5 次，以便恢复。检查是否有严重伤害。严重伤害定义为总> 1 厘米的伤口。
- 立即移除并安乐死动物，使其体重比初始体重减轻15%-20%;运动活动减少/减少和仪容障碍;伤口>1厘米的小鼠;阴茎切断，或前肢肿胀的咬痕。
注意：初次安乐死是通过异氟烷/CO2 毒气室进行的，然后通过颈椎脱位进行二次安乐死。
- 对照小鼠
- 每天进行 2 个疗程（第一次疗程：上午 9 点，第二次疗程：下午 2 点），持续 4 天，共 8 个疗程。制定时间表以确保对照小鼠每次会话与不同的C57BL / 6J同种小鼠共享笼子（参见 补充表7 和 补充表8）。
注意：对照小鼠不会暴露于侵略者。为了在每次失败会话中模仿对新型CD-1小鼠的介绍，对照小鼠每次会话都与新的同性和同龄同种（非同窝）配对。 - 将与AcSD小鼠的房间分开的房间内，将对照小鼠安置在社会失败装置（图1）中。
- 每个笼子放置两个对照小鼠，笼子的每一侧一个。将老鼠饲养在笼子的另一侧或完全不同的笼子中，这样它们就不会识别气味。每个会话旋转对照鼠标。
- 每天进行 2 个疗程（第一次疗程：上午 9 点，第二次疗程：下午 2 点），持续 4 天，共 8 个疗程。制定时间表以确保对照小鼠每次会话与不同的C57BL / 6J同种小鼠共享笼子（参见 补充表7 和 补充表8）。
图 1：用于青少年小鼠加速社交失败应激 （AcSD） 的装置。 （A） 从左到右，成对的钢丝顶部，杆之间相距 0.6 厘米，透明穿孔聚碳酸酯分隔器，穿孔直径为 0.6 厘米，用于固定金属丝顶部的活页夹，带盖子的透明老鼠笼（不带棉保护层）。（B） 上：聚碳酸酯分隔器对成人慢性社交失败（左）和青少年（右）的AcSD的比较;向下：靠近青少年小鼠的聚碳酸酯分隔器。（C） 上图：成人（左）和青少年（右）慢性社交失败的钢丝顶部比较;下图：钢丝顶部的特写。（D-F）组装社会失败机器。 请点击这里查看此图的较大版本.
4.社交互动测试
- 按照 AcSD 执行 SIT，如前所述 57,58,59。
- 在 AcSD 最后一次会话后 24 小时执行 SIT。在上午 9 点至下午 4 点之间在红灯条件下（而不是在黄灯条件下）执行 SIT。
- 设置主广场和高架摄像机（见 材料表）。主竞技场分为3个区域：社交互动区（SIZ）、角落和中心;这些区域在竞技场上应用黑线标记（使用黑色永久性记号笔）。对每个区域使用以下维度和条件。
- 确保 SIZ 是围绕外壳的 14 cm x 9 cm 的平方区域。角落是墙角中与围护结构相对的小方形区域 （9 cm x 9 cm），代表离 SIZ 最远的点。中心是 SIZ 和角落之间的区域。
- 用清洁的氢过氧化物酶溶液清洁竞技场和外壳。
- 将每只动物的识别标签放在地板上进行分析。记录所有动物行为以供离线分析。
- 确定基线勘探的第一次会议
- 将一个空的金属丝网外壳靠在竞技场的一面墙上。将实验性（击败或对照）青少年C57BL / 6小鼠放在竞技场的中间。让它自由探索竞技场 2.5 分钟。取回鼠标。
- 用清洁的氢过氧化物酶溶液清洁竞技场和外壳。
- 第二节课：社交互动
- 将不熟悉的 CD-1 鼠标放入金属丝网外壳内。将存储模块放置在与上一个会话相同的位置。
- 将相同的青少年 C57BL/6 小鼠重新引入竞技场。让它自由探索竞技场 2.5 分钟。取回老鼠。
- 用清洁的氢过氧化物酶溶液清洁竞技场和外壳。
- 以平衡顺序对所有青少年C57BL / 6小鼠（应激和对照小鼠）重复该过程。
- 使用多个 CD-1 小鼠进行 SIT 以减少处理压力和偏差（例如，对于 30 只 C57BL/6 小鼠的队列，使用 4 只 CD-1 小鼠）。在青春期小鼠中平衡它们。
注意：该测试测量实验小鼠对社会目标的接近和/或回避行为，如 Krishnan5 和 Golden7 首次描述的那样。
- 分析
- 记录在两个测试会话期间在交互区域和角落花费的时间。
- 计算社交互动比率，即在 CD-1 侵略者在场的互动区花费的时间除以 CD-1 侵略者不在的互动区中花费的时间。
- 将比率< 1.00 的应激小鼠分类为易感小鼠，将比率≥ 1.00 的小鼠分类为弹性小鼠。
- 从所有分析中排除在第一次会话期间未探索竞技场的动物（即，在任何指定区域花费 0 秒），以控制运动活动的差异。
- 从所有分析中排除在 ≥4 次社会失败会话中接受 0 次攻击的所有动物，以防止非代表性弹性动物。
- 排除在互动区内至少停留61秒的小鼠（不易感），以确保高社交互动率反映对社交目标的实际兴趣。
- 排除具有异常交互比分数的小鼠。
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Representative Results
在青少年 C57BL/6 雄性小鼠 （PND 21） 中使用慢性社交失败应激模型共进行了四个不同的实验。然而，该模型在早期青春期 C57BL/6 小鼠中的使用存在重要局限性。
青少年 C57BL/6 小鼠所需的设备修改
第一个限制是用于社会失败装置的设备是为成年小鼠设计的。由于它们的大小，PND 21 的青少年 C57BL/6 小鼠能够穿过分隔器的穿孔到达侵略侧。这打断了感官接触的时期。此外，青春期的老鼠能够通过钢丝顶部的栏杆逃脱。因此，对设备进行了修改以防止小鼠逃跑（图1）。穿孔的直径从1.1 cm变为0.6 cm（图1B），钢丝顶部从棒材之间间隔1.1 cm的钢丝替换为间隔0.6 cm的钢丝顶部（图1C）。此外，顶部用夹子固定，老鼠笼子也用没有保护棉的塑料罩覆盖。木屑垫料也设置为青少年小鼠的适当水平（图1D-F）。
AcSD 模型需要启动成年雄性 CD-1 小鼠，以确保一致、积极的回合
第二个也是更重要的限制是CD-1小鼠对青少年小鼠的身体攻击缺乏一致性。在慢性社交失败期间，攻击性从10分钟的零攻击性攻击到由于青少年小鼠体积小而致命的一两次咬伤不等。然而，如果将CD-1小鼠用于多个实验，则攻击次数的一致性增加。
图 2B 显示了每个慢性社交失败实验队列（P0、A0、A1 和 A2）每天的攻击次数。发现日和队列之间存在交互作用（图2B，双向重复测量方差分析：F（27,234）= 3.83，p< 0.0001），日的主要效应（F（6.288,163.5）=6.2，p<0.0001）和队列的主要效应（F（3,26）= 3.8，p = 0.02）。 事后检验显示第 1、2、3 和 7 天各组间存在差异（Holm-Sidak 事后检验：第 1 天，P0 vs. A2，p = 0.02;A1 与 A2，p = 0.02;第 2 天，A1 与 A2，p = 0.04;日，3 A0 与 A1，p = 0.007;A1 与 A2，p = 0.04;第 7 天，A0 与 A1，p = 0.04）。实验 P0 和 A0 中的所有 CD-1 小鼠在过去 3 天内停止攻击。用于实验 P0 和 A0 的 CD-1 小鼠用于 A1，其中攻击具有一致性（图 2B），表明如果之前受到物理交互，CD-1 更容易受到攻击。
出于这个原因，如步骤2.1和2.2中所述，对CD-1小鼠对青少年小鼠的攻击性进行了专门筛选，并用成年C57BL / 6雄性启动对青少年C57BL / 6小鼠的攻击性。此外，AcSD 用于将年龄从 PND 21 增加到 PND 25，并且仍然针对青春期早期。
在AcSD会话期间，CD-1小鼠以更一致的模式增加了对青少年小鼠的攻击次数，如图2D所示。与慢性社会失败范式相比，会话和实验队列之间没有发现显着的交互作用（图2D，双向重复测量方差分析：F（35,483）= 1.33，p = 0.1），存在会话的主要效应（F（5.644,389.5）= 14.15，p<0.0001）和队列的主要效应（F（5,69）= 7.91，p<0.0001）; Holm-Sidak 事后检验未显示队列间的显着差异。比较队列间平均攻击次数的发现，这种效应主要由队列A7驱动，队列A7的攻击次数明显更高（数据未显示，单因素方差分析F（5,69）=7.911，p<0.0001; Holm-Sidak 事后检验：A3 与 A6，p = 0.04; A7 与 A5，p = 0.002;A7 与 A6，第 < 0.0001;A7 与 A8，p = 0.0001）。
在AcSD期间，青少年小鼠比暴露于慢性社会挫败协议的青少年小鼠接受更多的启动CD-1小鼠攻击（图2E，具有Welch校正的未配对t检验， t = 15.40，df = 17.87，p < 0.0001）使用幼稚 （未启动）CD-1小鼠。在慢性社会失败协议期间，攻击并不一致，事实上，几只实验小鼠根本没有受到攻击。
图 2：慢性社交失败压力和 AcSD 之间每天的攻击次数比较。 （A） 慢性社交失败压力模型的时间线。（B） 青少年 C57BL/6 雄性小鼠慢性社交失败应激期间每个实验队列（P0、P1、A1 和 A2）每天的攻击次数（双向重复测量方差分析）。（C） 加速社会失败压力 （AcSD） 模型的时间线。（D） 青少年 C57BL/6 雄性小鼠在 AcSD 期间每个实验队列 （A3-A8） 每天的攻击次数（双向重复测量方差分析）。（E） AcSD的平均攻击次数显著更高（Welch校正的未配对t检验，****p < 0.0001）。所有数据均显示为SEM±平均值。 缩写：CSDS = 慢性社会失败压力;SIT = 社交互动测试;PND = 产后日;P0、A0-A8 = 每个实验队列的标签。 请点击这里查看此图的较大版本.
AcSD 会话期间的攻击模式不会影响 24 小时后的社会表型
在社会失败压力暴露后，大多数青少年雄性小鼠在SIT中测试时没有表现出社会回避（图3B，慢性社会失败：单因素方差分析F（2,43）= 14.57，p < 0.0001。 F，AcSD：Kruskal-Wallis检验，H（2）=72.35，p <0.0001）。对于两种模型，社交回避型和非社交回避型失败小鼠之间的攻击次数没有显着差异（图3D，慢性社交失败：双向重复测量方差分析，F（9,252）= 4.07，p = 0.21。 H.AcSD：双向重复测量方差分析，F（7， 511） = 1.32，p = 0.24）。然而，慢性社会失败后有弹性的小鼠比例高于AcSD暴露后的比例（图3C，G，70%对55.26%，二项式检验（单尾），p = 0.0047）。
图 3：慢性社交失败压力和 AcSD 范式后的社会互动测试 （SIT） 分数比较。 （A） 慢性社会失败压力模型的时间线。（B） 青春期慢性社会挫败压力后SIT评分的分布（单因素方差分析）。（C） 青春期慢性社会挫败压力后复原力/易感性的比例。（D） 在慢性社会挫败应激期间按表型划分的攻击次数，弹性和易感性之间没有发现显着差异（双向重复测量方差分析）。（E） 加速社会失败压力 （AcSD） 模型的时间线。（F） 青春期 AcSD 后 SIT 评分的分布 （Kruskal-Wallis）。这一数字是从57修改而来的。（G） 青春期 AcSD 后有弹性/易感的比例。这一数字是从57修改而来的。（H） 在AcSD期间按表型划分的攻击次数;弹性和易感之间没有区别（双向重复测量方差分析）。这一数字是从59修改而来的。**P < 0.001，****P < 0.0001。所有数据均显示为SEM±平均值。 缩写：PND = 产后日;Con = 控制;Res = 弹性;Sus = 易感。 请点击这里查看此图的较大版本.
AcSD 可用于青少年 C57BL/6 雌性小鼠
由于PND 25 C57BL / 6雄性和雌性小鼠尚未达到生殖成熟，因此启动的CD-1小鼠可以对青春期雌性小鼠进行攻击，就像它们对青春期雄性小鼠所做的那样。然而，启动阶段必须延长，以达到一致的攻击次数（图4A）。如图4B所示，在实验中，日间和队列之间没有发现交互作用（图4B，双向重复测量方差分析：F（35,707）= 1.38，p = 0.07），存在会话的主要效应（F（6.286,634.9）=16.1，p<0.0001）和队列的主效应（F（5,101）= 11.34，p<0.0001 ; Holm-Sidak 事后测试：第 2 节 C4 vs C8，p = 0.03; 第 6 节 C7 与 C4，p = 0.02;C7 与 C5，p = 0.02;第 7 节 C8 与 C3，p = 0.02;C8 与 C4，p = 0.045）。暴露于AcSD的大多数青少年C57BL / 6雌性小鼠对社交回避具有抵抗力（图4C，Brown-Forsythe方差分析：F（2,113.4）= 27.2，p<0.0001 ），与青春期雄性小鼠相似。弹性小鼠和易感小鼠之间的攻击次数没有显着差异（图4E，双向重复测量方差分析，会话x表型交互：F（7,714）= 0.73，p = 0.64，会话 F的主要效应（6.375,650.3）= 7.02，p<0.0001， 表型F（1,102）= 0.4，p = 0.53）。
图 4：青春期雌性小鼠的 AcSD 。 （A） 实验时间线。（B） AcSD 期间实验每天的攻击次数（双向重复测量方差分析）。（C） 雌性小鼠青春期 AcSD 后 SIT 评分的分布（Brown-Forsythe 方差分析）。（D） 青春期 AcSD 后有弹性/易感性的比例（右）。（E） 在AcSD期间按表型分列的攻击次数;在有弹性的小鼠和易感小鼠之间没有发现显着差异（双向重复测量方差分析）。所有数据均显示为SEM±平均值（C-E） 这些数字已从59修改而来。缩写：SIT=社会互动测试;PND = 产后日;C3-C8 = 每个实验队列的标签;Con = 控制;Res = 弹性;Sus = 易感。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充表 1：成人筛查第 1 天的评分表模板。 缩写：CD-1 = 筛选的 CD-1 小鼠的 ID，Exp = 实验 ID，3 分钟 = C57BL/6 成年小鼠的筛选持续时间，BL6 ID = 用于筛选的 C57BL/6 成年小鼠的 ID，Lat 1 ADULTS = CD-1 对 C57BL/6 成年小鼠的第一次攻击的潜伏期，# 攻击 = CD-1 进行的攻击次数。 请按此下载此表格。
附表2： 用于成人和青少年筛查的评分表模板。缩写：Exp = 实验 ID，1 分钟 = C57BL/6 成年小鼠的筛选会话持续时间，BL6 ID = 用于筛选的 C57BL/6 成年小鼠的 ID，Lat 1 ADULTS = 从 CD-1 对 C57BL/6 成年小鼠的第一次攻击的潜伏期，# 攻击 = CD-1 执行的攻击次数，5 分钟 = C57BL/6 青春期小鼠的筛选会话持续时间， BL6 Ad = 用于筛选的 C57BL/6 青少年小鼠的 ID，Lat 1 青少年 = CD-1 对 C57BL/6 青少年小鼠的第一次攻击的潜伏期，CD-1 = 筛选的 CD-1 小鼠的 ID。 请按此下载此表格。
附表3： 启动阶段的评分表模板。缩写：CD-1 = 用于启动的 CD-1 小鼠的 ID，Exp = 实验 ID，30 秒 = C57BL/6 成年小鼠的启动会话持续时间，BL6 ID = 用于启动的 C57BL/6 成年小鼠的 ID，Lat 1 ADULTS = 从 CD-1 对 C57BL/6 成年小鼠的第一次攻击的潜伏期，# 攻击 = CD-1 执行的攻击次数， 最小值：3 = C57BL/6 青少年小鼠启动会话的持续时间，BL6 Ad = 用于启动的 C57BL/6 青少年小鼠的 ID，Lat 1 青少年 = CD-1 对 C57BL/6 青少年小鼠的第一次攻击的延迟，# 安装次数 = C57BL/6 青少年小鼠接收的安装次数。 请按此下载此表格。
补充表4： 社会失败计划评分表模板（20 只青春期小鼠）。缩写：CD1 = CD-1 小鼠的 ID，E = 实验，H = 湿度，1 st = 第 1 节，第 2次 = 第 2 节，BL6 成虫 = 用于启动的 C57BL/6 只成年小鼠的 ID，体重 = C57BL/6 只青少年小鼠的体重，# 攻击 = CD-1 进行的攻击次数，# 伤口 = C57BL/6 只青少年小鼠接受的伤口数。 请按此下载此表格。
补充表5： 社会失败计划示例。 请按此下载此表格。
附表6： 成年C57BL / 6雄性小鼠损伤监测模板。缩写：第 1 - # 伤口 = C57BL/6 成年小鼠在第 1 节中受到的伤口数，第 2 次 - # 伤口 = C57BL/6 成年小鼠在第 2 节中受到的伤口数，BL6 = 用于启动的 C57BL/6 成年小鼠的 ID。 请按此下载此表格。
附表7： 对照组调度模板（10只青少年小鼠）。争夺规则：不要重复相同的同种;老鼠不能在同一天重复盒子的同一侧;老鼠必须与来自不同笼子的老鼠争夺它们家的笼子;家庭笼子有编号;小鼠编号取决于家庭笼号;被击败的组和对照组从家庭笼子中随机带走。 请按此下载此表格。
附表8： 控制组计划示例。 请按此下载此表格。
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Discussion
CD-1小鼠中一致的攻击性行为
在筛选阶段，注意 CD-1 显示的所有行为（追逐、安装行为、嗅探、梳理或咬合）并在为 AcSD 选择 CD-1 小鼠时密切遵循这些记录非常重要。CD-1小鼠与青春期小鼠相互作用而不攻击青春期小鼠，可能会在启动过程中对青春期小鼠产生攻击性。相比之下，攻击成年小鼠但不接近青春期小鼠的CD-1小鼠可能不会对青春期小鼠产生攻击性。
CD-1启动阶段允许对青春期小鼠发展攻击性行为。因此，准确记录行为对于小鼠的选择至关重要。此外，在进行新实验之前，必须始终筛选CD-1小鼠，即使CD-1小鼠以前经历过失败。一些CD-1小鼠在家庭笼子中不受干扰的情况下可以停止攻击青少年小鼠，而其他小鼠则由于被隔离饲养而增加领地行为。
对于CD-1小鼠的启动，方案建议3天。如果使用幼稚的CD-1小鼠，如果CD-1小鼠不积极攻击青少年小鼠，则可以延长启动时间。对于经历过与青春期小鼠一起社交失败的CD-1小鼠，可以减少该启动阶段的持续时间。
筛选和启动阶段对于成功的 AcSD 会议至关重要。例如，经过适当启动的 CD-1 小鼠将比攻击性较弱的 CD-1 小鼠更快地攻击并达到 10 次攻击限制，从而允许短暂的失败事件。
在 AcSD 期间，当攻击非常剧烈时（即，CD-1 小鼠不会放开 C57BL/6J 小鼠），将动物分开至关重要;否则，青春期的老鼠会受伤，需要限制攻击。治疗损伤对于避免感染也非常重要;建议不要使用油性软膏治疗损伤，因为动物会舔掉软膏，在此过程中脱发并暴露伤口。
对用于青少年 C57BL/6 雄性和雌性小鼠的 AcSD 进行故障排除
慢性社会挫败应激模型在雄性和雌性C57BL/6小鼠的青春期早期使用都存在重要的局限性。在本节中，描述了为在青春期开发 AcSD 模型所做的修改。
设备：完整的设备清单列在 物料清单中。青春期早期的C57BL / 6青少年小鼠（PND 21-30）对于先前在实验室60中使用的描述的设备来说太小。亚克力玻璃隔板上的穿孔直径足够大，允许C57BL / 6小鼠从一个隔室穿越到侵略者所在的另一个隔间。为了防止这种情况，制作了具有小直径穿孔的亚克力玻璃隔板。此外，钢丝顶部需要用夹子固定，以防止老鼠从笼子中逃脱。所采用的盖板通常用于通风笼。在这种情况下，这些盖子在没有保护棉的情况下使用，以允许适当的通风并防止小鼠从笼子中逃脱。重要的是要考虑到使用的木屑垫料的数量应允许青春期小鼠接触到食物和放置在盖子上的饮水机。但是，大量的木屑会变湿。
CD-1小鼠的选择：在慢性模型中，在实验开始之前筛选CD-1小鼠的攻击性行为。筛选3天后选择CD-1小鼠，并评估其攻击性行为。筛选后，选择具有 30 秒以下攻击潜伏期且表现出持续攻击的动物进行下一阶段。然而，在慢性社会失败实验期间，CD-1小鼠在10天内没有保持一致的攻击次数（图2B）。因此，由于对入侵小鼠缺乏攻击性，必须将几只CD-1小鼠从实验中移除。事实上，虽然只有一小部分CD-1小鼠攻击入侵小鼠，但这些小鼠中的一些极具攻击性，有时会严重伤害雄性C57BL / 6 PND 21小鼠。因此，将CD-1小鼠的筛选方式改为选择针对青春期小鼠的攻击性小鼠，增强了身体攻击性。
身体攻击的持续性：持续的身体攻击导致快速而有力地击败入侵者6.为了标准化实验和实验者之间的程序，使用了攻击的操作定义57，允许对攻击性进行精确的定量测量。
启动攻击性：在慢性社会挫败实验期间，攻击次数变化很大，在实验的最后几天有所减少（图2B）。为了增加CD-1小鼠对青少年C57BL / 6雄性小鼠的攻击行为，无论引入其家庭笼子的小鼠如何，CD-1小鼠都被设置为积极攻击性。这种行为是通过在青春期小鼠之前引入成年C57BL / 6雄性小鼠1分钟来实现的，鼓励CD-1小鼠在取回成年小鼠后攻击青春期小鼠。
模型的持续时间：PND 21 的青少年 C57BL/6 小鼠非常小，CD-1 小鼠只需一次攻击即可严重伤害它们。因此，针对青春期早期并且仍然有反复的社会失败，选择了一种替代经典的 10 天慢性社会失败压力的模型。加速社交失败压力 （AcSD）42 包括每天两次身体攻击，一次在上午，一次在下午，总共 4 天（8 次）。AcSD模型允许青少年小鼠的年龄从PND 21增加到PND 25，仍然仅针对青春期早期。
青春期 AcSD 的局限性
AcSD 模型有一些局限性。与成人慢性社交失败模型相比，AcSD需要筛查两倍于青少年C57BL/6小鼠的CD-1小鼠数量。启动阶段的持续时间可以根据CD-1小鼠的攻击性行为而变化;因此，AcSD 时间表的规划应有预见性，并且需要考虑所有这些变量。由于大多数青少年小鼠在暴露于AcSD后会表现出对社会回避的抵抗力，因此为了获得具有代表性的易感小鼠数量，实验队列应包括至少20只雄性动物和30只雌性动物。
青少年小鼠的 AcSD 在实验队列中产生一致的结果
在暴露于慢性社会失败和AcSD协议的社会压力后，大多数青春期雄性小鼠表现出对社会回避的抵抗力。然而，对于慢性社会失败模型，不可能将CD-1攻击次数的可变性作为一个混杂变量。相反，对于AcSD实验，CD-1小鼠在每次失败会话之前都准备好了，以获得会话之间一致数量的攻击（图2D，E）。总体而言，所有暴露于AcSD的小鼠实验队列在各个疗程中都显示出相似的攻击数量（图2D）;然而，对于暴露于慢性社会失败模型的小鼠队列来说，情况并非如此（图2B）。
与其他物种和品系使用该模型的其他人相比，在成年 C57BL/6 雌性小鼠中使用慢性社会失败压力具有挑战性 9,13,45,61。对于青少年C57BL / 6雌性小鼠的AcSD实验，启动阶段延长，确保CD-1小鼠的攻击性行为（图4A）。然而，在女性实验队列的攻击数量上可以观察到差异（图4B）。尽管如此，在这些实验中，所有CD-1小鼠都表现出对雌性的攻击行为。为了增加攻击次数，雄性小鼠的启动可以延长至1分钟。与雄性小鼠一样，青少年C57BL / 6雌性小鼠对社会回避的抵抗力的比例高于表现出易感性的小鼠（图4C，D）。此外，有抵抗力的小鼠和易感小鼠之间的攻击次数没有差异（图4E），表明表型与攻击无关。AcSD可用于青少年C57BL / 6雌性小鼠，并且可以使用相同的CD-1小鼠同时在两性中进行实验。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由加拿大卫生研究院资助（CF资助号：MOP-74709;PJT 190045）、国家药物滥用研究所（CF 授权号：R01DA037911）、加拿大自然科学与工程研究委员会（CF 授权号：2982226）。Andrea Pantoja-Urban 得到了来自墨西哥的国家人文、科学和技术委员会/Consejo Nacional de Humanidades、Ciencias y Tecnologías （CONAHCYT） 和 FRQNT - 外国学生优异奖学金计划 （PBEEE） 的支持。塞缪尔·里彻（Samuel Richer）得到了麦吉尔大学神经科学综合项目的奖学金支持。插图是使用 BioRender.com 年的模板创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 adolescent mice | In house breeding | Mice were breeded at the Neurophenotyping Centre of the Douglas Mental Health University Institute. | |
| C57BL/6 adult mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 027 | Mice are ordered so as to arrive at PND>65 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages. |
| C57BL/6J adolescent mice | Jackson Labs | Strain Code: 000664; RRID:IMSR_JAX:000664 | Mice are ordered so as to arrive at PND 24 and are group housed (four mice per cage) in standard mice cages. |
| CD-1 mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 022 | Mice retired breeders more than three months of age and singled housed throughout. |
| Cleaning solution | Virox Animal Health | DIN 02537222 | Prevail: Accelerated Hydrogen Peroxide. Desinfectant cleaner and deodorizer. |
| Clear perforated acrylic glass divider | Manufactured by Douglas Hospital, custom order | 0.6 cm (w) × 45.7 cm (d) × 22.23 cm (h); perforations of 0.6 cm diameter. The dividers are perforated allowing sensory but no physical contact between the pair of mice. | |
| Clear rectangular rat cages | Allentown | 24 cm (w) × 48.3 cm (d) × 22.23 (h). | |
| Cotton squares for bedding | Inotiv Envigo | T.6060 iso-BLOX | 2.5 cm x 2.5 cm. Added to the social defeat apparatus. |
| Hard woodchip bedding | Inotiv Envigo | Teklad 7090, 7115 | Sani-chip bedding. |
| Large binder clips to secure the steel-wire tops | STAPLES | Item #: 132429, Model #: 24178-CA | 51 mm |
| Medium binder clips to secure the steel-wire tops | Item #: 132367, Model #: 24172-CA | 32 mm, in case the cover lids of the rat cages do not close with the large clips | |
| Pain relief cream | Polysporin | Plus Pain Relief Cream (red format, NOT ointment), 2 Antibiotics plus lidocaine hydrochloride | |
| Paired Steel-wire tops | 24 cm (w) × 48 cm (d) with 0.6 cm (w) of separation between the grill | ||
| Removable wire-mesh enclosure | Johnston industrial plastics | 11 cm (w) × 6.8 cm (d) × 42 cm (h) custom order; two per social interaction test arena secured in precut clear polycarbonate | |
| Social interaction open-field arena | PEXIGLAS | 45 cm (w) × 45 cm (d) × 49 cm (h), custom-crafted from opaque acrylic glass (Plexiglas) | |
| Stopwatch | For timing defeat sessions | ||
| Video camera with infrared lights | Swann | SRDVR-44580V | Swann Camera - 4 Channel 1080p Digital Video Recorder & 2 x PRO-T853 |
| Video tracking software | Topscan | 2.0 Clever Systems Inc. |
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